מודל חולדה של פאוצ'יטיס לאחר כריתת פרוקטוקולקטומיה ואנסטומוזה אנאלי של כיס איליאלי באמצעות דקסטרן סולפט נתרן

Summary

פרוטוקול זה מתאר את השיטה להקמת מודל חולדה של pouchitis. מודל השקית האיליאלית נוצר על ידי ביצוע ניתוח אנסטומוזה אנאלי (IPAA) באמצעות טכניקות מיקרוכירורגיות. לאחר הניתוח, החולדה טופלה ב-4% דקסטרן סולפט נתרן (DSS) במשך 4 ימים.

Abstract

קוליטיס כיבית (UC) היא מחלה כרונית בתיווך מערכת החיסון הפוגעת בכל המעי הגס ופי הטבעת במסלול התקפי והפוגתי, וגורמת לתחלואה לכל החיים. כאשר הטיפול הרפואי אינו יעיל, במיוחד במקרים של דימום מסיבי במערכת העיכול, ניקוב, מגה-קולון רעיל או סרטן, ניתוח הופך לקו ההגנה האחרון לריפוי UC. כריתה כוללת של המעי הגס ואנסטומוזיס אנאלי (IPAA) מציעים את הסיכוי הטוב ביותר לטיפול ארוך טווח. פוצ'יטיס הוא הסיבוך הנפוץ והבעייתי ביותר לאחר הניתוח. במחקר זה, מיקרו-כירורגיה משמשת ליצירת מודל כיס איליאלי בחולדות ניסיוניות באמצעות ניתוח IPAA. לאחר מכן, מודל חולדה מתמשך של pouchitis נקבע על ידי גרימת דלקת של שקיק ileal עם נתרן dextran סולפט (DSS). ההקמה המוצלחת של פאוצ'יטיס חולדה מאומתת באמצעות ניתוח של מצב כללי לאחר הניתוח, משקל, צריכת מזון ומים, נתוני צואה, כמו גם פתולוגיה של רקמת כיס, אימונוהיסטוכימיה וניתוח גורמים דלקתיים. מודל ניסיוני זה של בעלי חיים של pouchitis מספק בסיס לחקר הפתוגנזה והטיפול במצב.

Introduction

פוצ'יטיס היא דלקת לא ספציפית המשפיעה על כיס האיליאלי והיא סיבוך שכיח לאחר כריתת פרוקטוקולקטומיה מלאה ואנסטומוזיס אנאלי של כיס איליאלי (IPAA) אצל אנשים עם קוליטיס כיבית (UC)^1,2,3. מצב זה הוא בעל שיעור התרחשות גבוה יחסית של עד 50% ועלול לגרום לביטויים קליניים שונים, כולל שלשולים, כאבי בטן, איבוד דם בצואה וחום. הגורם המדויק לפוצ'יטיס נותר חמקמק, אם כי כמה חוקרים מאמינים כי שינוי בפלורה של השקית עשוי לעורר הפעלה חיסונית ולאחר מכן דלקת 4,5,6,7.

בשל האתגרים הקשורים בביצוע ניסויים קליניים על pouchitis, מודלים של בעלי חיים יכולים לשמש כלים יקרי ערך לחקר תרופות ומנגנונים של pouchitis. ישנם חששות גוברים לגבי יצירת שקיות חולדה, עם דיווחים המצביעים על דלקת אפשרית⁸. עם זאת, המחקר בתחום זה נותר דליל בשל אופיו המורכב של תהליך הייצור, אשר חסר הנחיות ברורות ^9,10. בשנת 1998, ליכטמן היה הראשון שהקים מודל של פאוץ' איליאלי בחולדות לואיס וחולדות ספראג-דולי (SD) על ידי ביצוע כריתת קולקטומיה¹¹ כוללת. הם הבחינו בחדירת מקרופאגים, כיב רירית ועלייה בפלורה חיידקית אנאירובית בתוך המעיים של חולדות אלה, מה שסיפק בסיס מוצק למחקר נוסף על דלקת כיסי איליאלית. מודל ניסיוני זה של פאוצ'יטיס חולדה מחקה באופן הדוק את הסימנים הפיזיים ואת המנגנונים הבסיסיים שנצפו בפוצ'יטיס אנושית.

מודלים נפוצים של קוליטיס כיבית פרה-קלינית כוללים את המודלים DSS ו-TNBS. הכימיקל המשרה 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS) מדמה בדרך כלל מחלת קרוהן¹². מודל DSS, המכובד בשל יעילותו, פרופיל הבטיחות והמחיר המשתלם שלו, משמש לעתים קרובות ככלי אמין להשראת UC בשל הסימפטומים הברורים שנצפו. בהתחשב בהתיישבות של רקמת השקית, גרמנו בהצלחה מודל פאוצ'יטיס באמצעות DSS^13,14.

במחקר הנוכחי, מיקרו-כירורגיה שימשה ליצירת מודל מוצלח של שקיק איליאלי בחולדות ניסיוניות באמצעות ניתוח IPAA. לאחר מכן, מודל מתמשך של פאוצ'יטיס חולדה נקבע על ידי גרימת דלקת של כיס איליאלי עם DSS. דיוק במהלך הניתוח חיוני ליצירת מודל מוצלח, וטיפול לאחר הניתוח הוא חיוני גם כן. מודל זה יכול לשמש כדי לחקור את הפתוגנזה של pouchitis, להעריך סוכנים טיפוליים פוטנציאליים, ולקדם את הבנתנו של מצב מורכב זה. המחקר מייעל את הליך ייצור השקיות, מקצר את משך הפעולה ומגביר את היעילות, ובכך מבסס בסיס איתן למחקר בסיסי בהפרעות שקיות לאחר ניתוח.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם למדיניות של ועדות האתיקה של בית החולים הכללי של האוניברסיטה הרפואית בטיאן-ג'ין. במחקר זה נעשה שימוש בחולדות Sprague-Dawley זכרים בגילאי 9 עד 12 שבועות, במשקל של כ-320-360 גרם. פרטי הריאגנטים והציוד בהם נעשה שימוש מפורטים בטבלת החומרים.

1. בחירת בעלי חיים ותחזוקתם

1. בחר חיה בריאה (משקל גוף של ~ 220-240 גרם).
2. ודא שהם עומדים בקריטריונים של רמה ספציפית ללא פתוגן (SPF)¹⁵ ומגודלים באופן אדפטיבי למשך שבועיים לפחות בסביבה עם אוורור הולם (8 עד 12 החלפות אוויר בשעה), טמפרטורה נוחה (20-25 מעלות צלזיוס), לחות מתאימה (40%-70%), רעש מינימלי (מתחת ל-70 דציבלים) ומחזור אור טבעי (12 שעות אור ו-12 שעות חושך).
3. במהלך תקופה זו, אכסנו אותם בכלובים נקיים סטנדרטיים בצפיפות של שלושה עד חמישה בכל כלוב, והחליפו את המצעים פעמיים בשבוע. לספק גישה למזון ולמים, כמו גם הזנת תחזוקה סטנדרטית לחולדות מעבדה.

2. הכנה טרום ניתוחית

1. בחר חולדה בריאה עם משקל גוף משוער של 320 גרם עד 360 גרם. צמו את החולדה במשך 8-12 שעות לפני הניתוח וספקו גישה לתמיסה של מי מלח פיזיולוגיים ו-5% גלוקוז ביחס של 1:1 לצריכה רצונית.
2. הכינו את המכשירים המיקרוכירורגיים האוטוקלאביים (השרייה לפני הניתוח באלכוהול למשך שעה), מיקרוסקופ, שולחן ניתוח חולדות, 8-0 תפר מולקולרי גבוה שאינו נספג, תפר 4-0 שאינו נספג, גזה סטרילית, צמר גפן סטרילי וכו '.

3. הקמת דגם כיס החולדה

1. הזרקה תוך-צפקית של תמיסת נתרן פנטוברביטלית 1% במינון של 6 מ"ל/ק"ג וחתך בהרדמה מקומית עם 0.5% רופיוואקאין להרדמת החולדה. שמור על החולדה בטמפרטורה נוחה במהלך ההרדמה עם מנורה חשמלית.
2. בצע כריתה כוללת של המעי הגס לפי השלבים הבאים:
   1. אבטחו את החולדה בשכיבה גבית על ספסל אנטומי בעקבות פרוטוקול הרדמה משביע רצון. יש לוודא את עומק ההרדמה באמצעות צביטת בוהן. השתמשו בקוצצי גילוח כדי לסלק לכלוך שיער, ומרחו פעמיים תמיסת יודופור לעיקור שדה כירורגי.
   2. בצעו חתך בקו האמצע, באורך של כ-6 ס"מ, כדי לנתח דרך העור, הפאשיה הלבנה והצפק, ולספק כניסה לחלל הבטן. השתמש retractor כדי לחשוף את משטח הצפק ולכסות אותו עם גזה סטרילית ספוגת מלוחים bacteriostatic.
   3. לבודד את זרימת כלי הדם של jejunum הטרמינל, ligate מקורו באמצעות 8-0 חוט התפר, ולאחר מכן לנתק אותו. הגדר את הגדם הצקאלי, הממוקם 1-2 ס"מ מהשסתום האילאוצקלי, במנוחה, ולאחר מכן נתק אותו.
   4. להתחיל כריתה של המעי הגס הימני, לקשור את ההמיקולון הימני ואת וריד המעי האמצעי באופן שמרני.
   5. הפרדה נוספת של העורק המזנטרי התחתון ובידוד העורק הרקטלי התחתון. המשיכו בבידוד במורד פי הטבעת עד למרווח השווה לשני סנטימטרים מפי הטבעת. יש לכרות באלכסון את פי הטבעת הדיסטלי בסביבות 45 מעלות כדי למנוע היצרות לאחר הניתוח.
3. בצע בניית פאוץ' J.
   1. השתמש אזמל microtome כדי להפריד את החלק הרוחבי של ileum מסוף המעי mesentery, אשר צריך למדוד על 6-7 ס"מ.
   2. קפלו את האילאום הטרמינלי בצורה בצורת J כדי ליצור פאוץ' לאילאום. ביצוע אנסטומוזה של הקיר האחורי באמצעות תפר משתלב. הגדילו את הדופן הקדמית באמצעות תפר קונל שונה ושמרו על מעי מתאים שיתאים לגודל החתך של גדם פי הטבעת הדיסטלי.
   3. חזקו את השקית בצורת J עם 8-0 תפירה במידת הצורך. אורך שקית J צריך להיות בטווח של 2.5 ס"מ עד 3.5 ס"מ.
4. לבצע anstomosis אנאלי כיס ileal, IPAA.
   1. לאשר את היעדר פיתול במזנטריה ולתפור את הדפנות הצדדיות של פתח השקית ואת הדופן הצידית של גדם פי הטבעת במרווחים עם 8-0 חוט תפירה למתיחה.
   2. בסופו של דבר, יש למרוח תפר נעילה רציף בשכבה מלאה הן על הדופן הקדמית והן על הדופן האחורית.
   3. ודא את היעדר הדימום הפעיל ונקה פיזיולוגית את חלל הבטן במי מלח רגילים. סוגרים ברצף את שרירי הבטן והעור עם 4-0 תפרים.
5. בצע ניהול לאחר הניתוח.
   1. מתן קטופרופן כשיכוך כאבים לאחר הניתוח (40 מ"ג / ק"ג, תת עורית) לכל החולדות לאחר סגירת הבטן. ודאו שמחממים את החולדה באמצעות מנורה חשמלית עד לשיקום.
   2. להגביל את בעל החיים מצריכת מזון לתקופה מינימלית של 72 שעות לאחר הניתוח כדי להפחית את הסיכון של חסימת מעיים. לאפשר גישה לתזונה של 5% גלוקוז אד ליביטום, כדי לחדש במהירות אנרגיה ונוזלי גוף, ולהתאים את תדירות ההאכלה בהתאם לדפוסי עשיית צרכים.
   3. שבוע לאחר הניתוח יש להתחיל בתזונה מוגבלת ולהגדיל בהדרגה את הכמות הנצרכת. לאחר מכן, ספקו לחולדות מזון קבוע למכרסמים לצריכה חופשית, תוך שמירה על רישום יומי של צריכת התזונה שלהן, צריכת המים ומשקל הגוף.

4. הקמת מודל פאוצ'יטיס איליאלי חולדה עם DSS

1. בצע את קיבוץ הניסויים.
   1. הקצו באופן אקראי 12 חולדות שעברו כריתה מלאה של המעי הגס וניתוח IPAA לקבוצת IPAA (קבוצה A, n = 6) ולקבוצת הפוצ'יטיס (קבוצה B, n = 6).
   2. הכן תמיסת DSS 4% על-ידי הוספת 4 גרם DSS ל-100 מ"ל מים טהורים, טריים המוכנים מדי יום.
   3. לנהל את קבוצת IPAA ואת קבוצת pouchitis עם מים טהורים או 4% DSS ביום שלאחר הניתוח 31 עד יום 35, בהתאמה. אפשרו לחולדות לשתות ולאכול מזון חולדות בחופשיות במהלך ארבעת הימים הרצופים של מתן התרופה.
2. בצעו את דגימת השקית.
   1. בבוקר היום ה-35, לאחר הניתוח, מרדימים את החולדות בזריקה תוך-צפקית של 1% תמיסת נתרן פנטוברביטל, תוך מתן מינון של 6 מ"ל/ק"ג (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי מוסדות).
   2. נתקו את השקית בניצב מהסטומה של השקית לצומת של שקיות הקלט והפלט בכל קבוצה. השג את דגימת השקית.
   3. פתחו את השקית לאורך קו התפרים של הדופן הקדמית ושטפו את תעלת המעי במי מלח.
   4. מניחים שבר של רקמת שקיק בצינור מיקרוצנטריפוגה ומיד מקררים אותו ב -80 ° C. השתמש בחלק זה לזיהוי ELISA של אינדיקטורים דלקתיים. תקן את החלק הנותר של השקית עם 10% פורמלדהיד לניקוד היסטופתולוגי וצביעה אימונוהיסטוכימית.
   5. לבסוף, הרדימו את החולדה על ידי תסחיף אוויר בהרדמה עמוקה (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו במוסד).

5. ניתוח היסטולוגי

1. לאחר רכישת רקמת כיס מהחולדה, לטבול אותו 4% paraformaldehyde במשך 24 שעות. לאחר מכן, המשך עם התייבשות ופרוטוקולי הטבעה. חתך את הרקמה המעובדת לבדיקה היסטולוגית¹⁶.
2. החל המטוקסילין ו eosin צביעה כדי לזהות הבדלים היסטופתולוגיים בין קבוצות. בחנו את הדגימות במיקרוסקופ וצלמו תמונות לתיעוד.

6. בדיקה אימונוהיסטוכימית

1. יש להתחמק ולייבש את חלקי הרקמה בזהירות. לאחר מכן, בצע שליפת אנטיגן על ידי קירור החלקים בתמיסת נתרן ציטראט וחסימתם בסרום חוסם למשך 20 דקות.
2. לאחר מכן, לחשוף את הפרוסות נוגדן אנטי occludin העיקרי לדגור אותם במשך הלילה ב 4 ° C. לאחר מכן, טפל בהם עם נוגדנים משניים במשך 30 דקות לפני hematoxylin counterstaining¹⁶.
3. לאחר שהפרוסות התייבשו, התבוננו וצלמו אותן תחת מיקרוסקופ אור.

7. מבחן ELISA

1. 7.1 טחון והומוגניזציה של מקטעי הרקמה בחיץ ליזיס באמצעות סוניקציה כדי להבטיח הומוגניזציה יסודית. נצלו את הסופרנאטנט שנוצר לצורך זיהוי.
2. הקצו בארות עבור ריקים, דגימות ושכפולים לכל קבוצה. קבע את ריכוז החלבון על ידי קריאת הספיגה ב 450 ננומטר (ערך OD) וביצוע ניתוח רגרסיה ליניארית¹⁶.

תוצאות

הערכת מצב כללית של חולדות מודל כיס איליאלי לאחר ההקמה
לאחר שהמפעיל עבר את עקומת הלמידה הכירורגית IPAA, החולדות סבלו את הניתוח היטב, עם משך ניתוח של 192.94 דקות ± 27.15 דקות, ופחות סיבוכים לאחר הניתוח התרחשו. במהלך התקופה המוקדמת שלאחר הניתוח, חולדות חוו ירידה בצריכה הת...

Discussion

קוליטיס כיבית (UC) היא דלקת מעיים כרונית המאופיינת בכאבים אפיגסטריים חוזרים, שלשולים וצואה דמית של ריר. זה משפיע בעיקר על פי הטבעת ועשוי לערב את המעי הגס המתקדם בדרגות שונות. ניתוח ממלא תפקיד מכריע בניהול UC 17,18,19. מאז פארקס...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anhydrous ethanol	Tianjin Fengchuan Chemical Reagent Technology Co., Ltd	China	Hematoxin-eosin Staining
Dextran Sulfate Sodium	Yeasen	60316ES76	Used to induce pouch inflammation
Formaldehyde solution	Tianjin Zhiyuan Reagent Company	China	Hematoxin-eosin Staining
Gauze	Jiangxi Zhonggan Medical Equipment Company	China	Used for animal microsurgery
Hematoxylin	Beijing Zhongshan Jinqiao Company	China	Hematoxin-eosin Staining
Interferon γ  Detection reagent kit	Cloud-clone	SEA049Ra	Detecting inflammatory factors
Interleukin-10 detection kit	Cloud-clone	SEA056Ra	Detecting inflammatory factors
Interleukin-17 detection kit	Cloud-clone	SEA063Ra	Detecting inflammatory factors
Interleukin-6 detection kit	Cloud-clone	SEA079Ra	Detecting inflammatory factors
Iodophor	Tangpai Medical Equipment Co., Ltd	China	Used for animal microsurgery
Microscopic manipulation instruments	Aesculap	Germany	Used for animal microsurgery
Occludin	abcam	ab216327	Immunohistochemical testing
Sewing needle	Yangzhou Fuda Medical Equipment Co., Ltd	China	Used for animal microsurgery
tumor necrosis factor α Detection reagent kit	Cloud-clone	SEA133Ra	Detecting inflammatory factors
Two person binocular surgical microscope	OPTON	Germany	Used for animal microsurgery
Xylene	Tianjin Yingda Rare and Precious Reagent Factory	China	Hematoxin-eosin Staining