基底膜基质封装细胞聚集用于研究小鼠脾脏组织形成

摘要

本文描述了一种在半固体基底膜基质中聚集和封装脾细胞的方案。基底膜基质构建体可用于三维培养，用于研究类器官发育，或用于 体内 移植和组织再生研究。

摘要

脾脏是一种免疫器官，在血液传播的免疫反应中起着关键作用。这种组织的解剖学或功能丧失增加了对严重血液感染和败血症的易感性。脾脏切片的自体移植在临床上已被用于补充丢失的组织并恢复免疫功能。然而，驱动强大且具有免疫功能的脾组织再生的机制尚未完全阐明。在这里，我们旨在开发一种在半固体基质中聚集和封装脾细胞的方法，以研究脾组织形成的细胞需求。基底膜基质封装的细胞构建体既适用于三维类器官的 体外 组织培养，也适用于肾囊下的移植，以直接评估 体内 组织的形成。通过操纵输入细胞进行聚集和封装，我们证明了在动物移植模型下，移植来源的PDGFRβ ⁺ MAdCAM-1^- 新生儿基质细胞是脾组织再生所必需的。

引言

脾脏的创伤性破裂和体内多个脾结节的出现是脾组织具有再生能力的最初迹象之一^1,2。脾脏自体移植后来被引入临床，以保留需要紧急脾切除术的患者的脾脏组织³.然而，尽管几十年来一直是临床实践的一部分，但人们对脾脏如何再生知之甚少。动物移植模型提供了对脾脏再生和免疫功能的多个参数^{的见解 4,5}。特别是，对移植物制备方法的实验修改允许在细胞和分子水平上更详细地研究组织再生。

涉及整个脾脏切片的移植在重建新的脾脏结构之前会经历一个集体坏死阶段⁶.移植物坏死的初始阶段表明，移植组织的大部分主要由红细胞和白细胞组成，对于脾脏再生是不必要的。这是通过在小鼠肾囊下移植之前从脾移植物中排除造血细胞来研究的。在这里，脾脏的非白细胞/非红细胞部分（包括基质细胞和内皮细胞）被证明足以诱导从头组织形成⁷。脾基质组织可以进一步加工成单细胞悬浮液，从而能够使用细胞分选技术来操纵细胞移植物组成。通过选择性地去除候选细胞类型，鉴定出两种对移植物发育不可或缺的 CD45-TER-119^- 基质细胞群：内皮....

研究方案

所有动物程序均根据昆士兰大学动物伦理委员会（UQBR/079/19）批准的实验方案进行。

1.组织采集和基质细胞制备

1. 通过将动物包裹在薄纸内并将它们置于碎冰下>10分钟，诱导体温过低，对0.5-1.5日龄的雄性和/或雌性BALB / c新生供体小鼠实施安乐死。
   注意：该协议可以适应不同的小鼠品系，年龄和动物数量。
2. 准备无菌手术器械。
3. 将鼠标放在右侧位置。用80%乙醇擦拭皮肤，并用Iris手术剪刀切开1厘米，露出腹膜壁。
4. 在脾脏上方做第二个 0.5 厘米的切口，然后用一把细镊子轻轻地将组织抬起。用一把手术剪刀剪断血管并切除组织。将组织转移到含有冰冷磷酸盐缓冲盐水（PBS）的培养皿中。去除附着在脾脏上的任何残留结缔组织。
   注意：体视显微镜可以帮助操作手术器械所需的精细运动。
5. 为了解离整个组织，将新生儿脾脏（10 个或更少的池）转移到倒置的 14 mL 锥形管盖的内缘。使用 1 mL 注射器柱塞的塑料后端通过按压运动机械破坏组织。
6. 将盖子紧紧固定在含有 10 mL 冷 PBS 的 14 mL 锥形管上。将试管倒置 5 次，将所有被破坏的组织从盖子洗入试管中。
7. 对任何剩余组织重复步骤 1.6。
8. 将试管放在冰上 1 分钟，让组织沉降到试管底部。
9. 通过将溶液通过可逆....

结果

细胞聚集对于促进细胞间接触和信号传导很重要。将细胞聚集体包裹在基底膜基质内支持体 外 组织类器官形成的三维培养物，并促进细胞机械递送至肾囊进行移植。为了建立这些结构，首先在冰冷条件下将基底膜基质保持在流体状态。随后通过在上方分层浓缩细胞悬浮液并使用离心力推动细胞通过高密度基质来实现细胞聚集。需要优化离心速度（200-2000 x g）以实现中间层细胞定位?.......

讨论

新生儿脾细胞在半固体培养基内的聚集代表了产生脾脏结构的可行方法。类似的基于基底膜基质的方案已被用于启动三维脾培养^物10。在这里，我们证明了脾脏结构同样适用于 体外 类器官培养系统以及 体内 移植模型。值得注意的是， 体外 培养的脾脏类器官的移植尚未经过测试，但确定全部或部分脾组织再生的能力将是有意义的。该协议还继承了先前脾移?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 Well Polypropylene 1.2 mL Cluster Tubes	Corning	CLS4401	For placing inside a 14 ml conical tube
B-mercaptoethanol	Gibco	21985023	Stock 55 mM, use at 50 uM
Collagenase D	Roche	11088858001
Collagenase IV	Sigma-Aldrich	C5138	From Clostridium histolyticum
Deoxyribonuclease I (DNase I)	Sigma-Aldrich	D4513	Deoxyribonuclease I from bovine pancreas,Type II-S, lyophilized powder, Protein ≥80 %, ≥2,000 units/mg protein
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796	4500 mg/L Glucose, L-Glutamine, and Sodium Bicarbonate, without Sodium Pyruvate, Liquid. Sterile Filtered.
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537	Without calcium chloride and magnesium chloride, sterile-filtered
Eclipse 200 μl Pipette Tips	Labcon	1030-260-000	Bevel Point
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	26140-079	Lot# 1382243
GlutaMAX	Gibco	35050061	Stock 100X, use at 1X
Matrigel	Corning	354263	Matrigel matrix basement membrane High Concentration, Lot# 7330186
MEM Non-essential Amino Acids	Gibco	11140076	Stock 100X, use at 1X
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140122	Stock 10,000 units/ml Penicillin, 10,000 ug/ml Streptomycin
Reversible Cell Strainer	STEMCELL Technologies	27216	70 μm
Ring Tweezers	NAPOX	A-26	Ring size: 3 mm
Rock Inhibitor (Y-27632)	MedChemExpres	HY-10071
Thermofisher Heraeus Megafuge 40R Centrifuge	Thermofisher		Acceleration and deceleration speeds were set to 8
Ultra Fine Tweezers	EMS	78340-51S	Style 51S. Antimagnetic/anti-acid SA low carbon austenitic steel tweezers are corrosion resistant. Anti-glare satin finish.
Vicryl 5/0 Suture Ligapak Reel	Ethicon	J283G
Wiretrol II Long Wire Plunger	Drummond	5-000-2002-L	Stainless Steel Plunger, 25 & 50 μL/WRTL II, Long
Wound Clip Applier	MikRon	427630
Wound Clips	MikRon	427631	9 mm