Croissance de sphéroïdes tridimensionnels desmoplastiques du cancer du pancréas à partir de la co-culture

Résumé

Le cancer du pancréas reste l’un des cancers les plus difficiles à traiter. Par conséquent, il est essentiel que les modèles précliniques évaluant l’efficacité du traitement soient reproductibles et cliniquement pertinents. Ce protocole décrit une procédure simple de co-culture pour générer des sphéroïdes desmoplastiques reproductibles et cliniquement pertinents.

Résumé

L’adénocarcinome canalaire pancréatique (PDAC) est l’un des cancers les plus meurtriers avec un taux de survie à 5 ans de <12 %. Le plus grand obstacle au traitement est la matrice extracellulaire desmoplastique dense (MEC) qui entoure la tumeur et réduit la vascularisation, généralement appelée desmoplasie. Une variété de combinaisons et de formulations de médicaments ont été testées pour traiter le cancer, et bien que beaucoup d’entre eux montrent un succès préclinique, ils échouent cliniquement. Il devient donc important de disposer d’un modèle cliniquement pertinent capable de prédire la réponse de la tumeur au traitement. Ce modèle a déjà été validé contre des tumeurs cliniques réséquées. Ici, un protocole simple pour cultiver des sphéroïdes de coculture tridimensionnelle (3D) desmoplastiques est décrit qui peut générer naturellement une ECM robuste et ne nécessite aucune source matricielle externe ou échafaudage pour soutenir leur croissance.

En bref, les cellules stellaires pancréatiques humaines (HPaSteC) et les cellules PANC-1 sont utilisées pour préparer une suspension contenant les cellules dans un rapport de 1:2, respectivement. Les cellules sont plaquées dans une plaque en U à 96 puits à faible fixation recouverte de poly-HEMA. La plaque est centrifugée pour permettre aux cellules de former une première pastille. La plaque est stockée dans l’incubateur à 37 °C avec 5% de CO₂, et le milieu est remplacé tous les 3 jours. Les plaques peuvent être imagées à des intervalles désignés pour mesurer le volume des sphéroïdes. Après 14 jours de culture, des sphéroïdes desmoplastiques matures se forment (c.-à-d. un volume moyen de 0,048 + 0,012 mm³ (451 μm x 462,84 μm)) et peuvent être utilisés pour l’évaluation du traitement expérimental. Les composants matures de la MEC comprennent le collagène-I, l’acide hyaluronique, la fibronectine et la laminine.

Introduction

Le mauvais pronostic du cancer du pancréas est associé à diverses raisons, parmi lesquelles son manque de biomarqueurs facilement détectables conduisant à une détection tardive. Une autre raison majeure est l’épais stroma entourant le tissu, ce qui entraîne une réduction de l’apport sanguin. Le dépôt de grandes quantités de matrice extracellulaire (MEC), l’interaction cellule-cellule, les cellules endothéliales, diverses cellules immunitaires, les péricytes, les myofibroblastes en prolifération et la population de fibroblastes, et la présence de cellules non néoplasiques (constituant ensemble la réaction desmoplastique)

Protocole

1. Culture cellulaire 2D

1. Cultivez des cellules PANC-1 dans le milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM), complété par 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) dans des conditions stériles. Cultivez jusqu’à 70%-80% de confluence avant les passages, et ne pas utiliser au-delà du 20ème^passage. Reportez-vous au processus décrit à l’étape 4.2.1.
   REMARQUE : À titre de référence, 1 x 10⁶ cellules dans 20 ml de milieu a besoin d’environ 2 à 3 jours pour atteindre une confluence de 70 à 80 %.
2. Cultivez des cellules HPaSteC dans des milieux cellulaires étoilés complétés par 2 % de FBS, 1 % de ....

Discussion

La durée et les rapports cellulaires choisis pour faire pousser les sphéroïdes ont été basés sur des études comme indiqué précédemment³⁸. En tentant d’optimiser ces études en substituant des cellules NIH3T3 aux cellules HPaSteC, on a constaté que les volumes sphéroïdes et les profils d’apoptose ressemblaient étroitement aux paramètres optimisés rapportés (rapportés pour PANC-1 : NIH3T3 : 120:12) lorsque les rapports PANC-1 : HPaSteC étaient.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Axio Observer inverted microscope	Carl Zeiss	0450-354
Cellometer Auto T4	Nexcelom Bioscience LLC	Auto-T4
DMEM, powder, high glucose	Gibco	12100046
Donkey anti-sheep conjugated with Alexa Fluor 568	Abcam	ab175712
Fetal Bovine Serum	Cytiva	SH3091003HI
Goat antirabbit IgG labeled with Alexa Fluor 488	Abcam	ab150077
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	14175145
Human Pancreatic Stellate Cells (HPaSteC)	ScienCell	3830
Microscope Nikon	Nikon	Eclipse Ts 100
Nunc 96-Well Polystyrene Round Bottom Microwell Plates	Thermo Scientific	12-565-331
Olympus Fluoview FV1200 confocal laser	Olympus	N/A	Discontinued product
PANC-1	ATCC	CRL-1469
Poly-HEMA	Sigma	P3932
Rabbit polyclonal anti-laminin antibodies	Abcam	ab11575
Rabbit polyclonal anti-type I collagen antibodies	Abcam	ab34710
Sheep polyclonal anti-hyaluronic acid antibodies	Abcam	ab53842
Stellate cell media complete kit	ScienCell	5301
Trypsin	MP Biomedicals, LLC	153571	Trypsin solution prepared according to manufacturers protocol and used at 0.25%w/v
Trypsin Neutralization Solution (TNS)	ScienCell	103