Agregação celular encapsulada da matriz da membrana basal para investigação da formação do tecido do baço murino

Resumo

Este artigo descreve um protocolo para agregação e encapsulamento de células do baço dentro de uma matriz de membrana basal semissólida. Construções de matriz de membrana basal podem ser usadas em cultura tridimensional para estudar o desenvolvimento de organoides, ou para estudos de transplante in vivo e regeneração tecidual.

Resumo

O baço é um órgão imunológico que desempenha um papel fundamental nas respostas imunes transmitidas pelo sangue. A perda anatômica ou funcional desse tecido aumenta a suscetibilidade a infecções sanguíneas graves e sepse. O autotransplante de cortes de baço tem sido usado clinicamente para repor o tecido perdido e restaurar a função imunológica. No entanto, o mecanismo que conduz a regeneração robusta e imunologicamente funcional do tecido baço ainda não foi totalmente elucidado. Aqui, pretendemos desenvolver um método para agregar e encapsular células do baço dentro de uma matriz semissólida, a fim de investigar as necessidades celulares para a formação de tecido esplênico. Construções celulares encapsuladas em matriz de membrana basal são passíveis tanto de cultura in vitro de organoides tridimensionais quanto de transplante sob a cápsula renal para avaliar diretamente a formação de tecidos in vivo . Através da manipulação das células de entrada para agregação e encapsulamento, demonstramos que as células estromais neonatais PDGFRβ⁺MAdCAM-1^- derivadas do enxerto são necessárias para a regeneração do tecido esplênico em modelos de transplante animal.

Introdução

A ruptura traumática do baço e o aparecimento de múltiplos nódulos esplênicos no corpo foi um dos primeiros indícios de que o tecido esplênico abrigava capacidade regenerativa ^1,2. Os autotransplantes de baço foram posteriormente introduzidos na clínica para preservar o tecido esplênico em pacientes que necessitaram de esplenectomia de emergência³. No entanto, apesar de fazer parte da prática clínica há décadas, muito pouco se sabe sobre como o baço se regenera. Modelos de transplante animal têm fornecido informações sobre múltiplos parâmetros da regeneração do baço e da função imune ^4,5. Em particular, modificações experimentais no método de preparo do enxerto têm permitido que a regeneração tecidual seja estudada com mais detalhes em nível celular e molecular.

Os transplantes com cortes inteiros do baço passam por uma fase de necrose de massa antes da reconstrução de uma nova estrutura esplênica⁶. A fase inicial da necrose do enxerto sugere que a maior parte do tecido transplantado consiste em grande parte de glóbulos vermelhos e brancos e é desnecessária para a regeneração do baço. Isso foi investigado experimentalmente pela exclusão de células hematopoéticas de enxertos de baço antes do transplante sob a cápsula renal de camundongo. Aqui, a fração não leucocitária/não eritrocitária do baço, que inclui células estromais e endoteliais, mostrou-se suficiente para induzir a formação de novo ^tecido7. O tecido estromal do baço poderia ser processado em uma suspensão de célula única, permitindo o uso de tecnologias de classificação celular para manipular a composição do enxerto celular. Ao remover seletivamente os tipos celulares candidatos, foram identificadas duas populações de células estromais ^{CD45-TER-119-} indispensáveis para o desenvolvimento do enxerto: uma população de células CD31⁺CD105⁺MAdCAM-1⁺ do tipo endotelial e uma população de células mesenquimais PDGFRβ⁺ mais amplamente^definida8.

A construção de enxertos a partir de células do baço varia em termos de materiais de suporte e processos de carregamento celular. Baços manipulados por tecidos foram previamente preparados carregando unidades esplênicas em um arcabouço poliglicólico de polímero de ácido poliglicólico/poli-L^de ácido lático ^5,9. Curiosamente, as células estromais do baço absorvidas em uma esponja de colágeno falharam em enxertar, enquanto as células estromais agregadas e carregadas sobre uma folha de colágeno facilitaram a regeneração do baço⁸. A ressuspensão de células estromais do baço dentro de uma matriz de Matrigel também demonstrou induzir agregação celular em condições de cultura tridimensional¹⁰. Entretanto, esse método ainda não foi testado para uso em modelos de transplante. O objetivo geral do protocolo atual é agregar e encapsular à força células estromais do baço diretamente na matriz da membrana basal, que posteriormente podem ser transferidas para um sistema tridimensional de cultura de tecidos in vitro ou usadas como veículo para transplantes em modelo animal (Figura 1 Suplementar).

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Protocolo

Todos os procedimentos com animais foram conduzidos de acordo com protocolos experimentais aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Universidade de Queensland (UQBR/079/19).

1. Coleta de tecidos e preparo de células estromais

1. Eutanásia de camundongos doadores neonatais BALB/c machos e/ou fêmeas de 0,5-1,5 dias de idade por indução de hipotermia, envolvendo os animais dentro do papel higiênico e colocando-os sob gelo triturado por >10 min.
   NOTA: Este protocolo pode ser adaptado a diferentes linhagens de camundongos, idades e número de animais.
2. Preparar instrumentos cirúrgicos estéreis.
3. Coloque o mouse na posição lateral direita. Esfregue a pele com etanol 80% e faça uma incisão de 1 cm com tesoura cirúrgica Iris para expor a parede peritoneal.
4. Faça uma segunda incisão de 0,5 cm acima do baço e use um par de pinças finas para levantar suavemente o tecido. Use uma tesoura cirúrgica para cortar os vasos sanguíneos e excisar o tecido. Transfira o tecido para uma placa de Petri contendo solução salina tamponada com fosfato (PBS) gelada. Remova qualquer tecido conjuntivo restante ligado ao baço.
   NOTA: Um estereomicroscópio pode auxiliar os movimentos motores finos necessários para manipular instrumentos cirúrgicos.
5. Para dissociar tecidos inteiros, transfira baços neonatais (pools de 10 ou menos) para a borda interna de uma tampa de tubo cônico invertida de 14 mL. Interrompa mecanicamente os tecidos com um movimento de pressão usando a extremidade traseira de plástico de um êmbolo de seringa de 1 mL.
6. Coloque e prenda bem a tampa sobre um tubo cônico de 14 mL contendo 10 mL de PBS frio. Inverta o tubo 5x para lavar todo o tecido rompido da tampa para o tubo.
7. Repetir o passo 1.6 para qualquer tecido restante.
8. Deixe o tubo no gelo por 1 min para deixar o tecido assentar no fundo do tubo.
9. Descarte cuidadosamente o sobrenadante (contendo células hematopoiéticas) passando a solução através de um filtro celular reversível de 70 μm.
10. Recuperar a fração estromal não solúvel invertendo o filtro e lavando o tecido estromal de volta para o tubo cônico de 14 mL usando 2 mL recém-preparados de meio Dulbecco's Modified Eagle Medium (sDMEM) suplementado contendo 1 mg/mL de colagenase IV, 40 μg/mL de DNase I e 2% de soro fetal bovino (FBS).
    ATENÇÃO: A colagenase IV e a colagenase D são substâncias perigosas e devem ser manuseadas dentro de um armário de biossegurança com equipamentos de proteção individual adequados.
11. Para preparar uma suspensão de célula única, digerir enzimaticamente o tecido acumulado (até 20) por 10 min a 37 °C com rotação constante.
12. Adicionar 4 mL de sDMEM recém-preparado contendo 1 mg/mL de colagenase D, 40 μg/mL de DNase I e 2% de SFB diretamente ao tubo contendo tecido estromal. Incubar durante mais 10 minutos a 37 °C com rotação constante.
13. Interrompa a digestão adicionando 8 mL de PBS gelado. Recolher células centrifugando a 200 x g durante 5 min a 4 °C.
14. Eliminar o sobrenadante e lavar as células duas vezes, ressuspendendo em 1 ml de PBS frio e centrifugando a 200 x g durante 5 minutos a 4 °C. Mantenha as células no gelo.
    NOTA: As células podem ser contadas e ajustadas para uma concentração desejada. Isso pode exigir otimização para diferentes populações celulares. Usando este protocolo, 0,5 x 10⁶- 1 x 10⁶ células estromais/baço são tipicamente recuperadas, dependendo da idade dos camundongos doadores. As células podem, opcionalmente, ser coradas e classificadas FACS nesta fase para definir a composição celular.

2. Encapsulamento matricial de agregados celulares

1. Ponteiras de pipeta P200 estéreis pré-refrigeradas dentro de um congelador de -20 °C.
2. Corte o filme de laboratório flexível (por exemplo, Parafilm) em pedaços de 1 cm x 2 cm e esterilize submergindo em etanol 80% por 10 min, seguido de PBS por 10 min. O filme de laboratório pode ser preparado com antecedência e armazenado estéril.
3. Preparar 0,5 x 10 6-2,5 x 10⁶ células centrifugando a 200 x g durante 5 minutos a 4 °C. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante, deixando aproximadamente 20 μL do volume restante de PBS. Mantenha a pastilha de célula no gelo.
   NOTA: O PBS restante pode ser aspirado suavemente sem perturbar o pellet de célula para confirmar o volume.
4. Aspirar 2 μL de matriz de membrana basal gelada em uma ponteira de pipeta P200 pré-resfriada, usando um pipetador P20.
   NOTA: Uma matriz de membrana basal altamente concentrada (por exemplo, Corning Matrigel Matrix High Concentration) auxilia na formação de um forte plugue solidificado.
5. Torça suavemente para ejetar a ponta da pipeta. Estique uma tira pré-esterilizada do filme de laboratório e coloque-a sobre a extremidade da ponta da pipeta, tomando cuidado para não perfurar o filme. Continue a envolver a ponta no filme para selar a ponta da pipeta. Coloque cuidadosamente a ponta selada diretamente sobre o gelo, tomando cuidado para não romper a película.
6. Ressuspenda o pellet de células no PBS restante e coloque a solução suavemente sobre a matriz da membrana basal. Mantenha a construção no gelo.
7. Prepare um tubo de centrifugação colocando um tubo de cluster de 1,2 ml dentro de um tubo cónico de 14 ml.
8. Coloque a ponta da pipeta dentro da configuração do tubo aninhado e centrífuga a 400 x g e 4 °C durante 5 min.
9. Posicionar o tubo cônico de 14 mL em uma orientação vertical e incubar a 37 °C por 15 min para permitir que a matriz da membrana basal se solidifique dentro da ponta da pipeta.
   NOTA: O tubo cônico de 14 mL pode ser colocado no gelo até que seja necessário para a aplicação a jusante.

3. Cultura de organoides tridimensionais

1. Remova cuidadosamente o filme de laboratório da ponta da pipeta.
2. Insira um êmbolo fino de fio de aço inoxidável através da abertura maior da ponta da pipeta.
3. Expelir o plugue da matriz até que seja liberado através da ponta em um poço de uma placa de cultura de tecidos de 6 poços não tratada contendo 2 mL de sDMEM suplementado com 10% de SFB, 1x Glutamax, 1x Aminoácidos Não Essenciais (NEAA), 10 μM de Inibidor de Rocha, 10 U/mL de Penicilina/Estreptomicina e 50 μM de β-mercaptoetanol.
   NOTA: O vaso de cultura de tecidos e o volume de mídia correspondente podem ser ajustados conforme necessário.
   CUIDADO: NEAA, Penicilina/Estreptomicina e β-mercaptoetanol são substâncias perigosas e devem ser manuseadas dentro de um armário de biossegurança com equipamentos de proteção individual apropriados.
4. Organoides de cultura a 37 °C, 5% CO₂ e 95% de umidade por 4-12 semanas.
5. Substitua metade do meio a cada 5 dias.
   NOTA: Se os organoides começarem a se fixar à placa de cultura de tecidos, transfira para um poço fresco.

4. Transplante de cápsula renal

1. Preparar instrumentos cirúrgicos estéreis.
2. Realizar um transplante renal subcapsular do plugue de matriz da membrana basal:
   1. Anestesiar camundongos receptores BALB/c com 8 semanas de idade com isoflurano seguindo as Diretrizes Institucionais de Ética Animal.
      CUIDADO: O isoflurano é uma substância perigosa. Os gases residuais devem ser eliminados para evitar a entrada no ambiente de trabalho.
   2. Coloque o mouse na posição lateral direita.
   3. Raspar os cabelos do local da cirurgia e desinfetar a pele seguindo as Diretrizes Institucionais.
      OBS: Recomenda-se que o sítio cirúrgico seja desinfetado três vezes em movimento circular com esfoliação alternadamente à base de iodo ou clorexidina e à base de álcool.
   4. Faça uma incisão de 2 cm na pele perpendicular à coluna para expor a parede peritoneal.
      NOTA: Uma tesoura cirúrgica fina ou uma lâmina de bisturi podem ser usadas para incisão da pele. Os usuários devem seguir as Diretrizes Institucionais de Ética Animal ou Procedimentos Operacionais Padrão.
   5. Faça uma incisão menor de 0,5 cm na parede peritoneal acima do rim.
      NOTA: A incisão deve aproximar a largura do rim para garantir que o rim permaneça exteriorizado durante o transplante.
   6. Exteriorize o rim através da abertura peritoneal aplicando pressão para baixo usando o polegar e o indicador. Um par de pinças de anel pode ser usado para auxiliar a exteriorização. Certifique-se de que o rim está úmido durante todo o procedimento, aplicando regularmente PBS estéril usando um cotonete.
   7. Sob um estereomicroscópio, pinça a gordura perirrenal da cápsula renal com um par de pinças ultrafinas dobradas em um polo do rim. Use um segundo par de pinças ultrafinas dobradas para rasgar suavemente a membrana da cápsula renal para cima em uma direção oposta, criando uma pequena abertura.
   8. Insira cuidadosamente o pino de uma pinça sob a membrana da cápsula. Use um movimento de varredura lento para separar a membrana da cápsula do parênquima renal.
   9. Prepare o plugue da matriz da membrana basal para transplante removendo o filme de laboratório da ponta da pipeta.
   10. Levante a cápsula renal usando um pino da pinça e insira a ponta da pipeta através da abertura, empurrando-a em direção ao polo oposto do rim.
   11. Insira um êmbolo de arame na ponta da pipeta e expulse o plugue matricial, retirando simultaneamente a ponta da pipeta do rim.
   12. Umedeça o rim com PBS e volte a internalizar.
   13. Fechar a parede peritoneal com um fio de Vicryl 5-0 e fechar a pele com dois autoclipes.
   14. Administrar analgésico (Buprenorfina a 0,05-0,1 mg/kg por via subcutânea ou seguindo as Diretrizes Institucionais de Ética Animal).
       CUIDADO: A buprenorfina é uma substância perigosa e deve ser manuseada com equipamentos de proteção individual adequados.
3. Desligue o fluxo de isoflurano, mas mantenha o fluxo de oxigênio ligado para permitir que o rato respire oxigênio puro até começar a ganhar consciência.
4. Devolva o mouse à gaiola. Mantenha o animal aquecido durante a recuperação, colocando parcialmente a gaiola em cima de uma almofada de aquecimento ou sob uma lâmpada de calor, e monitore até que o rato se recupere totalmente da anestesia.
5. Monitorar a recuperação pós-cirúrgica nas primeiras duas semanas ou conforme exigido pelas Diretrizes Institucionais.

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Resultados

A agregação celular é importante para promover o contato e a sinalização célula-a-célula. Os agregados celulares que envolvem o interior da matriz da membrana basal suportaram ambas as culturas tridimensionais para a formação de organoides teciduais in vitro e facilitaram a entrega mecânica das células na cápsula renal para o transplante do enxerto. Para estabelecer esses construtos, a matriz da membrana basal foi primeiramente mantida em estado fluídico sob condições geladas. A agregação celula...

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Discussão

A agregação de células neonatais do baço dentro de um meio semissólido representa um método viável para a geração de construtos esplênicos. Protocolos semelhantes baseados em matriz de membrana basal têm sido utilizados para iniciar culturas tridimensionais do baço¹⁰. Aqui, demonstramos que construtos esplênicos são igualmente passíveis de sistemas de cultura de organoides in vitro , bem como de modelos de transplante in vivo . É importante ressaltar que o transpl...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 Well Polypropylene 1.2 mL Cluster Tubes	Corning	CLS4401	For placing inside a 14 ml conical tube
B-mercaptoethanol	Gibco	21985023	Stock 55 mM, use at 50 uM
Collagenase D	Roche	11088858001
Collagenase IV	Sigma-Aldrich	C5138	From Clostridium histolyticum
Deoxyribonuclease I (DNase I)	Sigma-Aldrich	D4513	Deoxyribonuclease I from bovine pancreas,Type II-S, lyophilized powder, Protein ≥80 %, ≥2,000 units/mg protein
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796	4500 mg/L Glucose, L-Glutamine, and Sodium Bicarbonate, without Sodium Pyruvate, Liquid. Sterile Filtered.
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537	Without calcium chloride and magnesium chloride, sterile-filtered
Eclipse 200 μl Pipette Tips	Labcon	1030-260-000	Bevel Point
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	26140-079	Lot# 1382243
GlutaMAX	Gibco	35050061	Stock 100X, use at 1X
Matrigel	Corning	354263	Matrigel matrix basement membrane High Concentration, Lot# 7330186
MEM Non-essential Amino Acids	Gibco	11140076	Stock 100X, use at 1X
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140122	Stock 10,000 units/ml Penicillin, 10,000 ug/ml Streptomycin
Reversible Cell Strainer	STEMCELL Technologies	27216	70 μm
Ring Tweezers	NAPOX	A-26	Ring size: 3 mm
Rock Inhibitor (Y-27632)	MedChemExpres	HY-10071
Thermofisher Heraeus Megafuge 40R Centrifuge	Thermofisher		Acceleration and deceleration speeds were set to 8
Ultra Fine Tweezers	EMS	78340-51S	Style 51S. Antimagnetic/anti-acid SA low carbon austenitic steel tweezers are corrosion resistant. Anti-glare satin finish.
Vicryl 5/0 Suture Ligapak Reel	Ethicon	J283G
Wiretrol II Long Wire Plunger	Drummond	5-000-2002-L	Stainless Steel Plunger, 25 & 50 μL/WRTL II, Long
Wound Clip Applier	MikRon	427630
Wound Clips	MikRon	427631	9 mm