تزايد كرويات سرطان البنكرياس ثلاثية الأبعاد Desmoplastic من الثقافة المشتركة

Summary

لا يزال سرطان البنكرياس أحد أصعب أنواع السرطان التي يمكن علاجها. لذلك ، من الأهمية بمكان أن تكون النماذج قبل السريرية التي تقيم فعالية العلاج قابلة للتكرار وذات صلة سريريا. يصف هذا البروتوكول إجراء بسيطا للاستزراع المشترك لتوليد كرويات قابلة للتكرار وذات صلة سريريا.

Abstract

يعد سرطان البنكرياس الغدي القنوي (PDAC) أحد أكثر أنواع السرطان فتكا بمعدل بقاء لمدة 5 سنوات يبلغ <12٪. أكبر عائق أمام العلاج هو المصفوفة الكثيفة خارج الخلية (ECM) التي تحيط بالورم وتقلل من الأوعية الدموية ، والتي تسمى عموما desmoplasia. تم اختبار مجموعة متنوعة من تركيبات الأدوية والتركيبات لعلاج السرطان ، وعلى الرغم من أن العديد منها يظهر نجاحا قبل السريري ، إلا أنها تفشل سريريا. لذلك ، يصبح من المهم أن يكون لديك نموذج مناسب سريريا متاح يمكنه التنبؤ باستجابة الورم للعلاج. تم التحقق من صحة هذا النموذج مسبقا ضد الأورام السريرية المقطوعة. هنا يتم وصف بروتوكول بسيط لزراعة كرويات ثلاثية الأبعاد (3D) يمكن أن تولد بشكل طبيعي ECM قوي ولا تتطلب أي مصادر مصفوفة خارجية أو سقالة لدعم نموها.

لفترة وجيزة تستخدم خلايا نجمية البنكرياس البشرية (HPaSteC) وخلايا PANC-1 لإعداد معلق يحتوي على الخلايا بنسبة 1: 2 ، على التوالي. يتم طلاء الخلايا في لوحة U-well مطلية بالبولي HEMA و 96 بئرا منخفضة المرفق. يتم طرد اللوحة بالطرد المركزي للسماح للخلايا بتكوين حبيبات أولية. يتم تخزين اللوحة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO₂ ، ويتم استبدال الوسائط كل 3 أيام. يمكن تصوير اللوحات على فترات زمنية محددة لقياس حجم الكرة الأرضية. بعد 14 يوما من الاستزراع ، تتشكل كرويات ديزموبلاستيك ناضجة (أي متوسط حجم 0.048 + 0.012 مم³ (451 ميكرومتر × 462.84 ميكرومتر)) ويمكن استخدامها لتقييم العلاج التجريبي. تشمل مكونات ECM الناضجة الكولاجين I وحمض الهيالورونيك والفبرونيكتين واللامينين.

Introduction

يرتبط التشخيص السيئ لسرطان البنكرياس بمجموعة متنوعة من الأسباب ، من بينها افتقاره إلى المؤشرات الحيوية التي يمكن اكتشافها بسهولة مما يؤدي إلى الكشف المتأخر. سبب رئيسي آخر هو السدى السميك المحيط بالأنسجة ، مما يؤدي إلى انخفاض إمدادات الدم. إن ترسب كميات كبيرة من المصفوفة خارج الخلية (ECM) ، والتفاعل بين الخلايا والخلايا ، والخلايا البطانية ، والخلايا المناعية المختلفة ، والخلايا المحيطة ، والخلايا الليفية العضلية المتكاثرة ، ومجموعات الخلايا الليفية ، ووجود الخلايا غير الورمية (التي تشكل معا التفاعل الديسيموسجي)¹ ، تشكل السدى السميك المسؤول عن مقاومة العلاج الكيميائي والعلاج الإشعاعي ل PDAC²

Protocol

1. ثقافة الخلية 2D

1. تنمو خلايا PANC-1 في وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco ، مع استكمال مصل بقري الجنين بنسبة 10٪ (FBS) في ظل ظروف معقمة. تنمو تصل إلى 70٪ -80٪ التقاء قبل الممرات ، ولا تستخدم^{بعد المقطع} 20. راجع العملية الموضحة في الخطوة 4.2.1.
   ملاحظة: كنقطة مرجعية ، تحتاج 1 × 10⁶ خلايا في 20 مل من الوسائط إلى حوالي 2-3 أيام للوصول إلى التقاء 70-80٪.
2. تنمو خلايا HPaSteC في وسائط الخلايا النجمية المكملة ب 2٪ FBS و 1٪ PenStrep و 1٪ مكمل نمو الخلايا النجمية (SteCGS) باستخدام المجموعة التي توفرها الشركة المصنعة في ظل ظروف معقمة. تنمو وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (مع بعض التعديلا....

النتائج

ثلاث من أهم الخطوات التي ينطوي عليها نمو الكائنات الكروية هي عدد الخلايا الأولي ، وخطوات الخلط أثناء بذر الأجسام الكروية ، وإجراء تغييرات الوسائط في الوقت المناسب للسماح للكرويات بالنمو (الشكل 1). بالإضافة إلى ذلك ، فإن التعرف على الشكل 2

Discussion

استندت المدة ونسب الخلايا المختارة لزراعة الكائنات الكروية إلى دراسات كما ورد سابقا³⁸. عند محاولة تحسين هذه الدراسات عن طريق استبدال خلايا NIH3T3 بخلايا HPaSteC ، تم العثور على أحجام كروية وأنماط موت الخلايا المبرمج تشبه إلى حد كبير المعلمات المحسنة المبلغ عنها (ت.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Axio Observer inverted microscope	Carl Zeiss	0450-354
Cellometer Auto T4	Nexcelom Bioscience LLC	Auto-T4
DMEM, powder, high glucose	Gibco	12100046
Donkey anti-sheep conjugated with Alexa Fluor 568	Abcam	ab175712
Fetal Bovine Serum	Cytiva	SH3091003HI
Goat antirabbit IgG labeled with Alexa Fluor 488	Abcam	ab150077
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	14175145
Human Pancreatic Stellate Cells (HPaSteC)	ScienCell	3830
Microscope Nikon	Nikon	Eclipse Ts 100
Nunc 96-Well Polystyrene Round Bottom Microwell Plates	Thermo Scientific	12-565-331
Olympus Fluoview FV1200 confocal laser	Olympus	N/A	Discontinued product
PANC-1	ATCC	CRL-1469
Poly-HEMA	Sigma	P3932
Rabbit polyclonal anti-laminin antibodies	Abcam	ab11575
Rabbit polyclonal anti-type I collagen antibodies	Abcam	ab34710
Sheep polyclonal anti-hyaluronic acid antibodies	Abcam	ab53842
Stellate cell media complete kit	ScienCell	5301
Trypsin	MP Biomedicals, LLC	153571	Trypsin solution prepared according to manufacturers protocol and used at 0.25%w/v
Trypsin Neutralization Solution (TNS)	ScienCell	103