Выращивание десмопластических трехмерных сфероидов рака поджелудочной железы из сокультуры

Резюме

Рак поджелудочной железы остается одним из самых сложных видов рака для лечения. Поэтому крайне важно, чтобы доклинические модели, оценивающие эффективность лечения, были воспроизводимыми и клинически значимыми. Этот протокол описывает простую процедуру совместного культивирования для получения воспроизводимых, клинически значимых десмопластичных сфероидов.

Аннотация

Протоковая аденокарцинома поджелудочной железы (PDAC) является одним из самых смертоносных видов рака с 5-летней выживаемостью <12%. Самым большим препятствием для терапии является плотный десмопластический внеклеточный матрикс (ВКМ), который окружает опухоль и снижает васкуляризацию, обычно называемую десмоплазией. Для лечения рака были протестированы различные комбинации лекарств и составы, и хотя многие из них показывают успех на доклинической стадии, они терпят неудачу клинически. Поэтому становится важным иметь клинически значимую модель, которая может предсказать реакцию опухоли на терапию. Эта модель ранее была валидирована в отношении резецированных клинических опухолей. Здесь описан простой протокол выращивания десмопластичных трехмерных (3D)-кокультурных сфероидов, которые могут естественным образом генерировать надежную ЭКМ и не требуют никаких внешних матричных источников или каркаса для поддержки их роста.

Вкратце, звездчатые клетки поджелудочной железы человека (HPaSteC) и клетки PANC-1 используются для приготовления суспензии, содержащей клетки в соотношении 1:2 соответственно. Ячейки покрыты 96-луночной U-образной пластиной с покрытием poly-HEMA и низким уровнем крепления. Пластина центрифугируется, чтобы позволить ячейкам сформировать начальную гранулу. Планшет хранится в инкубаторе при температуре 37 °C с 5%_CO2, а среда заменяется каждые 3 дня. Пластины могут быть визуализированы через определенные промежутки времени для измерения объема сфероида. После 14 дней культивирования образуются зрелые десмопластические сфероиды (т.е. средний объем 0,048 + 0,012^мм3 (451 мкм x 462,84 мкм)) и могут быть использованы для оценки экспериментальной терапии. Зрелые компоненты ВКМ включают коллаген-I, гиалуроновую кислоту, фибронектин и ламинин.

Введение

Плохой прогноз рака поджелудочной железы связан с целым рядом причин, среди которых отсутствие легко обнаруживаемых биомаркеров, что приводит к позднему выявлению. Еще одной важной причиной является толстая строма, окружающая ткань, что приводит к снижению кровоснабжения. Отложение большого количества внеклеточного матрикса (ВКМ), межклеточное взаимодействие, эндотелиальные клетки, различные иммунные клетки, перициты, пролиферирующие миофибробласты и популяция фибробластов, а также присутствие неопухолевых клеток (вместе составляющих десмопластическую реакцию)¹ составляют толстую строму, которая отвечает за хим....

протокол

1. 2D культура клеток

1. Выращивайте клетки PANC-1 в модифицированной среде Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) в стерильных условиях. Наращивайте до 70%-80% слияния перед проходами, и не используйте дальше^20-го прохода. Обратитесь к процессу, описанному в шаге 4.2.1.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве ориентира, 1 x 10⁶ клеток в 20 мл среды требуется около 2-3 дней, чтобы достичь 70-80% конфлюенции.
2. Выращивайте клетки HPaSteC в звездчатых клеточных средах с добавлением 2% FBS, 1% PenStrep и 1% добавки для роста звездчатых клеток (SteCG....

Результаты

Тремя наиболее важными этапами, связанными с выращиванием сфероидов, являются начальный подсчет клеток, этапы смешивания при посеве сфероидов и выполнение своевременных изменений среды, чтобы позволить сфероидам расти (Рисунок 1). Кроме того, знакомс?.......

Обсуждение

Продолжительность и соотношение клеток, выбранные для выращивания сфероидов, были основаны на исследованиях, о которых сообщалось ранее³⁸. При попытке оптимизировать эти исследования путем замены клеток HPaSteC на клетки NIH3T3 было обнаружено, что объемы сфер.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Axio Observer inverted microscope	Carl Zeiss	0450-354
Cellometer Auto T4	Nexcelom Bioscience LLC	Auto-T4
DMEM, powder, high glucose	Gibco	12100046
Donkey anti-sheep conjugated with Alexa Fluor 568	Abcam	ab175712
Fetal Bovine Serum	Cytiva	SH3091003HI
Goat antirabbit IgG labeled with Alexa Fluor 488	Abcam	ab150077
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	14175145
Human Pancreatic Stellate Cells (HPaSteC)	ScienCell	3830
Microscope Nikon	Nikon	Eclipse Ts 100
Nunc 96-Well Polystyrene Round Bottom Microwell Plates	Thermo Scientific	12-565-331
Olympus Fluoview FV1200 confocal laser	Olympus	N/A	Discontinued product
PANC-1	ATCC	CRL-1469
Poly-HEMA	Sigma	P3932
Rabbit polyclonal anti-laminin antibodies	Abcam	ab11575
Rabbit polyclonal anti-type I collagen antibodies	Abcam	ab34710
Sheep polyclonal anti-hyaluronic acid antibodies	Abcam	ab53842
Stellate cell media complete kit	ScienCell	5301
Trypsin	MP Biomedicals, LLC	153571	Trypsin solution prepared according to manufacturers protocol and used at 0.25%w/v
Trypsin Neutralization Solution (TNS)	ScienCell	103