Ko-Kültürden Büyüyen Desmoplastik Üç Boyutlu Pankreas Kanseri Spferoidleri

Özet

Pankreas kanseri, tedavisi en zor kanserlerden biri olmaya devam ediyor. Bu nedenle, tedavi etkinliğini değerlendiren klinik öncesi modellerin tekrarlanabilir ve klinik olarak anlamlı olması kritik öneme sahiptir. Bu protokol, tekrarlanabilir, klinik olarak anlamlı desmoplastik sferoidler oluşturmak için basit bir ko-kültür prosedürünü tanımlar.

Özet

Pankreatik duktal adenokarsinom (PDAC) 5 yıllık sağkalım oranı %<12 ile en ölümcül kanserlerden biridir. Tedavinin önündeki en büyük engel, tümörü çevreleyen ve genellikle desmoplazi olarak adlandırılan vaskülarizasyonu azaltan yoğun desmoplastik hücre dışı matrikstir (ECM). Kanseri tedavi etmek için çeşitli ilaç kombinasyonları ve formülasyonları test edilmiştir ve bunların çoğu klinik öncesi başarı gösterse de klinik olarak başarısız olurlar. Bu nedenle, tümörün tedaviye yanıtını tahmin edebilecek klinik olarak ilgili bir modele sahip olmak önemli hale gelir. Bu model daha önce rezeke edilmiş klinik tümörlere karşı doğrulanmıştır. Burada, doğal olarak sağlam bir ECM oluşturabilen ve büyümelerini desteklemek için herhangi bir harici matris kaynağı veya iskele gerektirmeyen desmoplastik üç boyutlu (3D) kokültür sferoidlerini büyütmek için basit bir protokol açıklanmaktadır.

Kısaca insan pankreas yıldız hücreleri (HPaSteC) ve PANC-1 hücreleri, hücreleri sırasıyla 1:2 oranında içeren bir süspansiyon hazırlamak için kullanılır. Hücreler, poli-HEMA kaplı, 96 oyuklu düşük bağlantılı U-kuyucuklu bir plaka içinde kaplanmıştır. Plaka, hücrelerin bir başlangıç peleti oluşturmasına izin vermek için santrifüjlenir. Plaka, inkübatörde %5_CO2 ile 37 °C'de saklanır ve ortam her 3 günde bir değiştirilir. Plakalar, küresel hacmi ölçmek için belirlenen aralıklarla görüntülenebilir. 14 günlük kültürden sonra, olgun desmoplastik sferoidler oluşur (ör. ortalama hacim 0.048 + 0.012^mm3 (451 μm x 462.84 μm)) ve deneysel tedavi değerlendirmesi için kullanılabilir. Olgun ECM bileşenleri arasında kollajen-I, hyaluronik asit, fibronektin ve laminin bulunur.

Giriş

Pankreas kanserinin kötü prognozu, aralarında geç teşhise yol açan kolayca tespit edilebilir biyobelirteçlerin olmaması gibi çeşitli nedenlerle ilişkilidir. Bir diğer önemli neden, dokuyu çevreleyen kalın stromadır ve bu da kan akışının azalmasına neden olur. Büyük miktarlarda hücre dışı matriks (ECM), hücre-hücre etkileşimi, endotel hücreleri, çeşitli bağışıklık hücreleri, perisitler, proliferatif miyofibroblast ve fibroblast popülasyonunun birikmesi ve neoplastik olmayan hücrelerin varlığı (birlikte desmoplastik reaksiyonu oluşturur)¹, PDAC'ın kemoterapisinden ve radyoterapötik direncinden sorumlu olan kalın ....

Protokol

1. 2D hücre kültürü

1. Steril koşullar altında% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamında (DMEM) PANC-1 hücrelerini büyütün. Pasajlardan önce% 70 -% 80'e kadar birleşin ve 20.^pasajdan sonra kullanmayın. Adım 4.2.1'de açıklanan işleme bakın.
   NOT: Bir referans noktası olarak, 20 mL ortamdaki 1 x 10⁶ hücrenin% 70-80 birleşmeye ulaşması için yaklaşık 2-3 güne ihtiyacı vardır.
2. HPaSteC hücrelerini, steril koşullar altında üretici tarafından sağlanan kiti kullanarak %2 FBS, %1 PenStrep ve %1 Yıldız Hücre Büyüme Takviyesi (SteCGS) ile destekle....

Tartışmalar

Sferoidleri büyütmek için seçilen süre ve hücre oranları, daha önce³⁸ bildirildiği gibi çalışmalara dayanıyordu. HPaSteC hücreleri için NIH3T3 hücrelerini ikame ederek bu çalışmaları optimize etmeye çalışırken, sferoid hacimleri ve apoptoz paternlerinin, PANC-1: HPaSteC oranları 120: 60 iken, bildirilen optimize edilmiş parametrelere (PANC-1: NIH3T3 :: 120: 120) çok benzer olduğu bulundu. Bu çalışmalar sadece 14. güne kadar apoptozu.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Axio Observer inverted microscope	Carl Zeiss	0450-354
Cellometer Auto T4	Nexcelom Bioscience LLC	Auto-T4
DMEM, powder, high glucose	Gibco	12100046
Donkey anti-sheep conjugated with Alexa Fluor 568	Abcam	ab175712
Fetal Bovine Serum	Cytiva	SH3091003HI
Goat antirabbit IgG labeled with Alexa Fluor 488	Abcam	ab150077
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	14175145
Human Pancreatic Stellate Cells (HPaSteC)	ScienCell	3830
Microscope Nikon	Nikon	Eclipse Ts 100
Nunc 96-Well Polystyrene Round Bottom Microwell Plates	Thermo Scientific	12-565-331
Olympus Fluoview FV1200 confocal laser	Olympus	N/A	Discontinued product
PANC-1	ATCC	CRL-1469
Poly-HEMA	Sigma	P3932
Rabbit polyclonal anti-laminin antibodies	Abcam	ab11575
Rabbit polyclonal anti-type I collagen antibodies	Abcam	ab34710
Sheep polyclonal anti-hyaluronic acid antibodies	Abcam	ab53842
Stellate cell media complete kit	ScienCell	5301
Trypsin	MP Biomedicals, LLC	153571	Trypsin solution prepared according to manufacturers protocol and used at 0.25%w/v
Trypsin Neutralization Solution (TNS)	ScienCell	103