Um modelo de bolsite em ratos após proctocolectomia e anastomose ileal bolsa-anal usando sulfato de dextrano sódico

Resumo

Este protocolo descreve o método para estabelecer um modelo de bolsite em ratos. O modelo de bolsa ileal foi criado através da realização de cirurgia de anastomose ileal-bolsa anal (IPAA) usando técnicas microcirúrgicas. Após a cirurgia, o rato foi tratado com sulfato de dextrano sódico (DSS) a 4% por 4 dias.

Resumo

A colite ulcerativa () é uma doença crônica imunomediada que afeta todo o cólon e reto com um curso recidivante e remitente, causando morbidade ao longo da vida. Quando o tratamento médico é ineficaz, especialmente em casos de sangramento gastrointestinal maciço, perfuração, megacólon tóxico ou carcinogênese, a cirurgia se torna a última linha de defesa para curar a colite ulcerativa. A ressecção colorretal total e a anastomose ileal bolsa-anal (IPAA) oferecem a melhor chance de tratamento a longo prazo. A bolsite é a complicação pós-operatória mais comum e problemática. Nesta investigação, a microcirurgia é empregada para criar um modelo de bolsa ileal em ratos experimentais por meio de cirurgia IPAA. Posteriormente, um modelo de bolsite sustentado em ratos é estabelecido pela indução da inflamação da bolsa ileal com sulfato de dextrano sódico (DSS). O estabelecimento bem-sucedido da bolsite de ratos é validado por meio da análise do estado geral pós-operatório, peso, ingestão de alimentos e água, dados fecais, bem como patologia do tecido da bolsa, imuno-histoquímica e análise de fatores inflamatórios. Este modelo animal experimental de bolsite fornece uma base para estudar a patogênese e o tratamento da doença.

Introdução

A bolsite é uma inflamação inespecífica que afeta a bolsa ileal e é uma complicação prevalente após proctocolectomia total e anastomose ileal-bolsa anal (IPAA) em indivíduos com colite ulcerativa ()^1,2,3. Essa condição tem uma taxa de ocorrência relativamente alta de até 50% e pode causar várias manifestações clínicas, incluindo diarreia, dor abdominal, perda de sangue fecal e febre. A causa exata da bolsite permanece indefinida, embora alguns pesquisadores acreditem que uma mudança na flora da bolsa possa desencadear a ativação imunológica e a inflamação subsequente 4,5,6,7.

Devido aos desafios associados à realização de ensaios clínicos sobre bolsite, os modelos animais podem servir como ferramentas valiosas para estudar drogas e mecanismos de bolsite. Há preocupações crescentes em relação à criação de bolsas ileais de ratos, com relatos indicando possível inflamação⁸. No entanto, as pesquisas nesse campo permanecem escassas devido à natureza intrincada do processo de fabricação, que carece de diretrizes claras ^9,10. Em 1998, Lichtman foi o primeiro a estabelecer um modelo de bolsa ileal em ratos Lewis e ratos Sprague-Dawley (SD) realizando colectomia total¹¹. Eles observaram infiltração de macrófagos, ulceração da mucosa e um aumento na flora bacteriana anaeróbica nos intestinos desses ratos, fornecendo uma base sólida para pesquisas futuras sobre a inflamação da bolsa ileal. Este modelo experimental de bolsite de rato imita de perto os sinais físicos e os mecanismos subjacentes observados na bolsite humana.

Os modelos de colite ulcerativa pré-clínica comumente aplicados incluem os modelos DSS e TNBS. O produto químico indutor do ácido 2,4,6-trinitrobenzeno sulfônico (TNBS) tipicamente simula a doença de Crohn¹². O modelo DSS, respeitado por sua eficácia, perfil de segurança e acessibilidade, é frequentemente utilizado como uma ferramenta confiável para a indução da colite ulcerativa devido aos sintomas evidentes observados. Dada a colonização do tecido da bolsa, induzimos com sucesso um modelo de bolsite usando DSS^13,14.

No presente estudo, a microcirurgia foi usada para criar com sucesso um modelo de bolsa ileal em ratos experimentais por meio de cirurgia IPAA. Posteriormente, um modelo de bolsite de rato sustentado foi estabelecido induzindo inflamação da bolsa ileal com DSS. A precisão durante a cirurgia é essencial para a formação bem-sucedida do modelo, e os cuidados pós-operatórios também são cruciais. Este modelo pode ser usado para investigar a patogênese da bolsite, avaliar potenciais agentes terapêuticos e aprofundar nossa compreensão dessa condição complexa. O estudo agiliza o procedimento de fabricação da bolsa ileal, reduzindo a duração da operação e aumentando a eficiência, estabelecendo assim uma base robusta para a pesquisa fundamental sobre distúrbios pós-cirúrgicos da bolsa.

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com as políticas dos comitês de ética do Hospital Geral da Universidade Médica de Tianjin. Ratos Sprague-Dawley machos com idade entre 9 e 12 semanas, pesando aproximadamente 320-360 g, foram utilizados para este estudo. Os detalhes dos reagentes e equipamentos usados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Seleção e manutenção de animais

1. Selecione um animal saudável (peso corporal de ~ 220-240 g).
2. Certifique-se de que eles atendam aos critérios do nível específico de livre de patógenos (FPS)¹⁵ e sejam criados de forma adaptativa por um mínimo de 2 semanas em um ambiente com ventilação adequada (8 a 12 trocas de ar por hora), temperatura confortável (20-25 °C), umidade apropriada (40%-70%), ruído mínimo (abaixo de 70 decibéis) e um ciclo de luz natural (12 h de luz e 12 h de escuridão).
3. Durante este período, aloje-os em gaiolas limpas padrão a uma densidade de três a cinco por gaiola e troque a roupa de cama duas vezes por semana. Forneça acesso ad libitum a comida e água, bem como ração de manutenção padrão para ratos de laboratório.

2. Preparo pré-operatório

1. Selecione um rato saudável com um peso corporal aproximado de 320 g a 360 g. Jejue o rato por 8-12 h antes da operação e forneça acesso a uma solução salina fisiológica e glicose a 5% na proporção de 1:1 para consumo voluntário.
2. Preparar os instrumentos microcirúrgicos autoclavados (imersão pré-operatória em álcool por 1 h), um microscópio, uma mesa de dissecação de ratos, 8-0 sutura de alto peso molecular não absorvível, sutura não absorvível 4-0, gaze estéril, cotonetes estéreis, etc.

3. Estabelecimento do modelo de bolsa ileal de rato

1. Injetar por via intraperitoneal uma solução de pentobarbital sódico a 1% na dose de 6 mL/kg e infiltração incisional de anestesia local com ropivacaína a 0,5% para anestesiar o rato. Mantenha o rato a uma temperatura confortável durante a anestesia com uma lâmpada elétrica.
2. Realize a ressecção colorretal total seguindo os passos abaixo:
   1. Fixe o rato em decúbito dorsal em uma bancada anatômica seguindo um protocolo anestésico satisfatório. Confirme a profundidade da anestesia por meio de um beliscão no dedo do pé. Use uma máquina de cortar cabelo para eliminar os detritos de cabelo e aplique a solução de iodóforo duas vezes para esterilização do campo cirúrgico.
   2. Faça uma incisão na linha média, com aproximadamente 6 cm de comprimento, para dissecar através da pele, fáscia da linha branca e peritônio, proporcionando a entrada na cavidade abdominal. Use um afastador para expor a superfície peritoneal e cubra-a com gaze estéril bacteriostática embebida em solução salina.
   3. Isole o fluxo vascular do jejuno terminal, ligue sua origem usando um 8-0 fio de sutura e, posteriormente, cortá-lo. Coloque o coto cecal, localizado a 1-2 cm da válvula ileocecal, em repouso e, em seguida, corte-o.
   4. Inicie a ressecção do hemicólon direito, ligando o hemicólon direito e a veia cólica média de forma conservadora.
   5. Segregar ainda mais a artéria mesentérica inferior e isolar a artéria retal inferior. Continue o isolamento no reto até um intervalo equivalente a dois centímetros da borda anal. Ressecar obliquamente o reto distal em torno de 45 graus para evitar estenose pós-operatória.
3. Execute a construção da bolsa J.
   1. Use um bisturi de micrótomo para separar a seção transversal do íleo terminal do intestino do mesentério, que deve medir cerca de 6-7 cm.
   2. Dobre o íleo terminal em forma de J para criar uma bolsa para o íleo. Realize a anastomose da parede posterior por meio de um ponto de intertravamento. Aumente a parede anterior usando um ponto de Connell modificado e mantenha um intestino apropriado para corresponder ao tamanho da seção transversal do coto retal distal.
   3. Reforce a bolsa em forma de J com 8-0 costura se necessário. O comprimento da bolsa J deve estar dentro da faixa de 2.5 cm a 3.5 cm.
4. Realize a anastomose ileal-bolsa-anal, IPAA.
   1. Confirme a ausência de torção no mesentério e suture as paredes laterais da formiga da abertura da bolsa e a parede lateral do coto retal em intervalos com um 8-0 fio de sutura para tração.
   2. Por fim, aplique uma sutura de bloqueio contínua de camada completa nas paredes anterior e posterior.
   3. Verifique a ausência de sangramento ativo e limpe fisiologicamente a cavidade abdominal com solução salina normal. Feche sequencialmente a fáscia muscular abdominal e a pele com suturas 4-0.
5. Realize o manejo pós-operatório.
   1. Administre cetoprofeno como analgesia pós-operatória (40 mg / kg, por via subcutânea) a todos os ratos após o fechamento abdominal. Certifique-se de que o rato seja aquecido com uma lâmpada elétrica até que ocorra a restauração.
   2. Restringir o consumo alimentar do animal por um período mínimo de 72 h no pós-operatório para reduzir o risco de obstrução intestinal. Permita o acesso a uma dieta de 5% de glicose ad libitum para repor rapidamente a energia e os fluidos corporais e ajuste a frequência de alimentação de acordo com os padrões de defecação.
   3. Uma semana após a cirurgia, comece com nutrição limitada e aumente gradualmente a quantidade consumida. Em seguida, forneça aos ratos ração regular para roedores consumirem livremente, mantendo um registro diário de sua ingestão alimentar, ingestão de água e peso corporal.

4. Estabelecimento de modelo de bolsite ileal de rato com DSS

1. Realize o agrupamento experimental.
   1. Atribua aleatoriamente 12 ratos submetidos à ressecção colorretal total e cirurgia IPAA no grupo IPAA (Grupo A, n = 6) e no grupo bolsite (Grupo B, n = 6).
   2. Prepare uma solução de DSS a 4% adicionando 4 g de DSS a 100 mL de água pura, preparada na hora diariamente.
   3. Administre o grupo IPAA e o grupo bolsite com água pura ou DSS a 4% no 31º dia de pós-operatório ao 35º dia, respectivamente. Permita que os ratos bebam e comam livremente comida de rato durante os quatro dias consecutivos de administração.
2. Efectue a recolha de amostras em bolsa.
   1. Na manhã do dia 35, após a operação, anestesiar os ratos com injeção intraperitoneal de solução de pentobarbital sódico a 1%, administrando uma dose de 6 mL/kg (seguindo protocolos aprovados institucionalmente).
   2. Corte a bolsa perpendicularmente do estoma da bolsa até a junção das bolsas de entrada e saída em cada grupo. Obtenha a amostra da bolsa.
   3. Abra a bolsa ao longo da linha de sutura da parede anterior e lave o canal intestinal com solução salina.
   4. Coloque um fragmento de tecido da bolsa em um tubo de microcentrífuga e refrigere-o imediatamente a -80 °C. Use esta parte para detecção ELISA de indicadores inflamatórios. Fixe a seção restante da bolsa com formaldeído a 10% para pontuação histopatológica e coloração imuno-histoquímica.
   5. Finalmente, eutanasiar o rato por embolia gasosa sob anestesia profunda (seguindo protocolos aprovados institucionalmente).

5. Análise histológica

1. Depois de adquirir o tecido da bolsa do rato, mergulhe-o em paraformaldeído a 4% por 24 h. Posteriormente, prossiga com os protocolos de desidratação e incorporação. Corte o tecido processado para exame histológico¹⁶.
2. Aplique coloração de hematoxilina e eosina para identificar diferenças histopatológicas entre os grupos. Examine as amostras microscopicamente e capture fotografias para documentação.

6. Ensaio imuno-histoquímico

1. Desparafine e desidrate as seções de tecido com cuidado. Em seguida, realize a recuperação do antígeno resfriando as seções em solução de citrato de sódio e bloqueando-as com soro bloqueador por 20 min.
2. Em seguida, expor as fatias ao anticorpo anti-oclusina primário e incubá-las durante a noite a 4 °C. Em seguida, trate-os com anticorpos secundários por 30 minutos antes da contracoloração da hematoxilina¹⁶.
3. Depois que as fatias estiverem secas, observe-as e fotografe-as ao microscópio óptico.

7. Teste ELISA

1. 7.1 Pique e homogeneize os fragmentos de tecido em tampão de lise usando sonicação para garantir uma homogeneização completa. Utilize o sobrenadante resultante para detecção.
2. Aloque poços para brancos, amostras e réplicas por grupo. Determinar a concentração de proteínas lendo a absorvância a 450 nm (valor OD) e efectuando uma análise de regressão linear¹⁶.

Resultados

Avaliação do estado geral de ratos modelo bolsa ileal após o estabelecimento
Após o operador passar pela curva de aprendizado cirúrgico do IPAA, os ratos toleraram bem a cirurgia, com duração cirúrgica de 192,94 min ± 27,15 min, e ocorreram menos complicações pós-operatórias. Durante o período pós-operatório imediato, os ratos experimentaram uma diminuição na ingestão alimentar, mas seu apetite pré-operatório foi restaurado dentro de 10 dias a 14 ...

Discussão

A colite ulcerativa () é uma inflamação intestinal crônica caracterizada por dor epigástrica recorrente, diarreia e fezes com muco sanguinolento. Afeta principalmente o reto e pode envolver o cólon em progressão em graus variados. A cirurgia desempenha um papel crucial no manejo da colite ulcerativa 17,18,19. Desde que Parks et ^al.20 introduziram a colectomia total...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anhydrous ethanol	Tianjin Fengchuan Chemical Reagent Technology Co., Ltd	China	Hematoxin-eosin Staining
Dextran Sulfate Sodium	Yeasen	60316ES76	Used to induce pouch inflammation
Formaldehyde solution	Tianjin Zhiyuan Reagent Company	China	Hematoxin-eosin Staining
Gauze	Jiangxi Zhonggan Medical Equipment Company	China	Used for animal microsurgery
Hematoxylin	Beijing Zhongshan Jinqiao Company	China	Hematoxin-eosin Staining
Interferon γ  Detection reagent kit	Cloud-clone	SEA049Ra	Detecting inflammatory factors
Interleukin-10 detection kit	Cloud-clone	SEA056Ra	Detecting inflammatory factors
Interleukin-17 detection kit	Cloud-clone	SEA063Ra	Detecting inflammatory factors
Interleukin-6 detection kit	Cloud-clone	SEA079Ra	Detecting inflammatory factors
Iodophor	Tangpai Medical Equipment Co., Ltd	China	Used for animal microsurgery
Microscopic manipulation instruments	Aesculap	Germany	Used for animal microsurgery
Occludin	abcam	ab216327	Immunohistochemical testing
Sewing needle	Yangzhou Fuda Medical Equipment Co., Ltd	China	Used for animal microsurgery
tumor necrosis factor α Detection reagent kit	Cloud-clone	SEA133Ra	Detecting inflammatory factors
Two person binocular surgical microscope	OPTON	Germany	Used for animal microsurgery
Xylene	Tianjin Yingda Rare and Precious Reagent Factory	China	Hematoxin-eosin Staining