Aggregazione cellulare incapsulata della matrice della membrana basale per lo studio della formazione del tessuto milza murino

Riepilogo

Questo articolo descrive un protocollo per l'aggregazione e l'incapsulamento delle cellule della milza all'interno di una matrice di membrana basale semisolida. I costrutti di matrice di membrana basale possono essere utilizzati in coltura tridimensionale per lo studio dello sviluppo di organoidi o per studi di trapianto e rigenerazione tissutale in vivo .

Abstract

La milza è un organo immunitario che svolge un ruolo chiave nelle risposte immunitarie trasmesse per via ematica. La perdita anatomica o funzionale di questo tessuto aumenta la suscettibilità a gravi infezioni del sangue e sepsi. L'autotrapianto di fette di milza è stato utilizzato clinicamente per sostituire il tessuto perso e ripristinare la funzione immunitaria. Tuttavia, il meccanismo che guida la rigenerazione del tessuto della milza robusto e immunologicamente funzionale non è stato completamente chiarito. Qui, miriamo a sviluppare un metodo per aggregare e incapsulare le cellule della milza all'interno di una matrice semi-solida al fine di studiare i requisiti cellulari per la formazione del tessuto della milza. I costrutti cellulari incapsulati con matrice di membrana basale sono suscettibili sia di coltura tissutale in vitro di organoidi tridimensionali che di trapianto sotto la capsula renale per valutare direttamente la formazione di tessuti in vivo . Manipolando le cellule di input per l'aggregazione e l'incapsulamento, dimostriamo che le cellule stromali neonatali PDGFR⁺MAdCAM-1^- derivate da innesto sono necessarie per la rigenerazione del tessuto della milza in modelli di trapianto animale.

Introduzione

La rottura traumatica della milza e la comparsa di noduli splenici multipli nel corpo è stata una delle prime indicazioni che il tessuto della milza ospitava capacità rigenerativa ^1,2. Gli autotrapianti di milza sono stati successivamente introdotti in clinica per preservare il tessuto della milza nei pazienti che necessitavano di splenectomia d'urgenza³. Eppure, nonostante faccia parte della pratica clinica da decenni, si sa molto poco su come si rigenera la milza. I modelli di trapianto animale hanno fornito informazioni su molteplici parametri della rigenerazione della milza e della funzione immunitaria ^4,5. In particolare, le modifiche sperimentali al metodo di preparazione dell'innesto hanno permesso di studiare in modo più dettagliato la rigenerazione tissutale a livello cellulare e molecolare.

I trapianti che coinvolgono fette intere di milza subiscono una fase di necrosi di massa prima che venga ricostruita una nuova struttura della milza⁶. La fase iniziale della necrosi del trapianto suggerisce che la maggior parte del tessuto trapiantato è costituito in gran parte da globuli rossi e bianchi e non è necessario per la rigenerazione della milza. Questo è stato studiato sperimentalmente escludendo le cellule ematopoietiche da innesti di milza prima del trapianto sotto la capsula renale di topo. In questo caso, la frazione non leucocitaria/non eritrocitaria della milza, che comprende le cellule stromali ed endoteliali, si è dimostrata sufficiente per indurre la formazione di tessuto de novo ⁷. Il tessuto stromale della milza potrebbe essere ulteriormente trasformato in una sospensione a singola cellula, consentendo l'uso di tecnologie di selezione cellulare per manipolare la composizione dell'innesto cellulare. Rimuovendo selettivamente i tipi di cellule candidate, sono state identificate due popolazioni di cellule stromali CD45-TER-119^- indispensabili per lo sviluppo del trapianto: una popolazione di cellule CD31⁺CD105⁺MAdCAM-1⁺ di tipo endoteliale e una popolazione di cellule mesenchimali PDGFRβ⁺ più ampiamente definita⁸.

La costruzione degli innesti da cellule di milza varia in termini di materiali di supporto e processi di caricamento delle cellule. Le milze ingegnerizzate con tessuti sono state precedentemente preparate caricando unità spleniche su uno scaffold polimerico di acido poliglicolico/acido poli-lattico ^5,9. È interessante notare che le cellule stromali della milza assorbite in una spugna di collagene non sono riuscite ad attecchire, mentre le cellule stromali aggregate e caricate su un foglio di collagene hanno facilitato la rigenerazione della milza⁸. È stato anche dimostrato che la risospensione delle cellule stromali della milza all'interno di una matrice di Matrigel induce l'aggregazione cellulare in condizioni di coltura tridimensionale¹⁰. Tuttavia, questo metodo non è stato testato per l'uso in modelli di trapianto. L'obiettivo generale dell'attuale protocollo è quello di aggregare e incapsulare forzatamente le cellule stromali della milza direttamente all'interno della matrice di membrana basale, che successivamente possono essere trasferite in un sistema di coltura tissutale tridimensionale in vitro o utilizzate come veicolo per trapianti su modelli animali (Figura 1 supplementare).

Protocollo

Tutte le procedure sugli animali sono state condotte secondo protocolli sperimentali approvati dal Comitato Etico Animale dell'Università del Queensland (UQBR/079/19).

1. Raccolta del tessuto e preparazione delle cellule stromali

1. Sopprimere topi donatori neonatali maschi e/o femmine di 0,5-1,5 giorni di età mediante induzione dell'ipotermia avvolgendo gli animali all'interno della carta velina e mettendoli sotto il ghiaccio tritato per >10 minuti.
   NOTA: Questo protocollo può essere adattato a diversi ceppi di topi, età e numero di animali.
2. Preparare strumenti chirurgici sterili.
3. Appoggiare il mouse in una posizione laterale destra. Tamponare la pelle con etanolo all'80% ed eseguire un'incisione di 1 cm con le forbici chirurgiche Iris per esporre la parete peritoneale.
4. Fai una seconda incisione di 0,5 cm sopra la milza e usa un paio di pinze sottili per sollevare delicatamente il tessuto. Usa un paio di forbici chirurgiche per tagliare i vasi sanguigni e asportare il tessuto. Trasferire il tessuto in una capsula di Petri contenente soluzione salina tamponata con fosfato ghiacciato (PBS). Rimuovere il tessuto connettivo residuo attaccato alla milza.
   NOTA: Uno stereomicroscopio può aiutare i movimenti motori fini necessari per manipolare gli strumenti chirurgici.
5. Per dissociare interi tessuti, trasferire la milza neonatale (pool di 10 o meno) nel bordo interno di una provetta conica rovesciata da 14 ml. Distruggi meccanicamente i tessuti con un movimento di pressione utilizzando l'estremità posteriore in plastica di uno stantuffo per siringa da 1 ml.
6. Posizionare e fissare saldamente il tappo su una provetta conica da 14 mL contenente 10 mL di PBS freddo. Capovolgere il tubo 5 volte per lavare tutto il tessuto interrotto dal tappo al tubo.
7. Ripetere il passaggio 1.6 per tutti i tessuti rimanenti.
8. Lasciare la provetta sul ghiaccio per 1 minuto per lasciare che il tessuto si depositi sul fondo della provetta.
9. Scartare con cautela il surnatante (contenente cellule ematopoietiche) facendo passare la soluzione attraverso un colino cellulare reversibile da 70 μm.
10. Recuperare la frazione stromale non solubile invertendo il colino e lavando nuovamente il tessuto stromale nella provetta conica da 14 mL utilizzando 2 mL appena preparati di Dulbecco's Modified Eagle Medium (sDMEM) integrato contenente 1 mg/mL di collagenasi IV, 40 μg/mL di DNasi I e 2% di siero fetale bovino (FBS).
    ATTENZIONE: La collagenasi IV e la collagenasi D sono sostanze pericolose e devono essere maneggiate all'interno di un armadio di biosicurezza con adeguati dispositivi di protezione individuale.
11. Per preparare una sospensione unicellulare, digerire enzimaticamente il tessuto aggregato (fino a 20) per 10 minuti a 37 °C con rotazione costante.
12. Aggiungere 4 mL di sDMEM appena preparato contenente 1 mg/mL di collagenasi D, 40 μg/mL di DNasi I e 2% di FBS direttamente nella provetta contenente il tessuto stromale. Incubare per altri 10 minuti a 37 °C con rotazione costante.
13. Arrestare la digestione aggiungendo 8 ml di PBS ghiacciato. Raccogliere le cellule centrifugando a 200 x g per 5 minuti a 4 °C.
14. Scartare il surnatante e lavare le cellule due volte sospendendo in 1 mL di PBS freddo e centrifugando a 200 x g per 5 minuti a 4 °C. Mantieni le cellule sul ghiaccio.
    NOTA: Le cellule possono essere contate e regolate alla concentrazione desiderata. Ciò può richiedere l'ottimizzazione per diverse popolazioni cellulari. Utilizzando questo protocollo, 0,5 x 10⁶- 1 x 10⁶ cellule stromali/milza vengono in genere recuperate, a seconda dell'età dei topi donatori. Le cellule possono opzionalmente essere colorate e ordinate FACS in questa fase per definire la composizione cellulare.

2. Incapsulamento matriciale di aggregati cellulari

1. Preraffreddare i puntali sterili per pipette P200 all'interno di un congelatore a -20 °C.
2. Tagliare la pellicola flessibile da laboratorio (ad es. Parafilm) in pezzi di 1 cm x 2 cm e sterilizzare immergendola in etanolo all'80% per 10 minuti, seguita da PBS per 10 minuti. La pellicola da laboratorio può essere preparata in anticipo e conservata sterile.
3. Preparare 0,5 x 10 6-2,5 x 10⁶ cellule centrifugando a 200 x g per 5 minuti a 4 °C. Aspirare con cautela il surnatante, lasciando circa 20 μL del volume di PBS rimanente. Tenere il pellet cellulare sul ghiaccio.
   NOTA: Il PBS rimanente può essere aspirato delicatamente senza disturbare il pellet della cella per confermare il volume.
4. Aspirare 2 μL di matrice di membrana basale ghiacciata in un puntale per pipetta P200 preraffreddato, utilizzando un pipettor P20.
   NOTA: Una matrice di membrana basale altamente concentrata (ad es. Corning Matrigel Matrix High Concentration) aiuta a formare un forte tappo solidificato.
5. Ruotare delicatamente per espellere il puntale della pipetta. Stendere una striscia pre-sterilizzata della pellicola da laboratorio e posizionarla sull'estremità del puntale della pipetta, facendo attenzione a non perforare la pellicola. Continuare ad avvolgere il puntale nella pellicola per sigillare il puntale della pipetta. Posizionare con cautela la punta sigillata direttamente sul ghiaccio, facendo attenzione a non rompere la pellicola.
6. Risospendere il pellet cellulare nel PBS rimanente e stratificare delicatamente la soluzione sulla matrice della membrana basale. Tieni il costrutto sul ghiaccio.
7. Preparare una provetta di centrifugazione inserendo una provetta cluster da 1,2 mL all'interno di una provetta conica da 14 mL.
8. Posizionare il puntale della pipetta all'interno della configurazione della provetta nidificata e centrifugare a 400 x g e 4 °C per 5 minuti.
9. Posizionare la provetta conica da 14 mL con orientamento verticale e incubare a 37 °C per 15 minuti per consentire alla matrice della membrana basale di solidificarsi all'interno del puntale della pipetta.
   NOTA: La provetta conica da 14 mL può essere posizionata sul ghiaccio fino a quando non è necessaria per l'applicazione a valle.

3. Coltura di organoidi tridimensionali

1. Rimuovere con cautela la pellicola di laboratorio dal puntale della pipetta.
2. Inserire uno stantuffo sottile in filo di acciaio inossidabile attraverso l'apertura più grande del puntale della pipetta.
3. Espellere il tappo della matrice fino a quando non viene rilasciato attraverso la punta in un pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 6 pozzetti non trattata contenente 2 mL di sDMEM integrato con il 10% di FBS, 1x Glutamax, 1x Aminoacidi non essenziali (NEAA), 10 μM Rock Inhibitor, 10 U/mL di penicillina/streptomicina e 50 μM di β-mercaptoetanolo.
   NOTA: Il recipiente di coltura tissutale e il volume del terreno corrispondente possono essere regolati secondo necessità.
   ATTENZIONE: NEAA, Penicillina/Streptomicina e β-mercaptoetanolo sono sostanze pericolose e devono essere maneggiate all'interno di un armadio di biosicurezza con adeguati dispositivi di protezione individuale.
4. Coltivare organoidi a 37 °C, 5% di CO₂ e 95% di umidità per 4-12 settimane.
5. Sostituisci metà del mezzo ogni 5 giorni.
   NOTA: Se gli organoidi iniziano ad attaccarsi alla piastra di coltura tissutale, trasferirli in un pozzetto nuovo.

4. Trapianto di capsule renali

1. Preparare strumenti chirurgici sterili.
2. Eseguire un trapianto di rene subcapsulare del tappo della matrice della membrana basale:
   1. Anestetizzare un topo ricevente femmina BALB/c di 8 settimane con isoflurano seguendo le linee guida per l'etica degli animali istituzionali.
      ATTENZIONE: L'isoflurano è una sostanza pericolosa. I gas di scarico devono essere eliminati per impedire l'ingresso nell'ambiente di lavoro.
   2. Appoggiare il mouse in una posizione laterale destra.
   3. Radere i peli dal sito dell'intervento chirurgico e disinfettare la pelle seguendo le linee guida istituzionali.
      NOTA: Si consiglia di disinfettare il sito chirurgico tre volte con movimenti circolari alternando scrub a base di iodio o clorexidina e alcol.
   4. Praticare un'incisione di 2 cm nella pelle perpendicolare alla colonna vertebrale per esporre la parete peritoneale.
      NOTA: Per l'incisione cutanea è possibile utilizzare forbici chirurgiche fini o una lama per bisturi. Gli utenti devono seguire le linee guida per l'etica istituzionale degli animali o le procedure operative standard.
   5. Praticare un'incisione più piccola di 0,5 cm nella parete peritoneale sopra il rene.
      NOTA: L'incisione deve approssimare la larghezza del rene per garantire che il rene rimanga esteriorizzato durante il trapianto.
   6. Esternalizzare il rene attraverso l'apertura peritoneale esercitando una pressione verso il basso utilizzando il pollice e l'indice. Un paio di pinzette ad anello possono essere utilizzate per aiutare l'esteriorizzazione. Assicurarsi che il rene sia umido durante la procedura applicando regolarmente PBS sterile utilizzando un batuffolo di cotone.
   7. Sotto uno stereomicroscopio, pizzicare il grasso perirenale della capsula renale con un paio di pinze ultrafini piegate su un polo del rene. Utilizzare un secondo paio di pinze ultrafini piegate per strappare delicatamente la membrana della capsula renale verso l'alto in direzione opposta, creando una piccola apertura.
   8. Inserire con cautela il polo di una pinza sotto la membrana della capsula. Utilizzare un movimento lento per separare la membrana della capsula dal parenchima renale.
   9. Preparare il tappo della matrice della membrana basale per il trapianto rimuovendo la pellicola di laboratorio dal puntale della pipetta.
   10. Sollevare la capsula renale utilizzando un polo della pinza e inserire la punta della pipetta attraverso l'apertura, spingendola verso il polo opposto del rene.
   11. Inserire uno stantuffo metallico nel puntale della pipetta ed espellere il tappo della matrice estraendo contemporaneamente il puntale della pipetta dal rene.
   12. Inumidire il rene con PBS e reinternalizzare.
   13. Chiudere la parete peritoneale con una sutura 5-0 Vicryl e chiudere la pelle con due autoclip.
   14. Somministrare analgesico (buprenorfina a 0,05-0,1 mg/kg per via sottocutanea o seguendo le linee guida istituzionali per l'etica degli animali).
       ATTENZIONE: La buprenorfina è una sostanza pericolosa e deve essere maneggiata con adeguati dispositivi di protezione individuale.
3. Disattiva il flusso di isoflurano ma mantieni il flusso di ossigeno per consentire al topo di respirare ossigeno puro fino a quando non inizia a prendere coscienza.
4. Riporta il topo nella sua gabbia. Mantieni l'animale al caldo durante il recupero posizionando parzialmente la gabbia sopra un termoforo o sotto una lampada riscaldante e monitora fino a quando il topo non si riprende completamente dall'anestesia.
5. Monitorare il recupero post-chirurgico per le prime due settimane o come richiesto dalle linee guida istituzionali.

Risultati

L'aggregazione cellulare è importante per promuovere il contatto e la segnalazione cellula-cellula. L'incapsulamento di aggregati cellulari all'interno della matrice di membrana basale ha supportato sia le colture tridimensionali per la formazione di organoidi tissutali in vitro che ha facilitato la consegna meccanica delle cellule nella capsula renale per il trapianto di innesto. Per stabilire questi costrutti, la matrice di membrana basale è stata prima mantenuta in uno stato fluidico in condizioni di freddo...

Discussione

L'aggregazione di cellule neonatali della milza all'interno di un mezzo semisolido rappresenta un metodo praticabile per generare costrutti di milza. Protocolli simili basati sulla matrice della membrana basale sono stati utilizzati per avviare colture tridimensionali di milza¹⁰. Qui, dimostriamo che i costrutti di milza sono ugualmente suscettibili di sistemi di coltura di organoidi in vitro e di modelli di trapianto in vivo . Da notare che il trapianto di organoidi di milza col...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 Well Polypropylene 1.2 mL Cluster Tubes	Corning	CLS4401	For placing inside a 14 ml conical tube
B-mercaptoethanol	Gibco	21985023	Stock 55 mM, use at 50 uM
Collagenase D	Roche	11088858001
Collagenase IV	Sigma-Aldrich	C5138	From Clostridium histolyticum
Deoxyribonuclease I (DNase I)	Sigma-Aldrich	D4513	Deoxyribonuclease I from bovine pancreas,Type II-S, lyophilized powder, Protein ≥80 %, ≥2,000 units/mg protein
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796	4500 mg/L Glucose, L-Glutamine, and Sodium Bicarbonate, without Sodium Pyruvate, Liquid. Sterile Filtered.
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537	Without calcium chloride and magnesium chloride, sterile-filtered
Eclipse 200 μl Pipette Tips	Labcon	1030-260-000	Bevel Point
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	26140-079	Lot# 1382243
GlutaMAX	Gibco	35050061	Stock 100X, use at 1X
Matrigel	Corning	354263	Matrigel matrix basement membrane High Concentration, Lot# 7330186
MEM Non-essential Amino Acids	Gibco	11140076	Stock 100X, use at 1X
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140122	Stock 10,000 units/ml Penicillin, 10,000 ug/ml Streptomycin
Reversible Cell Strainer	STEMCELL Technologies	27216	70 μm
Ring Tweezers	NAPOX	A-26	Ring size: 3 mm
Rock Inhibitor (Y-27632)	MedChemExpres	HY-10071
Thermofisher Heraeus Megafuge 40R Centrifuge	Thermofisher		Acceleration and deceleration speeds were set to 8
Ultra Fine Tweezers	EMS	78340-51S	Style 51S. Antimagnetic/anti-acid SA low carbon austenitic steel tweezers are corrosion resistant. Anti-glare satin finish.
Vicryl 5/0 Suture Ligapak Reel	Ethicon	J283G
Wiretrol II Long Wire Plunger	Drummond	5-000-2002-L	Stainless Steel Plunger, 25 & 50 μL/WRTL II, Long
Wound Clip Applier	MikRon	427630
Wound Clips	MikRon	427631	9 mm