AGRÉGATION DE CELLULES ENCAPSULÉES DANS UNE MATRICE DE MEMBRANE BASALE POUR ÉTUDIER LA FORMATION DE TISSU DE RATE MURIN

Résumé

Cet article décrit un protocole d’agrégation et d’encapsulation des cellules de rate dans une matrice de membrane basale semi-solide. Les constructions de matrice de membrane basale peuvent être utilisées en culture tridimensionnelle pour étudier le développement des organoïdes, ou pour des études de transplantation et de régénération tissulaire in vivo .

Résumé

La rate est un organe immunitaire qui joue un rôle clé dans les réponses immunitaires transmissibles par le sang. La perte anatomique ou fonctionnelle de ce tissu augmente la susceptibilité aux infections sanguines graves et à la septicémie. L’auto-transplantation de tranches de rate a été utilisée cliniquement pour remplacer les tissus perdus et restaurer la fonction immunitaire. Cependant, le mécanisme à l’origine d’une régénération robuste et immunologiquement fonctionnelle du tissu de la rate n’a pas été entièrement élucidé. Ici, nous visons à développer une méthode d’agrégation et d’encapsulation de cellules de rate dans une matrice semi-solide afin d’étudier les besoins cellulaires pour la formation du tissu de la rate. Les constructions cellulaires encapsulées dans la matrice de la membrane basale se prêtent à la fois à la culture tissulaire in vitro d’organoïdes tridimensionnels et à la transplantation sous la capsule rénale pour évaluer directement la formation tissulaire in vivo . En manipulant les cellules d’entrée pour l’agrégation et l’encapsulation, nous démontrons que les cellules stromales néonatales PDGFRβ⁺MAdCAM-1^- dérivées du greffon sont nécessaires à la régénération du tissu de la rate dans des modèles de transplantation animale.

Introduction

La rupture traumatique de la rate et l’apparition de multiples nodules spléniques dans le corps ont été l’une des premières indications que le tissu de la rate abritait une capacité de régénération ^1,2. Les autotransplantations de rate ont ensuite été introduites en clinique pour préserver le tissu de la rate chez les patients nécessitant une splénectomie^{d’urgence 3}. Pourtant, bien qu’elle fasse partie de la pratique clinique depuis des décennies, on sait très peu de choses sur la façon dont la rate se régénère. Les modèles de transplantation animale ont permis de mieux comprendre de multiples paramètres de la régénération de la rate et de la fonction immunitaire ^4,5. En particulier, des modifications expérimentales de la méthode de préparation des greffons ont permis d’étudier plus en détail la régénération tissulaire au niveau cellulaire et moléculaire.

Les transplantations impliquant des tranches entières de rate subissent une phase de nécrose massive avant qu’une nouvelle structure de rate ne soit reconstruite⁶. La phase initiale de la nécrose du greffon suggère que la majeure partie des tissus transplantés est constituée en grande partie de globules rouges et blancs et n’est pas nécessaire à la régénération de la rate. Cela a été étudié expérimentalement en excluant les cellules hématopoïétiques des greffes de rate avant la transplantation sous la capsule rénale de souris. Ici, la fraction non leucocytaire/non érythrocytaire de la rate, qui comprend les cellules stromales et endothéliales, s’est avérée suffisante pour induire la formation de tissu de novo ⁷. Le tissu stromal de la rate pourrait être transformé en une suspension unicellulaire, permettant l’utilisation de technologies de tri cellulaire pour manipuler la composition du greffon cellulaire. En éliminant sélectivement les types de cellules candidates, deux populations de cellules stromales CD45-TER-119^- ont été identifiées qui étaient indispensables au développement du greffon : une population de cellules CD31⁺CD105⁺MAdCAM-1⁺ de type endothélial et une population de cellules mésenchymateuses PDGFRβ⁺ plus largement^{définie 8}.

La construction des greffons à partir de cellules de rate varie en termes de matériaux de support et de processus de chargement cellulaire. Des rates issues de l’ingénierie tissulaire ont déjà été préparées en chargeant des unités spléniques sur un échafaudage polymère d’acide polyglycolique/polyacide lactique^{poly-L 5,9}. Il est intéressant de noter que les cellules stromales de la rate absorbées dans une éponge de collagène n’ont pas réussi à se greffer, tandis que les cellules stromales agrégées et chargées sur une feuille de collagène ont facilité la régénération de la rate⁸. Il a également été démontré que la remise en suspension des cellules stromales de la rate à l’intérieur d’une matrice Matrigel induit l’agrégation cellulaire dans des conditions de culture tridimensionnelles¹⁰. Cependant, cette méthode n’a pas été testée pour une utilisation dans des modèles de transplantation. L’objectif global du protocole actuel est d’agréger et d’encapsuler de force les cellules stromales de la rate directement dans la matrice de la membrane basale, qui peuvent ensuite être transférées dans un système de culture tissulaire in vitro tridimensionnel ou utilisées comme véhicule pour des transplantations de modèles animaux (Figure supplémentaire 1).

Protocole

Toutes les procédures sur les animaux ont été menées conformément aux protocoles expérimentaux approuvés par le comité d’éthique animale de l’Université du Queensland (UQBR/079/19).

1. Prélèvement de tissus et préparation de cellules stromales

1. Euthanasier des souris donneuses nouveau-nées BALB/c mâles et/ou femelles âgées de 0,5 à 1,5 jour par induction de l’hypothermie en enveloppant les animaux dans le papier de soie et en les plaçant sous de la glace pilée pendant >10 minutes.
   REMARQUE : Ce protocole peut être adapté à différentes souches de souris, âges et nombre d’animaux.
2. Préparer des instruments chirurgicaux stériles.
3. Posez la souris dans une position latérale droite. Frottez la peau avec de l’éthanol à 80 % et faites une incision de 1 cm avec des ciseaux chirurgicaux de l’iris pour exposer la paroi péritonéale.
4. Faites une deuxième incision de 0,5 cm au-dessus de la rate et utilisez une paire de pinces fines pour soulever doucement le tissu. Utilisez une paire de ciseaux chirurgicaux pour couper les vaisseaux sanguins et exciser les tissus. Transférez le tissu dans une boîte de Pétri contenant une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) glacée. Retirez tout tissu conjonctif restant attaché à la rate.
   REMARQUE : Un stéréomicroscope peut aider les mouvements de motricité fine nécessaires à la manipulation des instruments chirurgicaux.
5. Pour dissocier les tissus entiers, transférez la rate néonatale (flaques de 10 ou moins) dans le bord interne d’un capuchon tubulaire conique inversé de 14 ml. Perturber mécaniquement les tissus par un mouvement de pression à l’aide de l’extrémité arrière en plastique d’un piston de seringue de 1 ml.
6. Placez et fixez fermement le capuchon sur un tube conique de 14 ml contenant 10 ml de PBS froid. Retournez le tube 5 fois pour laver tous les tissus perturbés du capuchon dans le tube.
7. Répétez l’étape 1.6 pour les tissus restants.
8. Laissez le tube sur de la glace pendant 1 min pour laisser le tissu se déposer au fond du tube.
9. Jeter soigneusement le surnageant (contenant des cellules hématopoïétiques) en faisant passer la solution dans une passoire cellulaire réversible de 70 μm.
10. Récupérer la fraction stromale non soluble en inversant la passoire et en lavant le tissu stromal dans le tube conique de 14 mL à l’aide de 2 mL de milieu Eagle modifié de Dulbecco (sDMEM) fraîchement préparé contenant 1 mg/mL de collagénase IV, 40 μg/mL de DNase I et 2 % de sérum de veau fœtal (FBS).
    ATTENTION : La collagénase IV et la collagénase D sont des substances dangereuses et doivent être manipulées à l’intérieur d’une enceinte de sécurité biologique avec un équipement de protection individuelle approprié.
11. Pour préparer une suspension unicellulaire, digérer par voie enzymatique les tissus mélangés (jusqu’à 20) pendant 10 min à 37 °C avec une rotation constante.
12. Ajouter 4 mL de sDMEM fraîchement préparé contenant 1 mg/mL de collagénase D, 40 μg/mL de DNase I et 2 % de FBS directement dans le tube contenant le tissu stromal. Incuber encore 10 min à 37 °C avec une rotation constante.
13. Arrêtez la digestion en ajoutant 8 ml de PBS glacé. Prélever les cellules par centrifugation à 200 x g pendant 5 min à 4 °C.
14. Jeter le surnageant et laver les cellules deux fois en les remettant en suspension dans 1 mL de PBS froid et en les centrifugeant à 200 x g pendant 5 min à 4 °C. Gardez les cellules sur la glace.
    REMARQUE : Les cellules peuvent être comptées et ajustées à la concentration souhaitée. Cela peut nécessiter une optimisation pour différentes populations cellulaires. En utilisant ce protocole, 0,5 x 10⁶- 1 x 10⁶ cellules stromales / rate sont généralement récupérées, en fonction de l’âge des souris donneuses. Les cellules peuvent éventuellement être colorées et triées FACS à ce stade pour définir la composition des cellules.

2. Encapsulation matricielle d’agrégats cellulaires

1. Pré-refroidissez les pointes de pipette stériles P200 dans un congélateur à -20 °C.
2. Couper un film de laboratoire flexible (p. ex., Parafilm) en morceaux de 1 cm x 2 cm et stériliser en l’immergeant dans de l’éthanol à 80 % pendant 10 min, puis avec du PBS pendant 10 min. Le film de laboratoire peut être préparé à l’avance et conservé stérile.
3. Préparer 0,5 x 10 6-2,5 x 10⁶ cellules par centrifugation à 200 x g pendant 5 min à 4 °C. Aspirer soigneusement le surnageant, en laissant environ 20 μL du volume PBS restant. Gardez la pastille cellulaire sur de la glace.
   REMARQUE : Le PBS restant peut être aspiré doucement sans perturber la pastille cellulaire pour confirmer le volume.
4. Aspirer 2 μL de matrice de membrane basale glacée dans une pointe de pipette P200 pré-refroidie, à l’aide d’une pipette P20.
   REMARQUE : Une matrice de membrane basale hautement concentrée (par exemple, Corning Matrigel Matrix High Concentration) aide à former un bouchon solidifié solide.
5. Tournez doucement pour éjecter la pointe de la pipette. Étirez une bande pré-stérilisée du film de laboratoire et placez-la sur l’extrémité de la pointe de la pipette en prenant soin de ne pas percer le film. Continuez à envelopper la pointe dans le film pour sceller la pointe de la pipette. Placez délicatement l’embout scellé directement sur la glace, en prenant soin de ne pas rompre le film.
6. Remettre la pastille cellulaire en suspension dans le PBS restant et superposer doucement la solution sur la matrice de la membrane basale. Gardez la construction sur la glace.
7. Préparez un tube de centrifugation en plaçant un tube en grappe de 1,2 mL à l’intérieur d’un tube conique de 14 mL.
8. Placez la pointe de la pipette à l’intérieur de la configuration du tube emboîté et centrifugez à 400 x g et 4 °C pendant 5 min.
9. Positionner le tube conique de 14 mL dans une orientation verticale et incuber à 37 °C pendant 15 min pour permettre à la matrice de la membrane basale de se solidifier à l’intérieur de la pointe de la pipette.
   REMARQUE : Le tube conique de 14 mL peut être placé sur de la glace jusqu’à ce qu’il soit nécessaire pour une application en aval.

3. Culture d’organoïdes tridimensionnelle

1. Retirez délicatement le film de laboratoire de la pointe de la pipette.
2. Insérez un piston en fil d’acier inoxydable fin dans la plus grande ouverture de la pointe de la pipette.
3. Expulser le bouchon de matrice jusqu’à ce qu’il soit libéré par l’extrémité dans un puits d’une plaque de culture tissulaire non traitée à 6 puits contenant 2 mL de sDMEM complété par 10 % de FBS, 1 glutamax, 1 acide aminé non essentiel (NEAA), 10 μM d’inhibiteur de roche, 10 U/mL de pénicilline/streptomycine et 50 μM de β-mercaptoéthanol.
   REMARQUE : Le récipient de culture tissulaire et le volume de milieu correspondant peuvent être ajustés selon les besoins.
   ATTENTION : La NEAA, la pénicilline/streptomycine et le β-mercaptoéthanol sont des substances dangereuses et doivent être manipulés dans une enceinte de biosécurité avec un équipement de protection individuelle approprié.
4. Cultiver les organoïdes à 37 °C, 5 % de CO₂ et 95 % d’humidité pendant 4 à 12 semaines.
5. Remplacez la moitié du milieu tous les 5 jours.
   REMARQUE : Si les organoïdes commencent à se fixer à la plaque de culture tissulaire, transférez-les dans un puits frais.

4. Greffe de capsule rénale

1. Préparer des instruments chirurgicaux stériles.
2. Effectuer une transplantation rénale sous-capsulaire du bouchon de matrice de la membrane basale :
   1. Anesthésier une souris receveuse BALB/c âgée de 8 semaines avec de l’isoflurane conformément aux directives institutionnelles en matière d’éthique animale.
      ATTENTION : L’isoflurane est une substance dangereuse. Les gaz résiduaires doivent être récupérés pour empêcher l’entrée dans l’environnement de travail.
   2. Posez la souris dans une position latérale droite.
   3. Rasez les poils du site de la chirurgie et désinfectez la peau en suivant les directives institutionnelles.
      REMARQUE : Il est recommandé de désinfecter le site chirurgical trois fois en mouvement circulaire avec une alternance de gommage à base d’iode ou de chlorhexidine et d’alcool.
   4. Faites une incision de 2 cm dans la peau perpendiculairement à la colonne vertébrale pour exposer la paroi péritonéale.
      REMARQUE : Des ciseaux chirurgicaux fins ou une lame de scalpel peuvent être utilisés pour l’incision de la peau. Les utilisateurs doivent suivre les directives institutionnelles en matière d’éthique animale ou les procédures opérationnelles standard.
   5. Faites une petite incision de 0,5 cm dans la paroi péritonéale au-dessus du rein.
      REMARQUE : L’incision doit se rapprocher de la largeur du rein pour s’assurer que le rein reste extériorisé pendant la transplantation.
   6. Extériorisez le rein par l’ouverture péritonéale en appliquant une pression vers le bas à l’aide du pouce et de l’index. Une pince à épiler peut être utilisée pour faciliter l’extériorisation. Assurez-vous que le rein est humide tout au long de la procédure en appliquant régulièrement du PBS stérile à l’aide d’un coton-tige.
   7. Au stéréomicroscope, pincez la graisse périrénale de la capsule rénale avec une paire de pinces ultrafines pliées à un pôle du rein. Utilisez une deuxième paire de pinces ultrafines pliées pour déchirer doucement la membrane de la capsule rénale vers le haut dans une direction opposée, créant ainsi une petite ouverture.
   8. Insérez délicatement la broche d’une pince sous la membrane de la capsule. Utilisez un mouvement de balayage lent pour séparer la membrane de la capsule du parenchyme rénal.
   9. Préparez le bouchon de matrice de la membrane basale pour la transplantation en retirant le film de laboratoire de la pointe de la pipette.
   10. Soulevez la capsule rénale à l’aide d’une broche de la pince et insérez la pointe de la pipette à travers l’ouverture, en la poussant vers le pôle opposé du rein.
   11. Insérez un piston de fil dans la pointe de la pipette et expulsez le bouchon de la matrice tout en retirant simultanément la pointe de la pipette du rein.
   12. Humidifiez le rein avec du PBS et réintériorisez-le.
   13. Fermez la paroi péritonéale avec une suture Vicryl 5-0 et fermez la peau avec deux autoclips.
   14. Administrer un analgésique (buprénorphine à 0,05-0,1 mg/kg par voie sous-cutanée ou en suivant les directives institutionnelles en matière d’éthique animale).
       ATTENTION : La buprénorphine est une substance dangereuse et doit être manipulée avec un équipement de protection individuelle approprié.
3. Coupez le flux d’isoflurane mais gardez le flux d’oxygène pour permettre à la souris de respirer de l’oxygène pur jusqu’à ce qu’elle commence à reprendre conscience.
4. Remettez la souris dans sa cage. Gardez l’animal au chaud pendant la récupération en plaçant partiellement la cage sur un coussin chauffant ou sous une lampe chauffante, et surveillez jusqu’à ce que la souris se remette complètement de l’anesthésie.
5. Surveiller la récupération post-chirurgicale pendant les deux premières semaines ou selon les directives de l’établissement.

Résultats

L’agrégation cellulaire est importante pour favoriser le contact et la signalisation de cellule à cellule. L’enfermement d’agrégats cellulaires à l’intérieur de la matrice de la membrane basale a soutenu les deux cultures tridimensionnelles pour la formation d’organoïdes tissulaires in vitro et a facilité l’administration mécanique de cellules dans la capsule rénale pour la transplantation de greffons. Pour établir ces constructions, la matrice de la membrane basale a d’abord été mainte...

Discussion

L’agrégation de cellules de rate néonatale à l’intérieur d’un milieu semi-solide représente une méthode viable pour générer des constructions de rate. Des protocoles similaires basés sur la matrice de la membrane basale ont été utilisés pour initier des cultures tridimensionnelles de rate¹⁰. Ici, nous démontrons que les constructions de rate se prêtent aussi bien aux systèmes de culture d’organoïdes in vitro qu’aux modèles de transplantation in vivo . I...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 Well Polypropylene 1.2 mL Cluster Tubes	Corning	CLS4401	For placing inside a 14 ml conical tube
B-mercaptoethanol	Gibco	21985023	Stock 55 mM, use at 50 uM
Collagenase D	Roche	11088858001
Collagenase IV	Sigma-Aldrich	C5138	From Clostridium histolyticum
Deoxyribonuclease I (DNase I)	Sigma-Aldrich	D4513	Deoxyribonuclease I from bovine pancreas,Type II-S, lyophilized powder, Protein ≥80 %, ≥2,000 units/mg protein
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796	4500 mg/L Glucose, L-Glutamine, and Sodium Bicarbonate, without Sodium Pyruvate, Liquid. Sterile Filtered.
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537	Without calcium chloride and magnesium chloride, sterile-filtered
Eclipse 200 μl Pipette Tips	Labcon	1030-260-000	Bevel Point
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	26140-079	Lot# 1382243
GlutaMAX	Gibco	35050061	Stock 100X, use at 1X
Matrigel	Corning	354263	Matrigel matrix basement membrane High Concentration, Lot# 7330186
MEM Non-essential Amino Acids	Gibco	11140076	Stock 100X, use at 1X
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140122	Stock 10,000 units/ml Penicillin, 10,000 ug/ml Streptomycin
Reversible Cell Strainer	STEMCELL Technologies	27216	70 μm
Ring Tweezers	NAPOX	A-26	Ring size: 3 mm
Rock Inhibitor (Y-27632)	MedChemExpres	HY-10071
Thermofisher Heraeus Megafuge 40R Centrifuge	Thermofisher		Acceleration and deceleration speeds were set to 8
Ultra Fine Tweezers	EMS	78340-51S	Style 51S. Antimagnetic/anti-acid SA low carbon austenitic steel tweezers are corrosion resistant. Anti-glare satin finish.
Vicryl 5/0 Suture Ligapak Reel	Ethicon	J283G
Wiretrol II Long Wire Plunger	Drummond	5-000-2002-L	Stainless Steel Plunger, 25 & 50 μL/WRTL II, Long
Wound Clip Applier	MikRon	427630
Wound Clips	MikRon	427631	9 mm