Ein Rattenmodell der Pouchitis nach Proktokolektomie und ilealer Pouch-Analanastomose unter Verwendung von Dextransulfat-Natrium

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Methode zur Etablierung eines Rattenmodells für Pouchitis. Das Modell des Ileumbeutels wurde durch die Durchführung einer Ileumbeutel-Analanastomose (IPAA) mit mikrochirurgischen Techniken hergestellt. Nach der Operation wurde die Ratte 4 Tage lang mit 4% Dextransulfat-Natrium (DSS) behandelt.

Zusammenfassung

Colitis ulcerosa (UC) ist eine chronische immunvermittelte Erkrankung, die den gesamten Dickdarm und das Rektum mit einem schubförmigen und remittierenden Verlauf betrifft und eine lebenslange Morbidität verursacht. Wenn die medizinische Behandlung unwirksam ist, insbesondere bei massiven gastrointestinalen Blutungen, Perforationen, toxischem Megakolon oder Karzinogenese, wird eine Operation zur letzten Verteidigungslinie zur Heilung von UC. Die totale kolorektale Resektion und die ileale Pouch-Anal-Anastomose (IPAA) bieten die besten Chancen für eine langfristige Behandlung. Die Pouchitis ist die häufigste und lästigste postoperative Komplikation. In dieser Untersuchung wird die Mikrochirurgie eingesetzt, um ein Ileumbeutelmodell bei Versuchsratten mittels IPAA-Operation zu erzeugen. Anschließend wird ein anhaltendes Rattenmodell der Pouchitis etabliert, indem eine Entzündung des Ileumbeutels mit Dextransulfat-Natrium (DSS) induziert wird. Die erfolgreiche Etablierung der Rattenpouchitis wird durch die Analyse des postoperativen Allgemeinzustands, des Gewichts, der Nahrungs- und Wasseraufnahme, der Stuhldaten sowie der Pathologie des Pouch-Gewebes, der Immunhistochemie und der Analyse von Entzündungsfaktoren validiert. Dieses experimentelle Tiermodell der Pouchitis bietet eine Grundlage für die Untersuchung der Pathogenese und Behandlung der Erkrankung.

Einleitung

Pouchitis ist eine unspezifische Entzündung, die den Ileumbeutel betrifft und eine häufige Komplikation nach totaler Proktokolektomie und Ileumbeutel-Analanastomose (IPAA) bei Personen mit Colitis ulcerosa (UC) ^ist1,2,3. Diese Erkrankung hat eine relativ hohe Häufigkeit von bis zu 50% und kann verschiedene klinische Manifestationen verursachen, darunter Durchfall, Bauchschmerzen, fäkaler Blutverlust und Fieber. Die genaue Ursache der Pouchitis bleibt schwer fassbar, obwohl einige Forscher glauben, dass eine Verschiebung der Pouch-Flora eine Immunaktivierung und eine anschließende Entzündung auslösen kann 4,5,6,7.

Aufgrund der Herausforderungen, die mit der Durchführung klinischer Studien zu Pouchitis verbunden sind, können Tiermodelle als wertvolle Werkzeuge für die Untersuchung von Pouchitis-Medikamenten und -Mechanismen dienen. Es gibt wachsende Bedenken hinsichtlich der Bildung von Ileumbeuteln von Ratten, wobei Berichte auf eine mögliche Entzündung hinweisen⁸. Die Forschung auf diesem Gebiet ist jedoch aufgrund der Komplexität des Herstellungsprozesses, für den es keine klaren Richtlinien gibt, nach wie vor spärlich ^9,10. Im Jahr 1998 war Lichtman der erste, der ein ileales Beutelmodell bei Lewis-Ratten und Sprague-Dawley-Ratten (SD) etablierte, indem er eine totale Kolektomie¹¹ durchführte. Sie beobachteten eine Makrophageninfiltration, Schleimhautgeschwüre und eine Zunahme der anaeroben Bakterienflora im Darm dieser Ratten, was eine solide Grundlage für weitere Forschungen über Ileumbeutelentzündungen bildete. Dieses experimentelle Modell der Ratten-Pouchitis ahmt die physikalischen Anzeichen und zugrunde liegenden Mechanismen, die bei der menschlichen Pouchitis beobachtet werden, genau nach.

Zu den häufig verwendeten präklinischen Modellen für Colitis ulcerosa gehören die DSS- und TNBS-Modelle. Die induzierende Chemikalie 2,4,6-Trinitrobenzolsulfonsäure (TNBS) simuliert typischerweise Morbus Crohn¹². Das DSS-Modell, das für seine Wirksamkeit, sein Sicherheitsprofil und seine Erschwinglichkeit geschätzt wird, wird aufgrund der beobachteten offensichtlichen Symptome häufig als zuverlässiges Werkzeug für die UC-Induktion verwendet. Aufgrund der Besiedlung des Pouchgewebes konnten wir erfolgreich ein Pouchitis-Modell mit DSS^13,14 induzieren.

In der vorliegenden Studie wurde mittels Mikrochirurgie erfolgreich ein Ileumbeutelmodell bei Versuchsratten mittels IPAA-Operation erstellt. Anschließend wurde ein anhaltendes Ratten-Pouchitis-Modell etabliert, indem eine Entzündung des Ileumbeutels mit DSS induziert wurde. Genauigkeit während der Operation ist entscheidend für eine erfolgreiche Modellbildung, und auch die postoperative Versorgung ist von entscheidender Bedeutung. Dieses Modell kann verwendet werden, um die Pathogenese der Pouchitis zu untersuchen, potenzielle Therapeutika zu bewerten und unser Verständnis dieser komplexen Erkrankung zu verbessern. Die Studie rationalisiert das Herstellungsverfahren für Ileumbeutel, verkürzt die Operationsdauer und steigert die Effizienz, wodurch eine solide Grundlage für die Grundlagenforschung zu postoperativen Beutelerkrankungen geschaffen wird.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Ethikkommissionen des Allgemeinen Krankenhauses der Medizinischen Universität Tianjin durchgeführt. Für diese Studie wurden männliche Sprague-Dawley-Ratten im Alter zwischen 9 und 12 Wochen mit einem Gewicht von etwa 320-360 g verwendet. Die Einzelheiten zu den verwendeten Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Auswahl und Pflege der Tiere

1. Wählen Sie ein gesundes Tier (Körpergewicht von ~220-240 g).
2. Stellen Sie sicher, dass sie die Kriterien eines spezifischen Pathogen-freien (LSF)^15-Gehalts erfüllen und mindestens 2 Wochen lang adaptiv in einer Umgebung mit ausreichender Belüftung (8 bis 12 Luftwechsel pro Stunde), einer angenehmen Temperatur (20-25 °C), einer angemessenen Luftfeuchtigkeit (40 %-70 %), minimalem Lärm (unter 70 Dezibel) und einem natürlichen Lichtzyklus (12 Stunden Licht und 12 Stunden Dunkelheit) aufgezogen werden.
3. Halten Sie sie während dieser Zeit in sauberen Standardkäfigen mit einer Dichte von drei bis fünf pro Käfig und wechseln Sie die Einstreu zweimal wöchentlich. Bieten Sie ad libitum Zugang zu Futter und Wasser sowie Standard-Erhaltungsfutter für Laborratten.

2. Präoperative Vorbereitung

1. Wählen Sie eine gesunde Ratte mit einem ungefähren Körpergewicht von 320 g bis 360 g. Fasten Sie die Ratte 8-12 Stunden vor der Operation und verschaffen Sie ihnen Zugang zu einer Lösung aus physiologischer Kochsalzlösung und 5% Glukose im Verhältnis 1:1 für den freiwilligen Verzehr.
2. Bereiten Sie die autoklavierten mikrochirurgischen Instrumente vor (präoperatives Einweichen in Alkohol für 1 h), ein Mikroskop, einen Präpariertisch für Ratten, 8-0 Nicht resorbierbares hochmolekulares Nahtmaterial, nicht resorbierbares 4-0-Nahtmaterial, sterile Gaze, sterile Wattestäbchen usw.

3. Etablierung des Modells der Ratten-Ileumbeutel

1. Intraperitoneal injizieren Sie eine 1%ige Pentobarbital-Natriumlösung in einer Dosis von 6 ml/kg und inzisionale Infiltration einer Lokalanästhesie mit 0,5% Ropivacain, um die Ratte zu betäuben. Halten Sie die Ratte während der Narkose mit einer elektrischen Lampe auf einer angenehmen Temperatur.
2. Führen Sie eine vollständige kolorektale Resektion mit den folgenden Schritten durch:
   1. Befestigen Sie die Ratte in dorsaler Liege auf einer anatomischen Bank nach einem zufriedenstellenden Anästhesieprotokoll. Bestätigen Sie die Tiefe der Anästhesie durch ein Zehenkneifen. Verwenden Sie einen Rasierschneider, um Haarreste zu entfernen, und tragen Sie die Jodophorlösung zweimal für die Sterilisation vor Ort auf.
   2. Machen Sie einen etwa 6 cm langen Schnitt in der Mittellinie, um die Haut, die Faszie der weißen Linie und das Bauchfell zu durchtrennen und den Zugang in die Bauchhöhle zu ermöglichen. Verwenden Sie einen Retraktor, um die Peritonealoberfläche freizulegen, und bedecken Sie sie mit bakteriostatischer, mit Kochsalzlösung getränkter steriler Gaze.
   3. Isolieren Sie den Gefäßfluss des terminalen Jejunums, ligieren Sie seinen Ursprung mit einem 8-0 Nähen Sie den Faden und durchtrennen Sie ihn anschließend. Setzen Sie den Blinddarmstumpf, der sich 1-2 cm von der Ileozökalklappe entfernt befindet, in Ruhe und durchtrennen Sie ihn.
   4. Beginnen Sie mit der Resektion des rechten Hemikolons, wobei das rechte Hemikolon und die mittlere Kolikvene konservativ ligiert werden.
   5. Segregieren Sie die Arteria mesenterica inferior weiter und isolieren Sie die Arteria rectalis inferior. Setzen Sie die Isolation entlang des Rektums bis zu einem Abstand von zwei Zentimetern vom Analrand fort. Das distale Rektum wird in einem Winkel von etwa 45 Grad schräg reseziert, um eine postoperative Stenose zu vermeiden.
3. Führen Sie die J-Beutelkonstruktion durch.
   1. Trennen Sie mit einem Mikrotomskalpell den Querschnitt des terminalen Ileums vom Mesenterialdarm, der etwa 6-7 cm messen sollte.
   2. Falten Sie das terminale Ileum in einer J-förmigen Form, um einen Beutel für das Ileum zu erstellen. Führen Sie die Anastomose der hinteren Wand über einen ineinandergreifenden Stich durch. Augmentieren Sie die Vorderwand mit einem modifizierten Connell-Stich und behalten Sie einen geeigneten Darm bei, der der Querschnittsgröße des distalen Rektumstumpfes entspricht.
   3. Verstärken Sie den J-förmigen Beutel mit 8-0 Bei Bedarf nähen. Die Länge des J-Beutels sollte im Bereich von 2,5 cm bis 3,5 cm liegen.
4. Führen Sie eine ileale Pouch-Analanastomose (IPAA) durch.
   1. Bestätigen Sie, dass das Mesenterium keine Torsion aufweist, und nähen Sie die Seitenwände der Beutelöffnung und die Seitenwand des Rektumstumpfes in Abständen mit einem 8-0 Nahtfaden für Traktion.
   2. Wenden Sie abschließend eine vollschichtige durchgehende Naht sowohl an der Vorder- als auch an der Hinterwand an.
   3. Vergewissern Sie sich, dass keine aktiven Blutungen vorhanden sind, und reinigen Sie die Bauchhöhle physiologisch mit normaler Kochsalzlösung. Verschließen Sie nacheinander die Bauchmuskulatur, die Faszie und die Haut mit 4-0-Nähten.
5. Führen Sie ein postoperatives Management durch.
   1. Verabreichen Sie Ketoprofen als postoperative Analgesie (40 mg/kg, subkutan) an alle Ratten nach dem Verschluss des Bauches. Stellen Sie sicher, dass die Ratte mit einer elektrischen Lampe erwärmt wird, bis die Wiederherstellung erfolgt.
   2. Beschränken Sie das Tier für einen Zeitraum von mindestens 72 Stunden postoperativ auf den Verzehr von Lebensmitteln, um das Risiko eines Darmverschlusses zu verringern. Ermöglichen Sie den Zugang zu einer Ernährung mit 5% Glukose ad libitum, um Energie und Körperflüssigkeiten schnell wieder aufzufüllen, und passen Sie die Fütterungshäufigkeit an die Defäkationsmuster an.
   3. Beginnen Sie eine Woche nach der Operation mit einer begrenzten Ernährung und erhöhen Sie allmählich die verzehrte Menge. Geben Sie den Ratten dann regelmäßig Nagetierfutter, damit sie frei konsumieren können, während Sie täglich Aufzeichnungen über ihre Nahrungsaufnahme, Wasseraufnahme und ihr Körpergewicht führen.

4. Etablierung eines Modells der ilealen Pouchitis der Ratte mit DSS

1. Führen Sie die experimentelle Gruppierung durch.
   1. 12 Ratten, die sich einer totalen kolorektalen Resektion und IPAA-Operation unterzogen haben, werden nach dem Zufallsprinzip in die IPAA-Gruppe (Gruppe A, n = 6) und die Pouchitis-Gruppe (Gruppe B, n = 6) eingeteilt.
   2. Bereiten Sie eine 4%ige DSS-Lösung vor, indem Sie 4 g DSS zu 100 ml reinem Wasser hinzufügen, das täglich frisch zubereitet wird.
   3. Verabreichen Sie die IPAA-Gruppe und die Pouchitis-Gruppe mit reinem Wasser oder 4 % DSS am postoperativen Tag 31 bzw. Tag 35. Lassen Sie Ratten während der vier aufeinanderfolgenden Tage der Verabreichung frei trinken und fressen.
2. Führen Sie die Beutelprobenahme durch.
   1. Am Morgen des 35. Tages, nach der Operation, betäuben Sie die Ratten mit einer intraperitonealen Injektion von 1% iger Pentobarbital-Natriumlösung und verabreichen Sie eine Dosis von 6 ml/kg (gemäß den institutionell anerkannten Protokollen).
   2. Trennen Sie den Beutel senkrecht vom Stoma des Beutels bis zur Verbindung der Eingabe- und Ausgabebeutel in jeder Gruppe. Besorgen Sie sich das Beutelmuster.
   3. Öffnen Sie den Beutel entlang der Nahtlinie der Vorderwand und waschen Sie den Darmkanal mit Kochsalzlösung.
   4. Legen Sie ein Fragment des Beutelgewebes in ein Mikrozentrifugenröhrchen und kühlen Sie es umgehend bei -80 °C. Verwenden Sie diesen Teil für den ELISA-Nachweis von Entzündungsindikatoren. Fixieren Sie den verbleibenden Beutelabschnitt mit 10 % Formaldehyd für histopathologische Ritzungen und immunhistochemische Färbungen.
   5. Zum Schluss wird die Ratte durch eine Luftembolie unter tiefer Betäubung eingeschläfert (nach institutionell anerkannten Protokollen).

5. Histologische Analyse

1. Nachdem Sie der Ratte Beutelgewebe entnommen haben, tauchen Sie es 24 Stunden lang in 4% Paraformaldehyd. Fahren Sie anschließend mit den Dehydratisierungs- und Einbettungsprotokollen fort. Schnitt des aufbereiteten Gewebes für die histologische Untersuchung¹⁶.
2. Wenden Sie Hämatoxylin- und Eosin-Färbung an, um histopathologische Unterschiede zwischen den Gruppen zu identifizieren. Untersuchen Sie die Proben mikroskopisch und machen Sie Fotos für die Dokumentation.

6. Immunhistochemischer Assay

1. Entwachse und dehydriere die Gewebeabschnitte vorsichtig. Führen Sie dann eine Antigen-Entnahme durch, indem Sie die Abschnitte in Natriumcitratlösung abkühlen und sie 20 Minuten lang mit blockierendem Serum blockieren.
2. Anschließend werden die Scheiben dem primären Anti-Occludin-Antikörper ausgesetzt und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Behandeln Sie sie anschließend 30 Minuten lang mit Sekundärantikörpern, bevor Sie eine Hämatoxylin-Gegenfärbung^{vornehmen 16}.
3. Sobald die Scheiben getrocknet sind, beobachten und fotografieren Sie sie unter einem Lichtmikroskop.

7. ELISA-Prüfung

1. 7.1 Zerkleinern und homogenisieren Sie die Gewebefragmente im Lysepuffer mittels Ultraschall, um eine gründliche Homogenisierung zu gewährleisten. Verwenden Sie den resultierenden Überstand für die Detektion.
2. Ordnen Sie Wells für Leerproben, Proben und Replikate pro Gruppe zu. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration, indem Sie die Extinktion bei 450 nm (OD-Wert) ablesen und eine lineare Regressionsanalyse^{durchführen 16}.

Ergebnisse

Allgemeine Zustandsbewertung von Ratten mit Ileumbeutelmodellen nach der Etablierung
Nachdem der Bediener die chirurgische Lernkurve der IPAA durchlaufen hatte, vertrugen die Ratten die Operation gut, mit einer Operationsdauer von 192,94 min ± 27,15 min, und es traten weniger postoperative Komplikationen auf. Während der frühen postoperativen Phase kam es bei Ratten zu einer Abnahme der Nahrungsaufnahme, aber ihr präoperativer Appetit wurde innerhalb von 10 Tagen ...

Diskussion

Colitis ulcerosa (UC) ist eine chronische Darmentzündung, die durch wiederkehrende Magenschmerzen, Durchfall und blutigen Schleimstuhl gekennzeichnet ist. Sie betrifft in erster Linie den Enddarm und kann den fortschreitenden Dickdarm in unterschiedlichem Maße betreffen. Die Chirurgie spielt eine entscheidende Rolle bei der Behandlung von UC 17,18,19. Seit Parks et ^al.20

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anhydrous ethanol	Tianjin Fengchuan Chemical Reagent Technology Co., Ltd	China	Hematoxin-eosin Staining
Dextran Sulfate Sodium	Yeasen	60316ES76	Used to induce pouch inflammation
Formaldehyde solution	Tianjin Zhiyuan Reagent Company	China	Hematoxin-eosin Staining
Gauze	Jiangxi Zhonggan Medical Equipment Company	China	Used for animal microsurgery
Hematoxylin	Beijing Zhongshan Jinqiao Company	China	Hematoxin-eosin Staining
Interferon γ  Detection reagent kit	Cloud-clone	SEA049Ra	Detecting inflammatory factors
Interleukin-10 detection kit	Cloud-clone	SEA056Ra	Detecting inflammatory factors
Interleukin-17 detection kit	Cloud-clone	SEA063Ra	Detecting inflammatory factors
Interleukin-6 detection kit	Cloud-clone	SEA079Ra	Detecting inflammatory factors
Iodophor	Tangpai Medical Equipment Co., Ltd	China	Used for animal microsurgery
Microscopic manipulation instruments	Aesculap	Germany	Used for animal microsurgery
Occludin	abcam	ab216327	Immunohistochemical testing
Sewing needle	Yangzhou Fuda Medical Equipment Co., Ltd	China	Used for animal microsurgery
tumor necrosis factor α Detection reagent kit	Cloud-clone	SEA133Ra	Detecting inflammatory factors
Two person binocular surgical microscope	OPTON	Germany	Used for animal microsurgery
Xylene	Tianjin Yingda Rare and Precious Reagent Factory	China	Hematoxin-eosin Staining