Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول طريقة إنشاء نموذج الفئران من التهاب الجيب. تم إنشاء نموذج الجيب اللفائفي عن طريق إجراء جراحة مفاغرة الجيب اللفائفي الشرجي (IPAA) باستخدام تقنيات الجراحة المجهرية. بعد الجراحة ، عولج الجرذ بنسبة 4٪ من كبريتات ديكستران الصوديوم (DSS) لمدة 4 أيام.

Abstract

التهاب القولون التقرحي (UC) هو مرض مزمن بوساطة المناعة يصيب القولون والمستقيم بالكامل مع مسار انتكاسي وتحويل ، مما يسبب مراضة مدى الحياة. عندما يكون العلاج الطبي غير فعال ، خاصة في حالات النزيف المعدي المعوي الحاد أو الانثقاب أو تضخم القولون السام أو التسرطن ، تصبح الجراحة خط الدفاع الأخير لعلاج جامعة كاليفورنيا. يوفر الاستئصال الكلي للقولون والمستقيم ومفاغرة الجيب اللفائفي الشرجي (IPAA) أفضل فرصة للعلاج على المدى الطويل. التهاب الجيب هو أكثر مضاعفات ما بعد الجراحة شيوعا ومزعجة. في هذا التحقيق ، يتم استخدام الجراحة المجهرية لإنشاء نموذج الجيب اللفائفي في الفئران التجريبية عن طريق جراحة IPAA. بعد ذلك ، يتم إنشاء نموذج فئران مستدام من التهاب الجيب عن طريق إحداث التهاب في الجيب اللفائفي مع كبريتات ديكستران الصوديوم (DSS). يتم التحقق من صحة التأسيس الناجح لالتهاب جيب الفئران من خلال تحليل الحالة العامة بعد الجراحة ، والوزن ، وتناول الطعام والماء ، وبيانات البراز ، بالإضافة إلى أمراض أنسجة الحقيبة ، والكيمياء المناعية ، وتحليل العوامل الالتهابية. يوفر هذا النموذج الحيواني التجريبي لالتهاب الجيب أساسا لدراسة التسبب في المرض وعلاج الحالة.

Introduction

التهاب الجيب هو التهاب غير محدد يؤثر على الجيب اللفائفي وهو أحد المضاعفات السائدة بعد استئصال المستقيم والقولون الكلي ومفاغرة الجيب اللفائفي الشرجي (IPAA) لدى الأفراد المصابين بالتهاب القولون التقرحي (UC) 1،2،3. هذه الحالة لها معدل حدوث مرتفع نسبيا يصل إلى 50٪ ويمكن أن تسبب مظاهر سريرية مختلفة ، بما في ذلك الإسهال وآلام البطن وفقدان الدم البرازي والحمى. لا يزال السبب الدقيق لالتهاب الجيب بعيد المنال ، على الرغم من أن بعض الباحثين يعتقدون أن التحول في الأكياس النباتية قد يؤدي إلى تنشيط المناعة والالتهاب اللاحق4،5،6،7.

نظرا للتحديات المرتبطة بإجراء التجارب السريرية على التهاب الجيب ، يمكن أن تكون النماذج الحيوانية بمثابة أدوات قيمة لدراسة أدوية وآليات التهاب الجيب. هناك مخاوف متزايدة بشأن إنشاء أكياس لفائفية الفئران ، مع تقارير تشير إلى التهاب محتمل8. ومع ذلك ، لا تزال الأبحاث في هذا المجال قليلة بسبب الطبيعة المعقدة لعملية التصنيع ، والتي تفتقر إلى إرشادات واضحة 9,10. في عام 1998 ، كان ليشتمان أول من أنشأ نموذجا للكيس اللفائفي في فئران لويس وفئران سبراغ داولي (SD) عن طريق إجراء استئصال القولون الكلي11. لاحظوا تسلل البلاعم ، وتقرح الغشاء المخاطي ، وزيادة في النباتات البكتيرية اللاهوائية داخل أمعاء هذه الفئران ، مما يوفر أساسا متينا لمزيد من البحث حول التهاب الجيب اللفائفي. يحاكي هذا النموذج التجريبي لالتهاب جيب الفئران عن كثب العلامات الجسدية والآليات الأساسية التي لوحظت في التهاب الجيب البشري.

تشمل نماذج التهاب القولون التقرحي قبل السريري المطبقة بشكل شائع نماذج DSS و TNBS. عادة ما تحاكي المادة الكيميائية المحفزة 2،4،6-ثلاثي نيتروبنزين حمض السلفونيك (TNBS) مرض كرون12. غالبا ما يستخدم نموذج DSS ، الذي يحظى بالاحترام لفعاليته وملف تعريف السلامة والقدرة على تحمل التكاليف ، كأداة موثوقة لتحريض UC بسبب الأعراض الواضحة التي لوحظت. نظرا لاستعمار أنسجة الحقيبة ، نجحنا في إحداث نموذج التهاب الجيب باستخدام DSS13,14.

في هذه الدراسة ، تم استخدام الجراحة المجهرية لإنشاء نموذج الجيب اللفائفي بنجاح في الفئران التجريبية عن طريق جراحة IPAA. بعد ذلك ، تم إنشاء نموذج مستدام لالتهاب جيب الفئران عن طريق إحداث التهاب في الجيب اللفائفي مع DSS. الدقة أثناء الجراحة ضرورية لتشكيل النموذج بنجاح ، كما أن رعاية ما بعد الجراحة أمر بالغ الأهمية أيضا. يمكن استخدام هذا النموذج للتحقيق في التسبب في التهاب الجيب ، وتقييم العوامل العلاجية المحتملة ، وزيادة فهمنا لهذه الحالة المعقدة. تعمل الدراسة على تبسيط إجراءات تصنيع الأكياس اللفائفية ، مما يقلل من مدة التشغيل ويعزز الكفاءة ، وبالتالي إنشاء أساس قوي للبحث الأساسي في اضطرابات الحقيبة بعد الجراحة.

Protocol

تم إجراء جميع التجارب على وفقا لسياسات اللجان الأخلاقية للمستشفى العام بجامعة تيانجين الطبية. تم استخدام ذكور الفئران Sprague-Dawley الذين تتراوح أعمارهم بين 9 و 12 أسبوعا ، والتي تزن حوالي 320-360 جم ، لهذه الدراسة. يتم سرد تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة في جدول المواد.

1. اختيار وصيانتها

  1. حدد صحيا (وزن الجسم ~ 220-240 جم).
  2. تأكد من أنها تفي بمعايير المستوى المحدد الخالي من مسببات الأمراض (SPF) 15 ويتم تربيتها بشكل تكيفي لمدة لا تقل عن أسبوعين في بيئة ذات تهوية كافية (من 8 إلى 12 تغييرا للهواء في الساعة) ، ودرجة حرارة مريحة (20-25 درجة مئوية) ، ورطوبة مناسبة (40٪ -70٪) ، والحد الأدنى من الضوضاء (أقل من 70 ديسيبل) ، ودورة الضوء الطبيعي (12 ساعة من الضوء و 12 ساعة من الظلام).
  3. خلال هذه الفترة ، ضعهم في أقفاص نظيفة قياسية بكثافة من ثلاثة إلى خمسة لكل قفص ، وقم بتغيير الفراش مرتين أسبوعيا. توفير إمكانية الوصول إلى الغذاء والماء ، بالإضافة إلى تغذية الصيانة القياسية لفئران المختبر.

2. التحضير قبل الجراحة

  1. حدد فأرا صحيا بوزن جسم تقريبي يتراوح من 320 جم إلى 360 جم. قم بصيام الفئران لمدة 8-12 ساعة قبل العملية وتوفير الوصول إلى محلول ملحي فسيولوجي و 5٪ جلوكوز بنسبة 1: 1 للاستهلاك الطوعي.
  2. تحضير الأدوات المجهرية المعقمة (نقع الكحول قبل الجراحة لمدة 1 ساعة) ، مجهر ، جدول تشريح الفئران ، 8-0 خياطة جزيئية عالية غير قابلة للامتصاص ، خياطة 4-0 غير قابلة للامتصاص ، شاش معقم ، مسحات قطنية معقمة ، إلخ.

3. إنشاء نموذج الحقيبة اللفائفية الفئران

  1. حقن محلول صوديوم بنتوباربيتال 1٪ داخل الصفاق بجرعة 6 مل / كجم وتسلل جراحي للتخدير الموضعي مع 0.5٪ روبيفاكايين لتخدير الفئران. الحفاظ على الفئران في درجة حرارة مريحة أثناء التخدير مع مصباح كهربائي.
  2. قم بإجراء استئصال القولون والمستقيم الكلي باتباع الخطوات التالية:
    1. قم بتأمين الجرذ في الاستلقاء الظهري على مقعد تشريحي بعد بروتوكول مخدر مرض. تأكد من عمق التخدير عن طريق قرصة إصبع القدم. استخدم كليبرز الحلاقة للتخلص من بقايا الشعر ، وقم بتطبيق محلول اليودوفور مرتين للتعقيم الميداني الجراحي.
    2. قم بعمل شق في خط الوسط ، بطول 6 سم تقريبا ، لتشريح الجلد ولفافة الخط الأبيض والبريتوني ، مما يوفر الدخول إلى تجويف البطن. استخدم ضامنا لفضح السطح البريتوني وتغطيته بشاش معقم مالح مبلل بالجراثيم.
    3. عزل تدفق الأوعية الدموية من الصائم الطرفية ، وربط أصله باستخدام 8-0 خيط خياطة ، وبعد ذلك قطعه. اضبط جذع cecal ، الذي يقع على بعد 1-2 سم من الصمام اللفائفي الأعور ، في حالة راحة ، ثم اقطعه.
    4. بدء استئصال نصف القولون الأيمن ، وربط نصف القولون الأيمن والوريد المغص الأوسط بشكل متحفظ.
    5. مزيد من فصل الشريان المساريقي السفلي وعزل الشريان المستقيمي السفلي. استمر في العزل أسفل المستقيم حتى فاصل زمني يعادل سنتيمترين من حافة الشرج. استئصال المستقيم البعيد بشكل غير مباشر عند حوالي 45 درجة لتجنب تضيق ما بعد الجراحة.
  3. أداء بناء الحقيبة J.
    1. استخدم مشرط ميكروتوم لفصل القسم العرضي من الدقاق الطرفي عن الأمعاء المساريقية ، والتي يجب أن تقيس حوالي 6-7 سم.
    2. قم بطي الدقاق الطرفي في شكل J لإنشاء كيس للدقاق. إجراء مفاغرة الجدار الخلفي عن طريق غرزة متشابكة. قم بزيادة الجدار الأمامي باستخدام غرزة كونيل المعدلة واحتفظ بأمعاء مناسبة لتتناسب مع حجم المقطع العرضي لجذع المستقيم البعيد.
    3. تعزيز الحقيبة على شكل حرف J مع 8-0 خياطة إذا لزم الأمر. يجب أن يتراوح طول الحقيبة J بين 2.5 سم و 3.5 سم.
  4. أداء مفاغرة الجيب اللفائفي الشرج ، IPAA.
    1. تأكد من عدم وجود التواء في المساريق وخياطة الجدران الجانبية للنمل في فتحة الحقيبة والجدار الجانبي لجذع المستقيم على فترات مع 8-0 خيط خياطة للجر.
    2. في النهاية ، ضع خياطة قفل مستمرة كاملة الطبقة على كل من الجدران الأمامية والخلفية.
    3. تحقق من عدم وجود نزيف نشط وتطهير تجويف البطن من الناحية الفسيولوجية بالمحلول الملحي الطبيعي. إغلاق بالتتابع اللفافة العضلية البطنية والجلد مع 4-0 الغرز.
  5. أداء إدارة ما بعد الجراحة.
    1. تطبيق كيتوبروفين كتسكين بعد العملية الجراحية (40 ملغ/ كغ، تحت الجلد) لجميع الفئران بعد إغلاق البطن. تأكد من تسخين الفئران باستخدام مصباح كهربائي حتى يحدث الترميم.
    2. تقييد من استهلاك الطعام لمدة لا تقل عن 72 ساعة بعد الجراحة للحد من خطر انسداد الأمعاء. اسمح بالوصول إلى نظام غذائي يحتوي على 5٪ من الجلوكوز لتجديد الطاقة وسوائل الجسم بسرعة ، وضبط وتيرة التغذية وفقا لأنماط التغوط.
    3. بعد أسبوع من الجراحة ، ابدأ بتغذية محدودة وقم بزيادة الكمية المستهلكة تدريجيا. بعد ذلك ، قم بتزويد الفئران بتغذية القوارض العادية للاستهلاك بحرية ، مع الاحتفاظ بسجل يومي لاستهلاكها الغذائي وكمية الماء ووزن الجسم.

4. إنشاء نموذج التهاب الجيب اللفائفي الفئران مع DSS

  1. إجراء التجميع التجريبي.
    1. قم بتعيين 12 فأرا بشكل عشوائي خضعوا لاستئصال القولون والمستقيم الكلي وجراحة IPAA في مجموعة IPAA (المجموعة A ، n = 6) ومجموعة التهاب الجيب (المجموعة B ، n = 6).
    2. قم بإعداد محلول DSS بنسبة 4٪ عن طريق إضافة 4 جم من DSS إلى 100 مل من الماء النقي ، يتم تحضيره طازجا يوميا.
    3. إدارة مجموعة IPAA ومجموعة التهاب الجيب بالماء النقي أو 4٪ DSS في اليوم 31 بعد الجراحة إلى اليوم 35 ، على التوالي. اسمح للفئران بشرب وأكل طعام الفئران بحرية خلال الأيام الأربعة المتتالية من تناولها.
  2. أداء أخذ عينات الحقيبة.
    1. في صباح اليوم 35 ، بعد العملية ، قم بتخدير الفئران بحقن داخل الصفاق من محلول صوديوم بنتوباربيتال 1٪ ، مع إعطاء جرعة 6 مل / كجم (وفقا للبروتوكولات المعتمدة مؤسسيا).
    2. اقطع الحقيبة بشكل عمودي من ثغرة الحقيبة إلى تقاطع أكياس الإدخال والإخراج في كل مجموعة. الحصول على عينة الحقيبة.
    3. افتح الحقيبة على طول خط خياطة الجدار الأمامي واغسل القناة المعوية بالمحلول الملحي.
    4. ضع جزءا من أنسجة الحقيبة في أنبوب طرد مركزي دقيق وقم بتبريده على الفور عند -80 درجة مئوية. استخدم هذا الجزء للكشف عن ELISA للمؤشرات الالتهابية. قم بإصلاح قسم الحقيبة المتبقي بنسبة 10٪ فورمالديهايد لتسجيل التشريح المرضي وتلطيخ المناعة الكيميائية.
    5. أخيرا ، القتل الرحيم للفأر عن طريق انسداد الهواء تحت التخدير العميق (باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا).

5. التحليل النسيجي

  1. بعد الحصول على أنسجة الحقيبة من الفئران ، اغمرها في 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 24 ساعة. بعد ذلك ، تابع بروتوكولات الجفاف والتضمين. قسم الأنسجة المعالجة للفحص النسيجي16.
  2. تطبيق تلطيخ الهيماتوكسيلين ويوزين لتحديد الاختلافات النسيجية المرضية عبر المجموعات. فحص العينات مجهريا والتقاط الصور الفوتوغرافية للتوثيق.

6. المقايسة المناعية الهيستوكيميائية

  1. إزالة الشمع وتجفيف أقسام الأنسجة بعناية. بعد ذلك ، قم بإجراء استرجاع المستضد عن طريق تبريد الأقسام في محلول سترات الصوديوم وسدها بمصل مانع لمدة 20 دقيقة.
  2. بعد ذلك ، قم بتعريض الشرائح للجسم المضاد الأساسي المضاد للإطباق واحتضانها طوال الليل عند 4 درجات مئوية. بعد ذلك ، عالجهم بالأجسام المضادة الثانوية لمدة 30 دقيقة قبل تلطيخ الهيماتوكسيلين16.
  3. بمجرد أن تجف الشرائح ، راقبها وصورها تحت المجهر الضوئي.

7. اختبار إليسا

  1. 7.1 فرم وتجانس شظايا الأنسجة في العازلة التحلل باستخدام صوتنة لضمان التجانس الشامل. استخدم المادة الطافية الناتجة للكشف.
  2. تخصيص الآبار للفراغات والعينات والنسخ المتماثلة لكل مجموعة. تحديد تركيز البروتين عن طريق قراءة الامتصاص عند 450 نانومتر (قيمة OD) وإجراء تحليل الانحدار الخطي16.

النتائج

تقييم الحالة العامة للفئران النموذجية للكيس اللفائفي بعد التأسيس
بعد أن اجتاز المشغل منحنى التعلم الجراحي IPAA ، تحملت الفئران الجراحة جيدا ، مع مدة جراحية تبلغ 192.94 دقيقة ± 27.15 دقيقة ، وحدثت مضاعفات أقل بعد الجراحة. خلال فترة ما بعد الجراحة المبكرة ، شهدت الفئرا...

Discussion

التهاب القولون التقرحي (UC) هو التهاب معوي مزمن يتميز بألم شرسوفي متكرر وإسهال وبراز دموي مخاطي. يؤثر في المقام الأول على المستقيم وقد يشمل القولون المتقدم بدرجات متفاوتة. تلعب الجراحة دورا حاسما في إدارة UC17،18،19. منذ أن ق...

Disclosures

اي.

Acknowledgements

اي

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Anhydrous ethanolTianjin Fengchuan Chemical Reagent Technology Co., LtdChinaHematoxin-eosin Staining
Dextran Sulfate Sodium  Yeasen 60316ES76Used to induce pouch inflammation
Formaldehyde solutionTianjin Zhiyuan Reagent CompanyChinaHematoxin-eosin Staining
GauzeJiangxi Zhonggan Medical Equipment CompanyChinaUsed for animal microsurgery
HematoxylinBeijing Zhongshan Jinqiao CompanyChinaHematoxin-eosin Staining
Interferon γ  Detection reagent kitCloud-cloneSEA049RaDetecting inflammatory factors
Interleukin-10 detection kitCloud-cloneSEA056RaDetecting inflammatory factors
Interleukin-17 detection kitCloud-cloneSEA063RaDetecting inflammatory factors
Interleukin-6 detection kitCloud-cloneSEA079RaDetecting inflammatory factors
IodophorTangpai Medical Equipment Co., LtdChinaUsed for animal microsurgery
Microscopic manipulation instrumentsAesculapGermanyUsed for animal microsurgery
Occludinabcamab216327Immunohistochemical testing
Sewing needleYangzhou Fuda Medical Equipment Co., LtdChinaUsed for animal microsurgery
tumor necrosis factor α Detection reagent kitCloud-cloneSEA133RaDetecting inflammatory factors
Two person binocular surgical microscopeOPTONGermanyUsed for animal microsurgery
XyleneTianjin Yingda Rare and Precious Reagent FactoryChinaHematoxin-eosin Staining

References

  1. Yang, M. L., Brar, M. S., Kennedy, E. D., De Buck Van Overstraeten, A. Laparoscopic versus transanal IPAA for ulcerative colitis: A patient-centered treatment trade-off study. Dis Colon Rectum. 67 (1), 107-113 (2024).
  2. Aktas, M. K., et al. Current status and surgical technique for restorative proctocolectomy with ileal pouch-anal anastomosis. Balkan Med J. 40 (4), 236-243 (2023).
  3. Zhao, L., et al. Microbiota DNA translocation into mesentery lymph nodes is associated with early development of pouchitis after ipaa for ulcerative colitis. Diseases of the Colon & Rectum. 66 (11), e1107-e1118 (2022).
  4. Ng, S. C., et al. Worldwide incidence and prevalence of inflammatory bowel disease in the 21st century: A systematic review of population-based studies. Lancet. 390 (10114), 2769-2778 (2017).
  5. Pardi, D. S., D'haens, G., Shen, B., Campbell, S., Gionchetti, P. Clinical guidelines for the management of pouchitis. Inflamm Bowel Dis. 15 (9), 1424-1431 (2009).
  6. Shen, B., et al. Treatment of pouchitis, Crohn's disease, cuffitis, and other inflammatory disorders of the pouch: Consensus guidelines from the international ileal pouch consortium. Lancet Gastroenterol Hepatol. 7 (1), 69-95 (2022).
  7. Dalal, R. L., Shen, B., Schwartz, D. A. Management of pouchitis and other common complications of the pouch. Inflamm Bowel Dis. 24 (5), 989-996 (2018).
  8. Li, K. Y., et al. A new rat model of pouchitis after proctocolectomy and ileal pouch-anal anastomosis using 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid. J Gastrointest Surg. 25 (6), 1524-1533 (2021).
  9. Drzymala-Czyz, S., et al. Discrepancy between clinical and histological effects of dha supplementation in a rat model of pouchitis. Folia Histochem Cytobiol. 50 (1), 125-129 (2012).
  10. Santiago, P., Barnes, E. L., Raffals, L. E. Classification and management of disorders of the J pouch. Am J Gastroenterol. 118 (11), 1931-1939 (2023).
  11. Lichtman, S. N., Wang, J., Hummel, B., Lacey, S., Sartor, R. B. A rat model of ileal pouch-rectal anastomosis. Inflamm Bowel Dis. 4 (3), 187-195 (1998).
  12. Guarner, F. Inulin and oligofructose: Impact on intestinal diseases and disorders. Br J Nutr. 93, S61-S65 (2005).
  13. Kim, C. J., et al. L-tryptophan exhibits therapeutic function in a porcine model of dextran sodium sulfate (DSS)-induced colitis. J Nutr Biochem. 21 (6), 468-475 (2010).
  14. Valatas, V., Bamias, G., Kolios, G. Experimental colitis models: Insights into the pathogenesis of inflammatory bowel disease and translational issues. Eur J Pharmacol. 759, 253-264 (2015).
  15. Letson, H. L., Morris, J., Biros, E., Dobson, G. P. Conventional and specific-pathogen free rats respond differently to anesthesia and surgical trauma. Sci Rep. 9 (1), 9399 (2019).
  16. Gu, Y., et al. Saccharomyces boulardii, a yeast probiotic, inhibits gut motility through upregulating intestinal serotonin transporter and modulating gut microbiota. Pharmacol Res. 181, 106291 (2022).
  17. Akiyama, S., et al. Endoscopic phenotype of the j pouch in patients with inflammatory bowel disease: A new classification for pouch outcomes. Clin Gastroenterol Hepatol. 20 (2), 293-302 (2022).
  18. Hata, K., et al. Pouchitis after ileal pouch-anal anastomosis in ulcerative colitis: Diagnosis, management, risk factors, and incidence. Dig Endosc. 29 (1), 26-34 (2017).
  19. Gallo, G., Kotze, P. G., Spinelli, A. Surgery in ulcerative colitis: When? How. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 32-33, 71-78 (2018).
  20. Parks, A. Proctocolectomy without ileostomy for ulcerative colitis. BMJ. 2, 85-88 (1978).
  21. Shebani, K. O., et al. Pouchitis in a rat model of ileal J pouch-anal anastomosis. Inflamm Bowel Dis. 8 (1), 23-34 (2002).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

207 IPAA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved