共培養による線維形成性三次元膵臓がんスフェロイドの増殖

要約

膵臓がんは、依然として治療が最も困難ながんの1つです。したがって、治療効果を評価する前臨床モデルが再現性があり、臨床的に関連性があることが重要です。このプロトコールは、再現性があり、臨床的に関連性のある線維形成性スフェロイドを生成するための簡単な共培養手順を説明しています。

要約

膵管腺がん(PDAC)は、5年生存率が<12%の最も致命的ながんの1つです。治療の最大の障壁は、腫瘍を取り囲み、血管新生を減少させる高密度の線維形成性細胞外マトリックス(ECM)であり、一般にデスモプラスラと呼ばれます。がんの治療には、さまざまな薬剤の組み合わせや製剤が試験されており、その多くは前臨床で成功を収めていますが、臨床的には失敗しています。したがって、治療に対する腫瘍の反応を予測できる臨床的に関連性のあるモデルを利用できるようにすることが重要になります。このモデルは、切除された臨床腫瘍に対して以前に検証されています。ここでは、頑健なECMを自然に生成でき、その成長をサポートするための外部マトリックスソースや足場を必要としない、線維形成性三次元(3D)共培養スフェロイドを成長させるための簡単なプロトコルについて説明します。

簡単に説明すると、ヒト膵臓星状細胞(HPaSteC)とPANC-1細胞を使用して、それぞれ1:2の比率で細胞を含む懸濁液を調製します。細胞は、ポリHEMAコーティングされた96ウェル低接着Uウェルプレートに播種されています。プレートを遠心分離して、細胞が最初のペレットを形成するようにします。プレートは5%_CO2で37°Cのインキュベーターに保存され、培地は3日ごとに交換されます。プレートを指定された間隔でイメージングして、スフェロイドの体積を測定できます。14日間の培養後、成熟した線維形成性スフェロイドが形成され(すなわち、平均体積0.048 + 0.012 mm³(451 μm x 462.84 μm))、実験的治療評価に利用できます。成熟したECM成分には、コラーゲンI、ヒアルロン酸、フィブロネクチン、ラミニンが含まれます。

概要

膵臓がんの予後不良にはさまざまな理由が関連していますが、その中には、検出が遅れる原因となる簡単に検出できるバイオマーカーがないことが挙げられます。もう一つの大きな理由は、組織を取り巻く間質が厚いため、血液供給が減少することです。大量の細胞外マトリックス(ECM)、細胞間相互作用、内皮細胞、さまざまな免疫細胞、周皮細胞、増殖性筋線維芽細胞、線維芽細胞集団、および非腫瘍細胞の存在(一緒にして線維形成反応を構成する)¹が、PDACの化学療法および放射線^{治療耐性2}の原因となる厚い間質を構成します.がん細胞と間質細胞は、複雑でダイナミックな双方向の相互作用を持っています。一部の要素は疾患の進行を弱めたり加速させたりしますが、ほとんどのプロセスは腫瘍の発生中に適応します¹。これにより、成長因子、血管新生促進因子、プロテアーゼ、接着分子が豊富な環境が提供されます。これらの因子は、血管新生、細胞増殖、転移、および浸潤を促進します^3,4。これらが一緒になって、腫瘍に対する免疫と薬物特権の聖域となり、薬剤耐性をもたらします。

デスモプラスラは、免疫細胞および膵臓星細胞(P....

プロトコル

1. 2D細胞培養

1. 無菌条件下で10%ウシ胎児血清(FBS)を添加したダルベッコのModified Eagle Medium(DMEM)でPANC-1細胞を増殖させます。パッセージの前に70%〜80%のコンフルエントまで成長し、20^番目の パッセージを超えて使用しないでください。ステップ 4.2.1 で説明されているプロセスを参照してください。
   注:参考として、20mLの培地中の1 x 10⁶細胞は、70〜80%の密度に達するまでに約2〜3日かかります。
2. 2% FBS、1% PenStrep、および1% Stellate Cell Growth Supplement(SteCGS)を添加したステラ細胞培地で、メーカーが提供するキットを使用して無菌条件下でHPaSteC細胞を増殖させます。製造元の指示に従って(一部変更を加えて)、ステップ4.2.2に示すように、Poly-L-Lysineコーティングフラスコで成長させます。
   1. トリプシン中和溶液(TNS)が使用されるため、トリプシン化中のFBS中和ステップをメーカーのプロトコルからスキップします。ステップ4.2.2.2で説明したように、全量10 mLのTNSで細胞懸濁液を中和します。
      注:参考値として、20 mLの培地中の0.5 x 10⁶細胞および1 x....

結果

スフェロイドの増殖に関与する最も重要な3つのステップは、初期細胞数、スフェロイドの播種中の混合ステップ、およびスフェロイドを成長させるためのタイムリーな培地交換の実施です(図1)。さらに、3日目以降のFigure 2 onのメディア変更に精通することは、ウェルあたりのメディア量の増加による効果的?.......

ディスカッション

スフェロイドを増殖させるために選択された期間および細胞比は、以前に報告された研究に基づいていた³⁸。これらの研究を最適化しようと、NIH3T3細胞をHPaSteC細胞に置き換えようとしたところ、スフェロイドの体積とアポトーシスパターンは、PANC-1:HPaSteC比が120:60のときに報告された最適化パラメータ(PANC-1:NIH3T3:: 120:12)と非常によく似ていることが?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Axio Observer inverted microscope	Carl Zeiss	0450-354
Cellometer Auto T4	Nexcelom Bioscience LLC	Auto-T4
DMEM, powder, high glucose	Gibco	12100046
Donkey anti-sheep conjugated with Alexa Fluor 568	Abcam	ab175712
Fetal Bovine Serum	Cytiva	SH3091003HI
Goat antirabbit IgG labeled with Alexa Fluor 488	Abcam	ab150077
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	14175145
Human Pancreatic Stellate Cells (HPaSteC)	ScienCell	3830
Microscope Nikon	Nikon	Eclipse Ts 100
Nunc 96-Well Polystyrene Round Bottom Microwell Plates	Thermo Scientific	12-565-331
Olympus Fluoview FV1200 confocal laser	Olympus	N/A	Discontinued product
PANC-1	ATCC	CRL-1469
Poly-HEMA	Sigma	P3932
Rabbit polyclonal anti-laminin antibodies	Abcam	ab11575
Rabbit polyclonal anti-type I collagen antibodies	Abcam	ab34710
Sheep polyclonal anti-hyaluronic acid antibodies	Abcam	ab53842
Stellate cell media complete kit	ScienCell	5301
Trypsin	MP Biomedicals, LLC	153571	Trypsin solution prepared according to manufacturers protocol and used at 0.25%w/v
Trypsin Neutralization Solution (TNS)	ScienCell	103