مصفوفة الغشاء القاعدي المغلفة تجميع الخلايا للتحقيق في تكوين أنسجة طحال الفئران

Summary

توضح هذه المقالة بروتوكولا لتجميع خلايا الطحال وتغليفها داخل مصفوفة غشاء قاعدي شبه صلب. يمكن استخدام تركيبات مصفوفة الغشاء القاعدي في الثقافة ثلاثية الأبعاد لدراسة تطور الأعضاء ، أو لدراسات زرع الجسم الحي وتجديد الأنسجة.

Abstract

الطحال هو عضو مناعي يلعب دورا رئيسيا في الاستجابات المناعية المنقولة بالدم. يزيد الفقدان التشريحي أو الوظيفي لهذا النسيج من التعرض لالتهابات الدم الحادة والإنتان. تم استخدام الزرع التلقائي لشرائح الطحال سريريا لاستبدال الأنسجة المفقودة واستعادة وظيفة المناعة. ومع ذلك ، فإن الآلية التي تقود تجديد أنسجة الطحال القوية والوظيفية مناعيا لم يتم توضيحها بشكل كامل. هنا ، نهدف إلى تطوير طريقة لتجميع وتغليف خلايا الطحال داخل مصفوفة شبه صلبة من أجل التحقيق في المتطلبات الخلوية لتشكيل أنسجة الطحال. تكون تركيبات الخلايا المغلفة بمصفوفة الغشاء القاعدي قابلة لكل من زراعة الأنسجة في المختبر من المواد العضوية ثلاثية الأبعاد وكذلك الزرع تحت كبسولة الكلى لتقييم تكوين الأنسجة الحية مباشرة. من خلال معالجة خلايا الإدخال للتجميع والتغليف ، أثبتنا أن خلايا انسجة ^{الأطفال حديثي} الولادة المشتقة من الكسب غير المشروع PDGFRβ ⁺ MAdCAM-1- مطلوبة لتجديد أنسجة الطحال في إطار نماذج زراعة.

Introduction

كان تمزق الطحال الرضحي وظهور عقيدات طحالية متعددة في الجسم أحد المؤشرات الأولى على أن أنسجة الطحال لديها قدرة متجددة ^1,2. تم إدخال عمليات زرع الطحال في وقت لاحق إلى العيادة للحفاظ على أنسجة الطحال في المرضى الذين يحتاجون إلى استئصال الطحال في حالات الطوارئ³. ومع ذلك ، على الرغم من كونها جزءا من الممارسة السريرية لعقود من الزمن ، لا يعرف سوى القليل جدا عن كيفية تجدد الطحال. قدمت نماذج زراعة نظرة ثاقبة على معايير متعددة لتجديد الطحال ووظيفة المناعة ^4,5. على وجه الخصوص ، سمحت التعديلات التجريبية على طريقة تحضير الكسب غير المشروع بدراسة تجديد الأنسجة بمزيد من التفصيل على المستوى الخلوي والجزيئي.

تخضع عمليات الزرع التي تتضمن شرائح طحال كاملة لمرحلة من النخر الجماعي قبل إعادة بناء هيكل الطحال الجديد⁶. تشير المرحلة الأولية من نخر الكسب غير المشروع إلى أن الجزء الأكبر من الأنسجة المزروعة يتكون إلى حد كبير من خلايا الدم الحمراء والبيضاء وغير ضروري لتجديد الطحال. تم التحقيق في ذلك تجريبيا عن طريق استبعاد الخلايا المكونة للدم من ترقيع الطحال قبل الزرع تحت كبسولة الكلى الفأر. هنا ، تبين أن الجزء غير الكريات البيض / غير كريات الدم الحمراء من الطحال ، والذي يتضمن الخلايا اللحمية والبطانية ، كاف للحث على تكوين أنسجة دي نوفو ⁷. يمكن معالجة أنسجة انسجة الطحال بشكل أكبر في تعليق أحادي الخلية ، مما يتيح استخدام تقنيات فرز الخلايا لمعالجة تكوين الكسب غير المشروع الخلوي. من خلال إزالة أنواع الخلايا المرشحة بشكل انتقائي ، تم تحديد مجموعتين من ^{الخلايا اللحمية} CD45-TER-119 التي لا غنى عنها لتطوير الكسب غير المشروع: مجموعة خلايا CD31 ⁺ CD105 ⁺ MAdCAM-1 ⁺ تشبه البطانة ومجموعة خلايا اللحمة المتوسطة PDGFRβ ⁺ المحددة على نطاق أوسع⁸.

يختلف بناء الطعوم من خلايا الطحال من حيث مواد الدعم وعمليات تحميل الخلايا. تم تحضير الطحال المصمم بالأنسجة مسبقا عن طريق تحميل وحدات الطحال على سقالة بوليمر حمض اللاكتيك polyglycolic / poly-L ^5,9. ومن المثير للاهتمام أن خلايا انسجة الطحال التي تم امتصاصها في إسفنجة الكولاجين فشلت في التطعيم ، في حين أن الخلايا اللحمية المجمعة والمحملة على ورقة الكولاجين سهلت تجديد الطحال⁸. كما ثبت أن إعادة تعليق خلايا انسجة الطحال داخل مصفوفة Matrigel تحفز تراكم الخلايا في ظل ظروف الثقافة ثلاثية الأبعاد¹⁰. ومع ذلك ، لم يتم اختبار هذه الطريقة لاستخدامها في نماذج الزرع. الهدف العام من البروتوكول الحالي هو تجميع وتغليف خلايا انسجة الطحال بالقوة مباشرة داخل مصفوفة الغشاء القاعدي ، والتي يمكن نقلها لاحقا إلى نظام زراعة الأنسجة ثلاثي الأبعاد في المختبر أو استخدامها كوسيلة لزراعة النماذج الحيوانية (الشكل التكميلي 1).

Protocol

تم إجراء جميع الإجراءات الحيوانية وفقا للبروتوكولات التجريبية المعتمدة من قبل لجنة أخلاقيات بجامعة كوينزلاند (UQBR / 079/19).

1. جمع الأنسجة وإعداد الخلايا اللحمية

1. القتل الرحيم 0.5-1.5 يوم من الذكور و / أو الإناث BALB / c الفئران المانحة حديثي الولادة عن طريق تحريض انخفاض حرارة الجسم عن طريق لف داخل المناديل الورقية ووضعها تحت الثلج المجروش لمدة >10 دقائق.
   ملاحظة: يمكن تكييف هذا البروتوكول مع سلالات الفئران المختلفة والأعمار وعدد.
2. تحضير الأدوات الجراحية المعقمة.
3. ضع الماوس في الموضع الجانبي الأيمن. امسح الجلد بنسبة 80٪ من الإيثانول وقم بعمل شق 1 سم بمقص جراحي قزحية لكشف الجدار البريتوني.
4. قم بعمل شق ثان بطول 0.5 سم فوق الطحال واستخدم زوجا من الملقط الدقيق لرفع الأنسجة برفق. استخدم مقصا جراحيا لقطع الأوعية الدموية واستئصال الأنسجة. انقل الأنسجة إلى طبق بتري يحتوي على محلول ملحي مقسم بالفوسفات المثلج (PBS). قم بإزالة أي نسيج ضام متبقي متصل بالطحال.
   ملاحظة: يمكن أن يساعد المجهر المجسم في الحركات الحركية الدقيقة اللازمة لمعالجة الأدوات الجراحية.
5. لفصل الأنسجة الكاملة ، انقل الطحال الوليدي (برك من 10 أو أقل) إلى الحافة الداخلية لغطاء أنبوب مخروطي مقلوب سعة 14 مل. قم بتعطيل الأنسجة ميكانيكيا بحركة ضغط باستخدام الطرف الخلفي البلاستيكي لمكبس حقنة سعة 1 مل.
6. ضع الغطاء وثبته بإحكام فوق أنبوب مخروطي سعة 14 مل يحتوي على 10 مل من برنامج تلفزيوني بارد. اقلب الأنبوب 5x لغسل جميع الأنسجة المعطلة من الغطاء إلى الأنبوب.
7. كرر الخطوة 1.6 لأي أنسجة متبقية.
8. اترك الأنبوب على الثلج لمدة 1 دقيقة للسماح للأنسجة بالاستقرار في قاع الأنبوب.
9. تخلص بعناية من المادة الطافية (التي تحتوي على خلايا مكونة للدم) عن طريق تمرير المحلول من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر قابلة للعكس.
10. استعادة الجزء اللحمي غير القابل للذوبان عن طريق عكس المصفاة وغسل الأنسجة اللحمية مرة أخرى في الأنبوب المخروطي سعة 14 مل باستخدام 2 مل محضرة حديثا من وسط النسر المعدل (sDMEM) من Dulbecco الذي يحتوي على 1 مجم / مل كولاجيناز IV و 40 ميكروغرام / مل DNase I و 2٪ مصل بقري جنيني (FBS).
    تنبيه: كولاجيناز IV وكولاجيناز D من المواد الخطرة ويجب التعامل معها داخل خزانة السلامة البيولوجية مع معدات الحماية الشخصية المناسبة.
11. لتحضير معلق خلية واحدة ، هضم الأنسجة المجمعة إنزيميا (حتى 20) لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية مع دوران مستمر.
12. أضف 4 مل من sDMEM المحضر حديثا الذي يحتوي على 1 مجم / مل كولاجيناز D و 40 ميكروغرام / مل DNase I و 2٪ FBS مباشرة إلى الأنبوب الذي يحتوي على الأنسجة اللحمية. احتضان لمدة 10 دقائق أخرى عند 37 درجة مئوية مع دوران مستمر.
13. أوقف عملية الهضم بإضافة 8 مل من برنامج تلفزيوني بارد. جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
14. تخلص من المادة الطافية ، واغسل الخلايا مرتين عن طريق تعليق 1 مل من PBS البارد والطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. الحفاظ على الخلايا على الجليد.
    ملاحظة: يمكن عد الخلايا وتعديلها حسب التركيز المطلوب. قد يتطلب ذلك تحسينا لمجموعات الخلايا المختلفة. باستخدام هذا البروتوكول ، عادة ما يتم استرداد 0.5 × 10⁶- 1 × 10⁶ خلايا انسجة / طحال ، اعتمادا على عمر الفئران المانحة. يمكن اختياريا تلطيخ الخلايا وفرز FACS في هذه المرحلة لتحديد تكوين الخلية.

2. تغليف مصفوفة مجاميع الخلايا

1. قم بتبريد أطراف ماصة P200 المعقمة مسبقا داخل فريزر -20 درجة مئوية.
2. قطع فيلم المختبر المرن (على سبيل المثال ، Parafilm) إلى قطع 1 سم × 2 سم وتعقيمها عن طريق غمرها في 80٪ من الإيثانول لمدة 10 دقائق ، تليها PBS لمدة 10 دقائق. يمكن تحضير فيلم المختبر مقدما وتخزينه معقما.
3. تحضير 0.5 × 10 6-2.5 × 10⁶ خلايا عن طريق الطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. استنشاق بعناية طاف ، وترك ما يقرب من 20 ميكرولتر من حجم PBS المتبقي. الحفاظ على بيليه الخلية على الجليد.
   ملاحظة: يمكن سحب PBS المتبقي برفق دون إزعاج حبيبات الخلية لتأكيد الحجم.
4. نضح 2 ميكرولتر من مصفوفة غشاء القاعد البارد إلى طرف ماصة P200 مبرد مسبقا ، باستخدام ماصة P20.
   ملاحظة: تساعد مصفوفة الغشاء القاعدي عالية التركيز (على سبيل المثال ، Corning Matrigel Matrix عالية التركيز) في تكوين سدادة صلبة قوية.
5. قم بتحريف بلطف لإخراج طرف الماصة. قم بتمديد شريط معقم مسبقا من فيلم المختبر وضعه على نهاية طرف الماصة ، مع الحرص على عدم اختراق الفيلم. استمر في لف الطرف في الفيلم لإغلاق طرف الماصة. ضع الطرف المختوم بعناية مباشرة على الجليد ، مع الحرص على عدم تمزق الفيلم.
6. أعد تعليق حبيبات الخلية في PBS المتبقية وقم بوضع المحلول برفق فوق مصفوفة الغشاء القاعدي. الحفاظ على البناء على الجليد.
7. تحضير أنبوب الطرد المركزي عن طريق وضع أنبوب عنقودي 1.2 مل داخل أنبوب مخروطي 14 مل.
8. ضع طرف الماصة داخل تكوين الأنبوب المتداخل وأجهزة الطرد المركزي عند 400 × جم و 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
9. ضع الأنبوب المخروطي سعة 14 مل في اتجاه رأسي واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة للسماح لمصفوفة الغشاء القاعدي بالتصلب داخل طرف الماصة.
   ملاحظة: يمكن وضع الأنبوب المخروطي سعة 14 مل على الجليد حتى يكون مطلوبا للتطبيق النهائي.

3. ثقافة عضوية ثلاثية الأبعاد

1. قم بإزالة فيلم المختبر بعناية من طرف الماصة.
2. أدخل مكبس رفيع من أسلاك الفولاذ المقاوم للصدأ من خلال الفتحة الأكبر لطرف الماصة.
3. اطرد سدادة المصفوفة حتى يتم إطلاقها من خلال الطرف في بئر واحدة من صفيحة زراعة الأنسجة غير المعالجة المكونة من 6 آبار تحتوي على 2 مل من sDMEM المكمل ب 10٪ FBS ، 1x الجلوتاماكس ، 1x الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA) ، مثبط الصخور 10 ميكرومتر ، 10 وحدة / مل من البنسلين / الستربتومايسين ، و 50 ميكرومتر β-ميركابتوإيثانول.
   ملاحظة: يمكن ضبط وعاء زراعة الأنسجة وحجم الوسائط المقابل حسب الحاجة.
   تنبيه: NEAA والبنسلين / الستربتومايسين و β-mercaptoethanol هي مواد خطرة ويجب التعامل معها داخل خزانة السلامة البيولوجية مع معدات الحماية الشخصية المناسبة.
4. استزراع المواد العضوية عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO₂ ، و 95٪ رطوبة لمدة 4-12 أسبوعا.
5. استبدل نصف الوسط كل 5 أيام.
   ملاحظة: إذا بدأت المواد العضوية في الالتصاق بلوحة زراعة الأنسجة ، فنقلها إلى بئر جديدة.

4. زرع كبسولة الكلى

1. تحضير الأدوات الجراحية المعقمة.
2. إجراء عملية زرع الكلى تحت المحفظة من المكونات مصفوفة الغشاء القاعدي:
   1. تخدير الفأر المتلقي BALB / c البالغ من العمر 8 أسابيع باستخدام الأيزوفلوران باتباع إرشادات أخلاقيات المؤسسية.
      تنبيه: الإيزوفلوران مادة خطرة. يجب تنظيف غاز النفايات لمنع الدخول إلى بيئة مساحة العمل.
   2. ضع الماوس في الموضع الجانبي الأيمن.
   3. حلق الشعر من موقع الجراحة وتطهير الجلد باتباع الإرشادات المؤسسية.
      ملاحظة: يوصى بتطهير موقع الجراحة ثلاث مرات بحركة دائرية باستخدام فرك بالتناوب القائم على اليود أو الكلورهيكسيدين والكحول.
   4. قم بعمل شق 2 سم في الجلد عموديا على العمود الفقري لكشف الجدار البريتوني.
      ملاحظة: يمكن استخدام مقص جراحي دقيق أو شفرة مشرط لشق الجلد. يجب على المستخدمين اتباع إرشادات أخلاقيات المؤسسية أو إجراءات التشغيل القياسية.
   5. قم بعمل شق أصغر بمقدار 0.5 سم في الجدار البريتوني فوق الكلى.
      ملاحظة: يجب أن يقترب الشق من عرض الكلى لضمان بقاء الكلية خارجية أثناء الزرع.
   6. قم بإضفاء الطابع الخارجي على الكلى من خلال الفتحة البريتونية عن طريق الضغط لأسفل باستخدام الإبهام والسبابة. يمكن استخدام زوج من الملقط الدائري للمساعدة في المظهر الخارجي. تأكد من أن الكلى رطبة طوال العملية عن طريق تطبيق برنامج تلفزيوني معقم بانتظام باستخدام قطعة قطن.
   7. تحت المجهر المجسم ، قرصة الدهون المحيطة بالكلى من كبسولة الكلى مع زوج من ملقط دقيق للغاية عازمة في قطب واحد من الكلى. استخدم زوجا ثانيا من الملقط الناعم للغاية المثني لتمزيق غشاء كبسولة الكلى برفق لأعلى في اتجاه معاكس ، مما يخلق فتحة صغيرة.
   8. أدخل بعناية شق ملقط واحد تحت غشاء الكبسولة. استخدم حركة كنس بطيئة لفصل الغشاء الكبسولي عن حمة الكلى.
   9. قم بإعداد قابس مصفوفة الغشاء القاعدي للزرع عن طريق إزالة فيلم المختبر من طرف الماصة.
   10. ارفع كبسولة الكلى باستخدام شق واحد من الملقط وأدخل طرف الماصة من خلال الفتحة ، وادفعها نحو القطب المقابل للكلية.
   11. أدخل مكبس سلكي في طرف الماصة واطرد قابس المصفوفة مع سحب طرف الماصة في نفس الوقت من الكلى.
   12. بلل الكلى مع برنامج تلفزيوني وإعادة استيعاب.
   13. أغلق الجدار البريتوني بخياطة Vicryl واحدة 5-0 وأغلق الجلد بمشبكين تلقائيين.
   14. تطبيق مسكن (البوبرينورفين بمعدل 0.05-0.1 ملغم/كغ تحت الجلد أو باتباع الإرشادات المؤسسية لأخلاقيات).
       تنبيه: البوبرينورفين مادة خطرة ويجب التعامل معها بمعدات الحماية الشخصية المناسبة.
3. قم بإيقاف تدفق الأيزوفلوران ولكن استمر في تدفق الأكسجين للسماح للفأر بتنفس الأكسجين النقي حتى يبدأ في اكتساب الوعي.
4. أعد الماوس إلى قفصه. حافظ على دفء أثناء الشفاء عن طريق وضع القفص جزئيا فوق وسادة التدفئة أو تحت مصباح حراري ، ومراقبته حتى يتعافى الفأر تماما من التخدير.
5. راقب التعافي بعد الجراحة خلال الأسبوعين الأولين أو كما هو مطلوب بموجب الإرشادات المؤسسية.

النتائج

تجميع الخلايا مهم لتعزيز الاتصال والإشارات من خلية إلى خلية. دعم تغليف مجاميع الخلايا داخل مصفوفة الغشاء القاعدي كلا من الثقافات ثلاثية الأبعاد لتشكيل الأنسجة العضوية في المختبر وسهل التسليم الميكانيكي للخلايا في كبسولة الكلى لزرع الكسب غير المشروع. لإنشاء هذه التركيبات ، تم الحفا?...

Discussion

يمثل تجميع خلايا الطحال الوليدي داخل وسط شبه صلب طريقة قابلة للتطبيق لتوليد تركيبات الطحال. تم استخدام بروتوكولات مماثلة قائمة على مصفوفة الغشاء القاعدي لبدء مزارع الطحال ثلاثية الأبعاد¹⁰. هنا ، نوضح أن تركيبات الطحال قابلة بنفس القدر لأنظمة الاستزراع العضوي في المختبر ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 Well Polypropylene 1.2 mL Cluster Tubes	Corning	CLS4401	For placing inside a 14 ml conical tube
B-mercaptoethanol	Gibco	21985023	Stock 55 mM, use at 50 uM
Collagenase D	Roche	11088858001
Collagenase IV	Sigma-Aldrich	C5138	From Clostridium histolyticum
Deoxyribonuclease I (DNase I)	Sigma-Aldrich	D4513	Deoxyribonuclease I from bovine pancreas,Type II-S, lyophilized powder, Protein ≥80 %, ≥2,000 units/mg protein
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796	4500 mg/L Glucose, L-Glutamine, and Sodium Bicarbonate, without Sodium Pyruvate, Liquid. Sterile Filtered.
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537	Without calcium chloride and magnesium chloride, sterile-filtered
Eclipse 200 μl Pipette Tips	Labcon	1030-260-000	Bevel Point
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	26140-079	Lot# 1382243
GlutaMAX	Gibco	35050061	Stock 100X, use at 1X
Matrigel	Corning	354263	Matrigel matrix basement membrane High Concentration, Lot# 7330186
MEM Non-essential Amino Acids	Gibco	11140076	Stock 100X, use at 1X
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140122	Stock 10,000 units/ml Penicillin, 10,000 ug/ml Streptomycin
Reversible Cell Strainer	STEMCELL Technologies	27216	70 μm
Ring Tweezers	NAPOX	A-26	Ring size: 3 mm
Rock Inhibitor (Y-27632)	MedChemExpres	HY-10071
Thermofisher Heraeus Megafuge 40R Centrifuge	Thermofisher		Acceleration and deceleration speeds were set to 8
Ultra Fine Tweezers	EMS	78340-51S	Style 51S. Antimagnetic/anti-acid SA low carbon austenitic steel tweezers are corrosion resistant. Anti-glare satin finish.
Vicryl 5/0 Suture Ligapak Reel	Ethicon	J283G
Wiretrol II Long Wire Plunger	Drummond	5-000-2002-L	Stainless Steel Plunger, 25 & 50 μL/WRTL II, Long
Wound Clip Applier	MikRon	427630
Wound Clips	MikRon	427631	9 mm