Agregación celular encapsulada en matriz de membrana basal para investigar la formación de tejido del bazo murino

Resumen

Este artículo describe un protocolo para agregar y encapsular células del bazo dentro de una matriz semisólida de membrana basal. Las construcciones de matriz de membrana basal se pueden utilizar en cultivos tridimensionales para estudiar el desarrollo de organoides, o para estudios de trasplante in vivo y regeneración de tejidos.

Resumen

El bazo es un órgano inmunitario que desempeña un papel clave en las respuestas inmunitarias transmitidas por la sangre. La pérdida anatómica o funcional de este tejido aumenta la susceptibilidad a infecciones sanguíneas graves y sepsis. El autotrasplante de cortes de bazo se ha utilizado clínicamente para reemplazar el tejido perdido y restaurar la función inmunitaria. Sin embargo, el mecanismo que impulsa la regeneración robusta e inmunológicamente funcional del tejido del bazo no se ha dilucidado por completo. Aquí, nuestro objetivo es desarrollar un método para agregar y encapsular células del bazo dentro de una matriz semisólida con el fin de investigar los requisitos celulares para la formación de tejido del bazo. Las construcciones celulares encapsuladas en la matriz de la membrana basal son susceptibles tanto para el cultivo in vitro de organoides tridimensionales como para el trasplante bajo la cápsula renal para evaluar directamente la formación de tejido in vivo . Mediante la manipulación de las células de entrada para la agregación y encapsulación, demostramos que las células estromales neonatales derivadas del injerto PDGFRβ⁺MAdCAM-1^- son necesarias para la regeneración del tejido del bazo en modelos de trasplante animal.

Introducción

La rotura traumática del bazo y la aparición de múltiples nódulos esplénicos en el cuerpo fue uno de los primeros indicios de que el tejido del bazo albergaba capacidad regenerativa ^1,2. Posteriormente, se introdujeron en la clínica los autotrasplantes de bazo para preservar el tejido del bazo en pacientes que requerían esplenectomía de urgencia³. Sin embargo, a pesar de ser parte de la práctica clínica durante décadas, se sabe muy poco sobre cómo se regenera el bazo. Los modelos de trasplante animal han proporcionado información sobre múltiples parámetros de la regeneración del bazo y la función inmune ^4,5. En particular, las modificaciones experimentales en el método de preparación del injerto han permitido estudiar con mayor detalle la regeneración tisular a nivel celular y molecular.

Los trasplantes que involucran cortes de bazo entero pasan por una fase de necrosis masiva antes de que se reconstruya una nueva estructura del bazo⁶. La fase inicial de la necrosis del injerto sugiere que la mayor parte del tejido trasplantado consiste en gran parte en glóbulos rojos y blancos y es innecesario para la regeneración del bazo. Esto se investigó experimentalmente mediante la exclusión de células hematopoyéticas de injertos de bazo antes del trasplante bajo la cápsula de riñón de ratón. En este caso, se demostró que la fracción no leucocitaria/no eritrocitaria del bazo, que incluye células estromales y endoteliales, es suficiente para inducir la formación de tejido de novo ⁷. El tejido del estroma del bazo podría procesarse aún más en una suspensión unicelular, lo que permitiría el uso de tecnologías de clasificación celular para manipular la composición del injerto celular. Mediante la eliminación selectiva de tipos de células candidatas, se identificaron dos poblaciones de células estromales CD45-TER-119^- que eran indispensables para el desarrollo del injerto: una población de células CD31⁺CD105⁺MAdCAM-1⁺ de tipo endotelial y una población de células mesenquimales PDGFRβ⁺ más ampliamente definida⁸.

La construcción de injertos a partir de células del bazo varía en términos de materiales de soporte y procesos de carga celular. Los bazos de ingeniería tisular se han preparado previamente cargando unidades esplénicas en un andamio de polímero de ácido poliglicólico/ácido láctico^{poli-L 5,9}. Curiosamente, las células estromales del bazo absorbidas en una esponja de colágeno no lograron injertarse, mientras que las células estromales agregadas y cargadas sobre una lámina de colágeno facilitaron la regeneración del bazo⁸. También se ha demostrado que la resuspensión de células estromales del bazo dentro de una matriz de Matrigel induce la agregación celular en condiciones de cultivo tridimensionales¹⁰. Sin embargo, este método no se ha probado para su uso en modelos de trasplante. El objetivo general del protocolo actual es agregar y encapsular a la fuerza células estromales del bazo directamente dentro de la matriz de la membrana basal, que posteriormente pueden transferirse a un sistema de cultivo de tejidos in vitro tridimensional o utilizarse como vehículo para trasplantes de modelos animales (Figura suplementaria 1).

Protocolo

Todos los procedimientos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con los protocolos experimentales aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Queensland (UQBR/079/19).

1. Recolección de tejidos y preparación de células estromales

1. Eutanasia de ratones donantes neonatos BALB/c machos y/o hembras de 0,5 días de edad mediante la inducción de la hipotermia envolviendo a los animales dentro del papel de seda y colocándolos bajo hielo picado durante >10 min.
   NOTA: Este protocolo se puede adaptar a diferentes cepas de ratones, edades y número de animales.
2. Prepare instrumentos quirúrgicos estériles.
3. Coloque el ratón en una posición lateral derecha. Frotar la piel con etanol al 80% y hacer una incisión de 1 cm con unas tijeras quirúrgicas Iris para exponer la pared peritoneal.
4. Haga una segunda incisión de 0,5 cm por encima del bazo y use un par de pinzas finas para levantar suavemente el tejido. Use un par de tijeras quirúrgicas para cortar los vasos sanguíneos y extirpar el tejido. Transfiera el tejido a una placa de Petri que contenga solución salina tamponada con fosfato (PBS) helada. Extirpe cualquier resto de tejido conectivo adherido al bazo.
   NOTA: Un microscopio estereoscópico puede ayudar a los movimientos motores finos necesarios para manipular instrumentos quirúrgicos.
5. Para disociar tejidos enteros, transfiera el bazo neonatal (grupos de 10 o menos) al borde interno de un tapón de tubo cónico invertido de 14 ml. Altere mecánicamente los tejidos con un movimiento de presión utilizando el extremo posterior de plástico de un émbolo de jeringa de 1 ml.
6. Coloque y asegure la tapa firmemente sobre un tubo cónico de 14 ml que contenga 10 ml de PBS frío. Invierta el tubo 5 veces para lavar todo el tejido alterado de la tapa hacia el tubo.
7. Repita el paso 1.6 para cualquier tejido restante.
8. Deje la sonda en hielo durante 1 minuto para que el tejido se asiente en el fondo de la sonda.
9. Deseche cuidadosamente el sobrenadante (que contiene células hematopoyéticas) pasando la solución a través de un filtro celular reversible de 70 μm.
10. Recupere la fracción estromal no soluble invirtiendo el filtro y lavando el tejido estromal de nuevo en el tubo cónico de 14 ml utilizando 2 ml recién preparados de medio Eagle modificado de Dulbecco (sDMEM) suplementado que contiene 1 mg/ml de colagenasa IV, 40 μg/ml de DNasa I y 2% de suero fetal bovino (FBS).
    PRECAUCIÓN: La colagenasa IV y la colagenasa D son sustancias peligrosas y deben manipularse dentro de un gabinete de bioseguridad con el equipo de protección personal adecuado.
11. Para preparar una suspensión unicelular, digiera enzimáticamente el tejido agrupado (hasta 20) durante 10 min a 37 °C con rotación constante.
12. Añadir 4 ml de sDMEM recién preparado que contenga 1 mg/ml de colagenasa D, 40 μg/ml de DNasa I y 2 % de FBS directamente al tubo que contiene el tejido estromal. Incubar durante 10 minutos más a 37 °C con rotación constante.
13. Detenga la digestión agregando 8 ml de PBS helado. Recoja las células centrifugando a 200 x g durante 5 min a 4 °C.
14. Deseche el sobrenadante y lave las células dos veces resuspendiéndolas en 1 ml de PBS frío y centrifugando a 200 x g durante 5 min a 4 °C. Mantenga las células en hielo.
    NOTA: Las células se pueden contar y ajustar a la concentración deseada. Esto puede requerir optimización para diferentes poblaciones celulares. Con este protocolo, normalmente se recuperan 0,5 x 10⁶- 1 x 10⁶ células estromales o bazo, dependiendo de la edad de los ratones donantes. Opcionalmente, las células se pueden teñir y clasificar FACS en esta etapa para definir la composición celular.

2. Encapsulación matricial de agregados celulares

1. Enfríe previamente las puntas de pipeta P200 estériles dentro de un congelador a -20 °C.
2. Corte una película flexible de laboratorio (por ejemplo, Parafilm) en trozos de 1 cm x 2 cm y esterilícela sumergiéndola en etanol al 80% durante 10 minutos, seguido de PBS durante 10 minutos. La película de laboratorio puede prepararse con antelación y almacenarse estéril.
3. Preparar 0,5 x 10 6-2,5 x 10⁶ celdas centrifugando a 200 x g durante 5 min a 4 °C. Aspire cuidadosamente el sobrenadante, dejando aproximadamente 20 μL del volumen restante de PBS. Mantenga el gránulo de la celda en hielo.
   NOTA: El PBS restante se puede aspirar suavemente sin alterar el gránulo de la celda para confirmar el volumen.
4. Aspire 2 μL de matriz de membrana basal helada en una punta de pipeta P200 preenfriada, utilizando una pipeta P20.
   NOTA: Una matriz de membrana basal altamente concentrada (por ejemplo, matriz de Corning Matrigel de alta concentración) ayuda a formar un tapón solidificado fuerte.
5. Gire suavemente para expulsar la punta de la pipeta. Estire una tira preesterilizada de la película de laboratorio y colóquela sobre el extremo de la punta de la pipeta, teniendo cuidado de no perforar la película. Continúe envolviendo la punta en la película para sellar la punta de la pipeta. Coloque con cuidado la punta sellada directamente sobre hielo, teniendo cuidado de no romper la película.
6. Vuelva a suspender el gránulo celular en el PBS restante y coloque la solución suavemente sobre la matriz de la membrana basal. Mantén la construcción en hielo.
7. Prepare un tubo de centrifugación colocando un tubo de racimo de 1,2 ml dentro de un tubo cónico de 14 ml.
8. Coloque la punta de la pipeta dentro de la configuración del tubo anidado y centrifugue a 400 x g y 4 °C durante 5 min.
9. Coloque el tubo cónico de 14 ml en orientación vertical e incube a 37 °C durante 15 min para permitir que la matriz de la membrana basal se solidifique dentro de la punta de la pipeta.
   NOTA: El tubo cónico de 14 ml se puede colocar en hielo hasta que sea necesario para la aplicación posterior.

3. Cultivo tridimensional de organoides

1. Retire con cuidado la película de laboratorio de la punta de la pipeta.
2. Inserte un émbolo de alambre fino de acero inoxidable a través de la abertura más grande de la punta de la pipeta.
3. Expulse el tapón de matriz hasta que se libere a través de la punta en un pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos no tratada que contenga 2 ml de sDMEM suplementado con 10% de FBS, 1x Glutamax, 1x aminoácidos no esenciales (NEAA), 10 μM de inhibidor de roca, 10 U/mL de penicilina/estreptomicina y 50 μM de β-mercaptoetanol.
   NOTA: El recipiente de cultivo de tejidos y el volumen de medio correspondiente se pueden ajustar según sea necesario.
   PRECAUCIÓN: La NEAA, la penicilina/estreptomicina y el β-mercaptoetanol son sustancias peligrosas y deben manipularse dentro de un gabinete de bioseguridad con el equipo de protección personal adecuado.
4. Cultivar organoides a 37 °C, 5% de CO₂ y 95% de humedad durante 4-12 semanas.
5. Reemplace la mitad del medio cada 5 días.
   NOTA: Si los organoides comienzan a adherirse a la placa de cultivo de tejidos, transfiéralos a un pocillo nuevo.

4. Trasplante de cápsula renal

1. Prepare instrumentos quirúrgicos estériles.
2. Realizar un trasplante renal subcapsular del tapón de la matriz de la membrana basal:
   1. Anestesiar a ratones receptores hembra BALB/c de 8 semanas de edad con isoflurano siguiendo las Pautas Institucionales de Ética Animal.
      PRECAUCIÓN: El isoflurano es una sustancia peligrosa. Los gases residuales deben eliminarse para evitar la entrada en el entorno del espacio de trabajo.
   2. Coloque el ratón en una posición lateral derecha.
   3. Afeitar el vello del sitio de la cirugía y desinfectar la piel siguiendo las Pautas Institucionales.
      NOTA: Se recomienda desinfectar el sitio quirúrgico tres veces con movimientos circulares alternando exfoliante a base de yodo o clorhexidina y a base de alcohol.
   4. Realizar una incisión de 2 cm en la piel perpendicular a la columna vertebral para exponer la pared peritoneal.
      NOTA: Se pueden usar tijeras quirúrgicas finas o una hoja de bisturí para la incisión en la piel. Los usuarios deben seguir las Pautas Institucionales de Ética Animal o los Procedimientos Operativos Estándar.
   5. Haga una incisión más pequeña de 0,5 cm en la pared peritoneal por encima del riñón.
      NOTA: La incisión debe aproximarse al ancho del riñón para asegurar que el riñón permanezca exteriorizado durante el trasplante.
   6. Exteriorizar el riñón a través de la abertura peritoneal aplicando presión hacia abajo con el pulgar y el índice. Se puede usar un par de pinzas de anillo para ayudar a la exteriorización. Asegúrese de que el riñón esté húmedo durante todo el procedimiento aplicando regularmente PBS estéril con un hisopo de algodón.
   7. Bajo un microscopio estereoscópico, pellizque la grasa perirrenal de la cápsula renal con un par de pinzas ultrafinas dobladas en un polo del riñón. Use un segundo par de pinzas ultrafinas dobladas para rasgar suavemente la membrana de la cápsula renal hacia arriba en una dirección opuesta, creando una pequeña abertura.
   8. Inserte con cuidado la punta de una pinza debajo de la membrana de la cápsula. Use un movimiento de barrido lento para separar la membrana de la cápsula del parénquima renal.
   9. Prepare el tapón de la matriz de la membrana basal para el trasplante retirando la película de laboratorio de la punta de la pipeta.
   10. Levante la cápsula renal con una punta de la pinza e inserte la punta de la pipeta a través de la abertura, empujándola hacia el polo opuesto del riñón.
   11. Inserte un émbolo de alambre en la punta de la pipeta y expulse el tapón de la matriz mientras retira simultáneamente la punta de la pipeta del riñón.
   12. Humedecer el riñón con PBS y volver a internalizarlo.
   13. Cerrar la pared peritoneal con una sutura 5-0 Vicryl y cerrar la piel con dos autoclips.
   14. Administrar analgésico (Buprenorfina a 0,05-0,1 mg/kg por vía subcutánea o siguiendo las Guías Institucionales de Ética Animal).
       PRECAUCIÓN: La buprenorfina es una sustancia peligrosa y debe manipularse con el equipo de protección personal adecuado.
3. Cierre el flujo de isoflurano, pero mantenga el flujo de oxígeno encendido para permitir que el ratón respire oxígeno puro hasta que comience a recuperar la conciencia.
4. Regresa el ratón a su jaula. Mantenga al animal caliente durante la recuperación colocando parcialmente la jaula encima de una almohadilla térmica o debajo de una lámpara de calor, y controle hasta que el ratón se recupere completamente de la anestesia.
5. Monitorear la recuperación postquirúrgica durante las primeras dos semanas o según lo requieran las Pautas Institucionales.

Resultados

La agregación celular es importante para promover el contacto y la señalización de célula a célula. El encerramiento de los agregados celulares dentro de la matriz de la membrana basal apoyó ambos cultivos tridimensionales para la formación de organoides tisulares in vitro y facilitó la entrega mecánica de células en la cápsula renal para el trasplante de injerto. Para establecer estas construcciones, la matriz de la membrana basal se mantuvo primero en un estado fluídico en condiciones heladas. Post...

Discusión

La agregación de células neonatales del bazo dentro de un medio semisólido representa un método viable para generar construcciones de bazo. Se han utilizado protocolos similares basados en matrices de membrana basal para iniciar cultivos tridimensionales de bazo¹⁰. Aquí, demostramos que las construcciones de bazo son igualmente susceptibles a los sistemas de cultivo de organoides in vitro , así como a los modelos de trasplante in vivo . Cabe destacar que el trasplante de or...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 Well Polypropylene 1.2 mL Cluster Tubes	Corning	CLS4401	For placing inside a 14 ml conical tube
B-mercaptoethanol	Gibco	21985023	Stock 55 mM, use at 50 uM
Collagenase D	Roche	11088858001
Collagenase IV	Sigma-Aldrich	C5138	From Clostridium histolyticum
Deoxyribonuclease I (DNase I)	Sigma-Aldrich	D4513	Deoxyribonuclease I from bovine pancreas,Type II-S, lyophilized powder, Protein ≥80 %, ≥2,000 units/mg protein
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796	4500 mg/L Glucose, L-Glutamine, and Sodium Bicarbonate, without Sodium Pyruvate, Liquid. Sterile Filtered.
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537	Without calcium chloride and magnesium chloride, sterile-filtered
Eclipse 200 μl Pipette Tips	Labcon	1030-260-000	Bevel Point
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	26140-079	Lot# 1382243
GlutaMAX	Gibco	35050061	Stock 100X, use at 1X
Matrigel	Corning	354263	Matrigel matrix basement membrane High Concentration, Lot# 7330186
MEM Non-essential Amino Acids	Gibco	11140076	Stock 100X, use at 1X
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140122	Stock 10,000 units/ml Penicillin, 10,000 ug/ml Streptomycin
Reversible Cell Strainer	STEMCELL Technologies	27216	70 μm
Ring Tweezers	NAPOX	A-26	Ring size: 3 mm
Rock Inhibitor (Y-27632)	MedChemExpres	HY-10071
Thermofisher Heraeus Megafuge 40R Centrifuge	Thermofisher		Acceleration and deceleration speeds were set to 8
Ultra Fine Tweezers	EMS	78340-51S	Style 51S. Antimagnetic/anti-acid SA low carbon austenitic steel tweezers are corrosion resistant. Anti-glare satin finish.
Vicryl 5/0 Suture Ligapak Reel	Ethicon	J283G
Wiretrol II Long Wire Plunger	Drummond	5-000-2002-L	Stainless Steel Plunger, 25 & 50 μL/WRTL II, Long
Wound Clip Applier	MikRon	427630
Wound Clips	MikRon	427631	9 mm