Модель резервуарного илеита у крыс после проктоколэктомии и подвздошно-анального анастомоза с использованием декстрана сульфата натрия

Резюме

В этом протоколе описан метод создания крысиной модели резервуарного илеита. Модель подвздошного мешка была создана путем проведения операции подвздошно-анального анастомоза (IPAA) с использованием микрохирургических методов. После операции крысу обрабатывали 4% декстрана сульфатом натрия (ДСС) в течение 4 дней.

Аннотация

Язвенный колит (ЯК) – это хроническое иммуноопосредованное заболевание, поражающее всю толстую и прямую кишку с рецидивирующим и ремиттирующим течением, вызывая пожизненную заболеваемость. Когда медикаментозное лечение неэффективно, особенно в случаях массивного желудочно-кишечного кровотечения, перфорации, токсического мегаколона или канцерогенеза, хирургическое вмешательство становится последней линией обороны для лечения ЯК. Тотальная колоректальная резекция и анальный анастомоз подвздошной кишки (IPAA) дают наилучшие шансы на долгосрочное лечение. Резервуарный илеит является наиболее распространенным и проблемным послеоперационным осложнением. В этом исследовании микрохирургия используется для создания модели подвздошного мешка у экспериментальных крыс с помощью хирургии IPAA. Впоследствии была создана устойчивая модель резервуарного илеита на крысах путем индуцирования воспаления подвздошной кишки декстрансульфатом натрия (DSS). Успешное установление яленого мешка у крыс подтверждается анализом послеоперационного общего состояния, веса, потребления пищи и воды, данных кала, а также патологии тканей мешка, иммуногистохимии и анализа факторов воспаления. Эта экспериментальная животная модель резервуарного илеита обеспечивает основу для изучения патогенеза и лечения этого состояния.

Введение

Резервуарный илеит является неспецифическим воспалением, которое поражает подвздошный мешок и является распространенным осложнением после тотальной проктоколэктомии и анального анастомоза подвздошной кишки (ИПХА) у лиц с язвенным колитом (ЯК)^1,2,3. Это состояние имеет относительно высокую частоту встречаемости до 50% и может вызывать различные клинические проявления, включая диарею, боли в животе, потерю каловой крови и лихорадку. Точная причина резервуарного илеита остается неясной, хотя некоторые исследователи считают, что сдвиг в флоре мешочек может вызвать иммунную активацию и последующее воспаление.

Из-за сложностей, связанных с проведением клинических испытаний резервуарного илеита, животные модели могут служить ценными инструментами для изучения лекарств и механизмов лечения резервуарного илеита. Растут опасения по поводу создания подвздошных мешочков крыс, при этом поступают сообщения о возможном воспалении⁸. Тем не менее, исследования в этой области остаются скудными из-за сложного характера производственного процесса, в котором отсутствуют ^{четкие руководящие} принципы^. В 1998 году Лихтман был первым, кто создал модель подвздошного мешка у крыс Льюиса и крыс Спрага-Доули (SD), выполнив тотальную колэктомию¹¹. Они наблюдали инфильтрацию макрофагов, изъязвление слизистых оболочек и увеличение анаэробной бактериальной флоры в кишечнике этих крыс, что обеспечило прочную основу для дальнейших исследований воспаления подвздошной кишки. Эта экспериментальная модель крысиного резервуарного илеита в точности имитирует физические признаки и основные механизмы, наблюдаемые при человеческом резервуарном резервуаре.

Обычно применяемые доклинические модели язвенного колита включают модели DSS и TNBS. Индуцирующее химическое вещество 2,4,6-тринитробензолсульфоновая кислота (ТНБС) обычно имитирует болезнь Крона¹². Модель DSS, уважаемая за свою эффективность, профиль безопасности и доступность, часто используется в качестве надежного инструмента для индукции ЯК из-за наблюдаемых симптомов. Учитывая колонизацию ткани мешочка, мы успешно индуцировали модель резервуарного илеита с использованием DSS^13,14.

В настоящем исследовании микрохирургия была использована для успешного создания модели подвздошного мешка у экспериментальных крыс с помощью хирургии IPAA. Впоследствии была создана устойчивая модель крысиного резервуарного илеита путем индукции воспаления подвздошного мешка с помощью DSS. Точность во время операции имеет важное значение для успешного формирования модели, а послеоперационный уход также имеет решающее значение. Эта модель может быть использована для исследования патогенеза резервуарного илеита, оценки потенциальных терапевтических агентов и углубления нашего понимания этого сложного состояния. Исследование оптимизирует процедуру изготовления подвздошного мешка, сокращая продолжительность операции и повышая эффективность, тем самым создавая прочную основу для фундаментальных исследований послеоперационных заболеваний подвздошного мешка.

протокол

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с политикой этических комитетов Больницы общего профиля Тяньцзиньского медицинского университета. Для этого исследования были использованы самцы крыс Sprague-Dawley в возрасте от 9 до 12 недель и весом примерно 320-360 г. Подробная информация об используемых реагентах и оборудовании приведена в Таблице материалов.

1. Отбор и содержание животных

1. Выберите здоровое животное (масса тела ~220-240 г).
2. Убедитесь, что они соответствуют критериям специфического уровня отсутствия патогенов (SPF)¹⁵ и адаптивно выращиваются в течение как минимум 2 недель в среде с достаточной вентиляцией (от 8 до 12 воздухообменов в час), комфортной температурой (20-25 °C), соответствующей влажностью (40%-70%), минимальным шумом (ниже 70 децибел) и естественным световым циклом (12 часов света и 12 часов темноты).
3. В течение этого периода размещайте их в стандартных чистых клетках с плотностью от трех до пяти клеток на клетку и меняйте подстилку два раза в неделю. Обеспечьте неограниченный доступ к пище и воде, а также к стандартному корму для лабораторных крыс.

2. Предоперационная подготовка

1. Выберите здоровую крысу с примерной массой тела от 320 г до 360 г. Голодайте крысу за 8-12 ч до операции и обеспечьте доступ к раствору физиологического раствора и 5% глюкозы в соотношении 1:1 для добровольного потребления.
2. Подготовьте автоклавные микрохирургические инструменты (предоперационное замачивание в спирте на 1 ч), микроскоп, стол для препарирования крыс, 8-0 нерассасывающийся высокомолекулярный шовный материал, нерассасывающийся шовный материал 4-0, стерильная марля, стерильные ватные палочки и т.д.

3. Создание модели подвздошной кишки крысы

1. Внутрибрюшинное введение 1% раствора пентобарбитала натрия в дозе 6 мл/кг и внутрибрюшинное введение местной анестезии с 0,5% ропивакаином для обезболивания крысы. Поддерживайте комфортную температуру крысы во время анестезии с помощью электрической лампы.
2. Выполните тотальную колоректальную резекцию, выполнив следующие действия:
   1. Закрепите крысу в положении лежа на анатомической скамье в соответствии с удовлетворительным протоколом анестезии. Подтвердите глубину анестезии с помощью зажима пальца ноги. Используйте машинки для стрижки для бритья, чтобы удалить остатки волос, и дважды нанесите раствор йодофора для стерилизации хирургических полей.
   2. Сделайте разрез по средней линии, длиной примерно 6 см, чтобы рассечь через кожу, белую линию фасции и брюшину, обеспечивая вход в брюшную полость. С помощью ретрактора обнажите поверхность брюшины и накройте ее стерильной марлей, пропитанной бактериостатическим раствором.
   3. Изолировать сосудистый поток терминальной тощей кишки, перевязать его начало с помощью 8-0 Наложите шов нитью, а впоследствии разорвите ее. Установите культю слепой кишки, расположенную в 1-2 см от илеоцекального клапана, в состояние покоя, а затем разрежьте ее.
   4. Начните резекцию правого гемиколона, консервативно перевязывая правый гемиколон и среднюю коликовую вену.
   5. Далее отделите нижнюю брыжеечную артерию и изолируйте нижнюю ректальную артерию. Продолжайте изоляцию вниз по прямой кишке до интервала, равного двум сантиметрам от анального края. Косо резекцию дистального отдела прямой кишки под углом около 45 градусов во избежание послеоперационного стеноза.
3. Выполните конструкцию J-образного мешка.
   1. С помощью микротомного скальпеля отделите поперечный срез терминальной подвздошной кишки от брыжеечной кишки, которая должна составлять около 6-7 см.
   2. Сложите терминальную подвздошную кишку в J-образную форму, чтобы получился мешочек для подвздошной кишки. Выполните анастомоз задней стенки с помощью блокирующего шва. Увеличьте переднюю стенку с помощью модифицированного шва Коннелла и сохраните соответствующую кишку, чтобы она соответствовала размеру поперечного сечения дистального отдела культи прямой кишки.
   3. Укрепите J-образный мешочек с помощью 8-0 сшивание при необходимости. Длина J-подсумка должна находиться в диапазоне от 2,5 см до 3,5 см.
4. Выполняют подвздошно-анальный анастомоз, IPAA.
   1. Подтвердите отсутствие перекрута в брыжейке и зашите муравьиные боковые стенки отверстия мешочка и боковую стенку культи прямой кишки с интервалом 8-0 Сшивающая нить для вытяжения.
   2. В конечном итоге, наложите полнослойный непрерывный замковый шов как на переднюю, так и на заднюю стенки.
   3. Убедитесь в отсутствии активных кровотечений и физиологически очистите брюшную полость обычным физиологическим раствором. Последовательно закройте фасцию мышц живота и кожу швами 4-0.
5. Выполняйте послеоперационное лечение.
   1. Вводите кетопрофен в качестве послеоперационной анальгезии (40 мг/кг, подкожно) всем крысам после закрытия брюшной полости. Следите за тем, чтобы крыса согревалась с помощью электрической лампы до тех пор, пока не произойдет восстановление.
   2. Ограничьте употребление пищи животным в течение как минимум 72 ч после операции, чтобы снизить риск кишечной непроходимости. Обеспечьте доступ к диете с содержанием 5% глюкозы в неограниченном количестве, чтобы быстро восполнить энергию и жидкости в организме, а также отрегулируйте частоту кормления в соответствии с режимом дефекации.
   3. Через неделю после операции начните с ограниченного питания и постепенно увеличивайте его количество. Затем обеспечьте крыс регулярным кормом для грызунов, чтобы они могли свободно потреблять, ведя ежедневный учет их рациона, потребления воды и массы тела.

4. Создание модели подвздошного резервуарного илеита крыс с помощью DSS

1. Выполните экспериментальную группировку.
   1. Случайным образом распределите 12 крыс, перенесших тотальную колоректальную резекцию и операцию IPAA, в группу IPAA (группа A, n = 6) и группу резервуарного илеита (группа B, n = 6).
   2. Приготовьте 4% раствор DSS, добавив 4 г DSS в 100 мл чистой воды, только что приготовленной ежедневно.
   3. В группе IPAA и группе резервуарного илеита вводят чистую воду или 4% DSS на 31-й день после операции и на 35-й день соответственно. Позвольте крысам свободно пить и есть корм для крыс в течение четырех дней подряд.
2. Выполните отбор проб из мешка.
   1. Утром 35-го дня, после операции, обезболить крыс внутрибрюшинной инъекцией 1% раствора пентобарбитала натрия, введя дозу 6 мл/кг (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами).
   2. Разрежьте стомный мешок перпендикулярно от устьица мешка до места соединения входного и выходного мешков в каждой группе. Получите образец из мешочка.
   3. Откройте мешочек по линии шва передней стенки и промойте кишечный канал физиологическим раствором.
   4. Поместите фрагмент ткани мешка в микроцентрифужную пробирку и быстро охладите его при температуре -80 °C. Используйте эту часть для выявления признаков воспаления с помощью ИФА. Зафиксируйте оставшуюся часть мешка 10% формальдегидом для гистопатологического скоринга и иммуногистохимического окрашивания.
   5. Наконец, усыпить крысу путем воздушной эмболии под глубокой анестезией (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами).

5. Гистологический анализ

1. После получения мешочной ткани от крысы погрузите ее в 4% параформальдегид на 24 ч. Затем приступайте к протоколам обезвоживания и внедрения. Срез обработанной ткани для гистологического исследования¹⁶.
2. Применяйте окрашивание гематоксилином и эозином для выявления гистопатологических различий между группами. Изучите образцы под микроскопом и сделайте фотографии для документирования.

6. Иммуногистохимический анализ

1. Тщательно обеспылите и обезвожьте участки тканей. Затем проводят забор антигена, охлаждая участки в растворе цитрата натрия и блокируя их блокирующей сывороткой в течение 20 мин.
2. Затем подвергнуть срезы воздействию первичного антиокклюдинового антитела и инкубировать их в течение ночи при 4 °C. После этого обработайте их вторичными антителами в течение 30 минут перед противодействием гематоксилину¹⁶.
3. Как только срезы высохнут, понаблюдайте и сфотографируйте их под световым микроскопом.

7. ИФА-тест

1. 7.1 Измельчить и гомогенизировать фрагменты ткани в буфере для лизиса с использованием ультразвука для обеспечения тщательной гомогенизации. Используйте полученный надосадочный слой для обнаружения.
2. Выделяйте лунки для заготовок, образцов и реплик для каждой группы. Определение концентрации белка путем считывания коэффициента поглощения при длине волны 450 нм (значение OD) и проведения линейного регрессионного анализа¹⁶.

Результаты

Общая оценка состояния крыс с модельным подвздошным мешком после приживления
После того, как оператор прошел кривую хирургического обучения IPAA, крысы хорошо переносили операцию, продолжительность операции составила 192,94 мин ± 27,15 мин, и возникло меньше пос?...

Обсуждение

Язвенный колит (ЯК) – это хроническое воспаление кишечника, характеризующееся периодическими болями в эпигастрии, диареей и кровавым стулом со слизью. В первую очередь он поражает прямую кишку и может поражать прогрессирующую толстую кишку в разной степени. Хирургич...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anhydrous ethanol	Tianjin Fengchuan Chemical Reagent Technology Co., Ltd	China	Hematoxin-eosin Staining
Dextran Sulfate Sodium	Yeasen	60316ES76	Used to induce pouch inflammation
Formaldehyde solution	Tianjin Zhiyuan Reagent Company	China	Hematoxin-eosin Staining
Gauze	Jiangxi Zhonggan Medical Equipment Company	China	Used for animal microsurgery
Hematoxylin	Beijing Zhongshan Jinqiao Company	China	Hematoxin-eosin Staining
Interferon γ  Detection reagent kit	Cloud-clone	SEA049Ra	Detecting inflammatory factors
Interleukin-10 detection kit	Cloud-clone	SEA056Ra	Detecting inflammatory factors
Interleukin-17 detection kit	Cloud-clone	SEA063Ra	Detecting inflammatory factors
Interleukin-6 detection kit	Cloud-clone	SEA079Ra	Detecting inflammatory factors
Iodophor	Tangpai Medical Equipment Co., Ltd	China	Used for animal microsurgery
Microscopic manipulation instruments	Aesculap	Germany	Used for animal microsurgery
Occludin	abcam	ab216327	Immunohistochemical testing
Sewing needle	Yangzhou Fuda Medical Equipment Co., Ltd	China	Used for animal microsurgery
tumor necrosis factor α Detection reagent kit	Cloud-clone	SEA133Ra	Detecting inflammatory factors
Two person binocular surgical microscope	OPTON	Germany	Used for animal microsurgery
Xylene	Tianjin Yingda Rare and Precious Reagent Factory	China	Hematoxin-eosin Staining