Züchtung von desmoplastischen dreidimensionalen Pankreaskrebs-Sphäroiden aus Co-Kultur

Zusammenfassung

Bauchspeicheldrüsenkrebs ist nach wie vor eine der am schwierigsten zu behandelnden Krebsarten. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, dass präklinische Modelle zur Bewertung der Wirksamkeit der Behandlung reproduzierbar und klinisch relevant sind. Dieses Protokoll beschreibt ein einfaches Co-Kulturverfahren zur Erzeugung reproduzierbarer, klinisch relevanter desmoplastischer Sphäroide.

Zusammenfassung

Das duktale Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse (PDAC) ist mit einer 5-Jahres-Überlebensrate von <12 % eine der tödlichsten Krebsarten. Das größte Hindernis für die Therapie ist die dichte desmoplastische extrazelluläre Matrix (EZM), die den Tumor umgibt und die Vaskularisation reduziert, die allgemein als Desmoplasie bezeichnet wird. Eine Vielzahl von Medikamentenkombinationen und -formulierungen wurde getestet, um den Krebs zu behandeln, und obwohl viele von ihnen präklinisch Erfolg zeigen, versagen sie klinisch. Daher ist es wichtig, ein klinisch relevantes Modell zur Verfügung zu haben, das das Ansprechen des Tumors auf die Therapie vorhersagen kann. Dieses Modell wurde bereits gegen resezierte klinische Tumoren validiert. Hier wird ein einfaches Protokoll zur Züchtung von desmoplastischen dreidimensionalen (3D)-Cokultur-Sphäroiden beschrieben, die auf natürliche Weise eine robuste EZM erzeugen können und keine externen Matrixquellen oder Gerüste benötigen, um ihr Wachstum zu unterstützen.

Kurz gesagt werden humane Pankreas-Sternzellen (HPaSteC) und PANC-1-Zellen verwendet, um eine Suspension herzustellen, die die Zellen im Verhältnis 1:2 enthält. Die Zellen sind mit einer poly-HEMA-beschichteten, 96-Well-U-Well-Platte mit geringer Bindung beschichtet. Die Platte wird zentrifugiert, damit die Zellen ein erstes Pellet bilden können. Die Platte wird im Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO₂ gelagert und das Medium wird alle 3 Tage gewechselt. Die Platten können in bestimmten Intervallen abgebildet werden, um das Sphäroidvolumen zu messen. Nach 14-tägiger Kultivierung werden reife desmoplastische Sphäroide gebildet (d.h. ein durchschnittliches Volumen von 0,048 + 0,012^mm3 (451 μm x 462,84 μm)) und können für die experimentelle Therapiebewertung verwendet werden. Zu den ausgereiften EZM-Komponenten gehören Kollagen-I, Hyaluronsäure, Fibronektin und Laminin.

Einleitung

Die schlechte Prognose von Bauchspeicheldrüsenkrebs ist mit einer Vielzahl von Gründen verbunden, darunter der Mangel an leicht nachweisbaren Biomarkern, die zu einer späten Erkennung führen. Ein weiterer Hauptgrund ist das dicke Stroma, das das Gewebe umgibt und zu einer verminderten Blutversorgung führt. Die Ablagerung großer Mengen an extrazellulärer Matrix (EZM), Zell-Zell-Interaktion, Endothelzellen, verschiedenen Immunzellen, Perizyten, proliferierenden Myofibroblasten und Fibroblastenpopulationen sowie das Vorhandensein nicht-neoplastischer Zellen (die zusammen die desmoplastische Reaktion bilden)¹ bilde....

Protokoll

1. 2D-Zellkultur

1. Züchten Sie PANC-1-Zellen in Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) unter sterilen Bedingungen. Wachsen Sie bis zu 70%-80% Konfluenz vor Passagen und verwenden Sie sie nicht über die 20^. Passage hinaus. Beziehen Sie sich auf den in Schritt 4.2.1 beschriebenen Prozess.
   HINWEIS: Als Anhaltspunkt benötigen 1 x 10⁶ Zellen in 20 mL Medium etwa 2-3 Tage, um eine Konfluenz von 70-80 % zu erreichen.
2. Züchten Sie HPaSteC-Zellen in Sternzellmedien, die mit 2 % FBS, 1 % PenStrep und 1 % Stellate Cell Growth Supplement (S....

Ergebnisse

Drei der wichtigsten Schritte bei der Züchtung der Sphäroide sind die anfängliche Zellzahl, die Mischschritte während der Aussaat der Sphäroide und die rechtzeitige Durchführung von Medienwechseln, damit die Sphäroide wachsen können (Abbildung 1). Darüber hinaus ist es wichtig, mit Abbildung 2 zu Medienänderungen nach Tag 3 vertraut zu sein, um aufgrund des erhöhten Medienvolumens pro Vertiefung effe.......

Diskussion

Die Dauer und die Zellverhältnisse, die für das Wachstum der Sphäroide gewählt wurden, basierten auf Studien, wie zuvor berichtet³⁸. Bei dem Versuch, diese Studien durch Substitution von HPaSteC-Zellen durch NIH3T3-Zellen zu optimieren, wurde festgestellt, dass die Sphäroidvolumina und Apoptosemuster den berichteten optimierten Parametern (berichtet für PANC-1: NIH3T3:: 120:12) sehr ähnlich waren, wenn die PANC-1: HPaSteC-Verhältnisse bei 120:60 lagen. Obw.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Axio Observer inverted microscope	Carl Zeiss	0450-354
Cellometer Auto T4	Nexcelom Bioscience LLC	Auto-T4
DMEM, powder, high glucose	Gibco	12100046
Donkey anti-sheep conjugated with Alexa Fluor 568	Abcam	ab175712
Fetal Bovine Serum	Cytiva	SH3091003HI
Goat antirabbit IgG labeled with Alexa Fluor 488	Abcam	ab150077
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	14175145
Human Pancreatic Stellate Cells (HPaSteC)	ScienCell	3830
Microscope Nikon	Nikon	Eclipse Ts 100
Nunc 96-Well Polystyrene Round Bottom Microwell Plates	Thermo Scientific	12-565-331
Olympus Fluoview FV1200 confocal laser	Olympus	N/A	Discontinued product
PANC-1	ATCC	CRL-1469
Poly-HEMA	Sigma	P3932
Rabbit polyclonal anti-laminin antibodies	Abcam	ab11575
Rabbit polyclonal anti-type I collagen antibodies	Abcam	ab34710
Sheep polyclonal anti-hyaluronic acid antibodies	Abcam	ab53842
Stellate cell media complete kit	ScienCell	5301
Trypsin	MP Biomedicals, LLC	153571	Trypsin solution prepared according to manufacturers protocol and used at 0.25%w/v
Trypsin Neutralization Solution (TNS)	ScienCell	103