Инкапсулированная агрегация клеток матрицы базальной мембраны для исследования формирования ткани селезенки мышей

Резюме

В данной статье описывается протокол агрегации и инкапсуляции клеток селезенки в полутвердой мембранной матрице. Матричные конструкции базальной мембраны могут быть использованы в трехмерной культуре для изучения развития органоидов или для трансплантации in vivo и исследований регенерации тканей.

Аннотация

Селезенка является иммунным органом, который играет ключевую роль в иммунных реакциях, передающихся через кровь. Анатомическая или функциональная потеря этой ткани повышает восприимчивость к тяжелым инфекциям крови и сепсису. Аутотрансплантация срезов селезенки используется клинически для замещения утраченной ткани и восстановления иммунной функции. Однако механизм, приводящий к устойчивой и иммунологически функциональной регенерации тканей селезенки, до конца не выяснен. Здесь мы стремимся разработать метод агрегации и инкапсуляции клеток селезенки в полутвердом матриксе, чтобы исследовать клеточные потребности для формирования ткани селезенки. Инкапсулированные клеточные конструкции базальной мембранной матрицы поддаются как культивированию трехмерных органоидов in vitro, так и трансплантации под капсулу почки для непосредственной оценки образования ткани in vivo. Манипулируя входными клетками для агрегации и инкапсуляции, мы демонстрируем, что полученные из трансплантата PDGFRβ⁺MAdCAM-1-неонатальные стромальные клетки необходимы для регенерации ткани селезенки в моделях трансплантации животных.

Введение

Травматический разрыв селезенки и появление множественных селезеночных узелков в организме был одним из первых признаков того, что ткань селезенки обладает регенеративной способностью ^1,2. Позже в клинику была внедрена аутотрансплантация селезенки для сохранения ткани селезенки у пациентов, нуждающихся в экстренной спленэктомии³. Тем не менее, несмотря на то, что селезенка является частью клинической практики на протяжении десятилетий, очень мало известно о том, как селезенка регенерирует. Модели трансплантации животных позволили получить представление о многих параметрах регенерации селезенки и иммунной функции ^4,5. В частности, экспериментальные модификации метода препарирования трансплантата позволили более детально изучить регенерацию тканей на клеточном и молекулярном уровне.

Трансплантация с использованием целых срезов селезенки проходит фазу массового некроза, прежде чем будет восстановлена новая структура селезенки⁶. Начальная фаза некроза трансплантата говорит о том, что основная масса трансплантированной ткани в значительной степени состоит из эритроцитов и лейкоцитов и не нужна для регенерации селезенки. Это было исследовано экспериментально путем исключения гемопоэтических клеток из трансплантатов селезенки перед трансплантацией под капсулу почки мыши. Здесь было показано, что нелейкоцитарная/неэритроцитарная фракция селезенки, которая включает стромальные и эндотелиальные клетки, достаточна для индуцирования образования de novo ткани⁷. Стромальная ткань селезенки может быть дополнительно переработана в одноклеточную суспензию, что позволяет использовать технологии сортировки клеток для манипулирования составом клеточного трансплантата. Путем селективного удаления типов клеток-кандидатов были идентифицированы две популяции CD45-TER-119-стромальных клеток, которые были необходимы для развития трансплантата: эндотелиоподобная популяция клеток CD31⁺CD105⁺MAdCAM-1⁺ и более широко определенная популяция мезенхимальных клеток PDGFRβ^{+ 8}.

Конструкция трансплантатов из клеток селезенки различается с точки зрения вспомогательных материалов и процессов загрузки клеток. Тканеинженерные селезенки ранее были получены путем загрузки селезеночных единиц на полимерный каркас из полигликолевой кислоты/поли-L молочной кислоты ^5,9. Интересно, что стромальные клетки селезенки, абсорбированные в коллагеновую губку, не приживались, в то время как стромальные клетки, агрегированные и нагруженные на коллагеновый лист,^{способствовали регенерации} селезенки8. Также было продемонстрировано, что ресуспензия стромальных клеток селезенки внутри матрикса Matrigel индуцирует агрегацию клеток в трехмерных условиях культивирования¹⁰. Однако этот метод не был протестирован для использования в трансплантационных моделях. Общая цель текущего протокола заключается в принудительной агрегации и инкапсуляции стромальных клеток селезенки непосредственно внутри матрицы базальной мембраны, которые впоследствии могут быть перенесены в трехмерную систему культивирования тканей in vitro или использованы в качестве средства для трансплантации модельных животных (дополнительный рисунок 1).

протокол

Все процедуры на животных проводились в соответствии с экспериментальными протоколами, утвержденными Комитетом по этике животных Университета Квинсленда (UQBR/079/19).

1. Забор тканей и подготовка стромальных клеток

1. Усыпляют 0,5-1,5-дневных самцов и/или самок неонатальных мышей-доноров BALB/c путем индукции гипотермии, заворачивая животных в папиросную бумагу и помещая их под колотым льдом на >10 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол может быть адаптирован к различным линиям мышей, возрасту и количеству животных.
2. Подготовьте стерильные хирургические инструменты.
3. Положите мышь в правое боковое положение. Промокните кожу 80% этиловым спиртом и сделайте разрез диаметром 1 см хирургическими ножницами Iris, чтобы обнажить стенку брюшины.
4. Сделайте второй разрез 0,5 см над селезенкой и с помощью тонких щипцов осторожно приподнимите ткань вверх. Используйте хирургические ножницы, чтобы перерезать кровеносные сосуды и иссечь ткань. Перенесите ткань в чашку Петри, содержащую ледяной фосфатный буферный раствор (PBS). Удалите всю оставшуюся соединительную ткань, прикрепленную к селезенке.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Стереомикроскоп может помочь мелкой моторике, необходимой для работы с хирургическими инструментами.
5. Чтобы диссоциировать целые ткани, перенесите селезенку новорожденных (пулы из 10 или менее) во внутренний край перевернутой конической крышки пробирки объемом 14 мл. Механически разрушайте ткани надавливающим движением с помощью пластикового заднего конца поршня шприца объемом 1 мл.
6. Наденьте и плотно закрепите колпачок на конической пробирке объемом 14 мл, содержащей 10 мл холодного PBS. Переверните тюбик 5 раз, чтобы смыть всю поврежденную ткань с колпачка в тюбик.
7. Повторите шаг 1.6 для оставшихся тканей.
8. Оставьте пробирку на льду на 1 минуту, чтобы ткань осядла на дно пробирки.
9. Осторожно выбросьте надосадочную жидкость (содержащую гемопоэтические клетки), пропустив раствор через реверсивное ситечко с 70 мкм.
10. Восстановите нерастворимую стромальную фракцию, перевернув ситечко и промыв стромальную ткань обратно в коническую пробирку объемом 14 мл, используя свежеприготовленные 2 мл модифицированной орлиной среды (sDMEM) Dulbecco, содержащей 1 мг/мл коллагеназы IV, 40 мкг/мл ДНКазы I и 2% фетальной бычьей сыворотки (FBS).
    ВНИМАНИЕ: Коллагеназа IV и коллагеназа D являются опасными веществами и должны обрабатываться в шкафу биобезопасности с соответствующими средствами индивидуальной защиты.
11. Для приготовления одноклеточной суспензии ферментативно расщепляют объединенную ткань (до 20) в течение 10 мин при 37 °C при постоянном вращении.
12. Добавьте 4 мл свежеприготовленного sDMEM, содержащего 1 мг/мл коллагеназы D, 40 мкг/мл ДНКазы I и 2% FBS, непосредственно в пробирку, содержащую стромальную ткань. Инкубируйте еще 10 минут при температуре 37 °C при постоянном вращении.
13. Остановите пищеварение, добавив 8 мл ледяного PBS. Собирают клетки центрифугированием при 200 x g в течение 5 мин при 4 °C.
14. Выбросьте надосадочную жидкость и промойте клетки дважды, повторно суспендировав в 1 мл холодного PBS и центрифугируя при 200 x g в течение 5 мин при 4 °C. Держите клетки на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки могут быть подсчитаны и доведены до желаемой концентрации. Это может потребовать оптимизации для разных клеточных популяций. При использовании этого протокола обычно извлекают стромальные клетки на селезенку размером 0,5 x 10⁶ 6, в зависимости от возраста мышей-доноров. На этом этапе клетки могут быть окрашены и отсортированы методом FACS для определения клеточного состава.

2. Матричная инкапсуляция клеточных агрегатов

1. Предварительно охладите стерильные наконечники дозаторов P200 в морозильной камере с температурой -20 °C.
2. Разрежьте гибкую лабораторную пленку (например, Parafilm) на куски размером 1 см x 2 см и простерилизуйте, погрузив в 80% этиловый спирт на 10 минут, а затем PBS на 10 минут. Лабораторную пленку можно подготовить заранее и хранить стерильно.
3. Приготовьте 0,5 x 10 6-2,5 x 10⁶ клеток центрифугированием при 200 x g в течение 5 мин при 4 °C. Осторожно аспирируйте надосадочную жидкость, оставляя примерно 20 мкл оставшегося объема PBS. Держите клеточную гранулу на льду.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Оставшийся PBS можно осторожно отсосать, не повредив гранулу ячейки, чтобы подтвердить объем.
4. Аспирируйте 2 мкл ледяной мембранной матрицы основания в предварительно охлажденный наконечник дозатора P200 с помощью пипеттора P20.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Высококонцентрированная матрица базальной мембраны (например, матрица Corning Matrigel высокой концентрации) способствует образованию прочной затвердевшей пробки.
5. Осторожно поверните, чтобы извлечь наконечник пипетки. Натяните предварительно стерилизованную полоску лабораторной пленки и поместите ее на конец наконечника пипетки, стараясь не проткнуть пленку. Продолжайте заворачивать наконечник в пленку, чтобы запечатать наконечник пипетки. Осторожно положите запечатанный наконечник прямо на лед, стараясь не порвать пленку.
6. Ресуспендируйте клеточную гранулу в оставшейся PBS и аккуратно нанесите раствор на матрицу базальной мембраны. Держите конструкцию на льду.
7. Подготовьте центрифугированную пробирку, поместив кластерную пробирку объемом 1,2 мл внутрь конической пробирки объемом 14 мл.
8. Поместите наконечник пипетки внутрь вложенной пробирки и центрифугируйте при температуре 400 x g и 4 °C в течение 5 минут.
9. Установите коническую пробирку объемом 14 мл в вертикальном положении и инкубируйте при температуре 37 °C в течение 15 минут, чтобы матрица базальной мембраны затвердела внутри наконечника пипетки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Коническую пробирку объемом 14 мл можно помещать на лед до тех пор, пока это не потребуется для последующего применения.

3. Трехмерная органоидная культура

1. Осторожно снимите лабораторную пленку с наконечника пипетки.
2. Вставьте тонкий проволочный поршень из нержавеющей стали в большее отверстие наконечника пипетки.
3. Выталкивайте матричную пробку до тех пор, пока она не выйдет через наконечник, в одну лунку необработанной 6-луночной тканевой культуральной пластины, содержащей 2 мл sDMEM с добавлением 10% FBS, 1x Glutamax, 1x заменимых аминокислот (NEAA), 10 мкМ ингибитора горных пород, 10 U/мл пенициллина/стрептомицина и 50 мкМ β-меркаптоэтанола.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Емкость для культуры тканей и соответствующий объем среды могут быть отрегулированы по мере необходимости.
   ВНИМАНИЕ: NEAA, пенициллин/стрептомицин и β-меркаптоэтанол являются опасными веществами и должны обрабатываться в шкафу биобезопасности с соответствующими средствами индивидуальной защиты.
4. Культивирование органоидов при 37 °C, 5% CO₂ и влажности 95% в течение 4-12 недель.
5. Заменяйте половину носителя каждые 5 дней.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если органоиды начинают прикрепляться к планшету для культуры тканей, перенесите их в свежую лунку.

4. Пересадка капсулы почки

1. Подготовьте стерильные хирургические инструменты.
2. Выполнить субкапсулярную трансплантацию почки пробки матрикса базальной мембраны:
   1. Обезболивайте 8-недельную самку мыши-реципиента BALB/c изофлураном в соответствии с рекомендациями по этике для животных.
      ВНИМАНИЕ: Изофлуран является опасным веществом. Отработанные газы необходимо удалять, чтобы предотвратить попадание в рабочую среду.
   2. Положите мышь в правое боковое положение.
   3. Сбрейте волосы в месте операции и продезинфицируйте кожу в соответствии с рекомендациями учреждения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется дезинфицировать место операции три раза круговыми движениями с чередованием скраба на основе йода или хлоргексидина и спирта.
   4. Сделайте разрез на коже диаметром 2 см перпендикулярно позвоночнику, чтобы обнажить стенку брюшины.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для разреза кожи можно использовать тонкие хирургические ножницы или лезвие скальпеля. Пользователи должны следовать Руководству по этике животных или Стандартным операционным процедурам.
   5. Сделайте разрез меньшего размера 0,5 см в стенке брюшины над почкой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Разрез должен приблизительно соответствовать ширине почки, чтобы гарантировать, что почка останется экстериоризированной во время трансплантации.
   6. Экстериоризируйте почку через отверстие брюшины, надавливая вниз большим и указательным пальцами. Кольцевой пинцет может быть использован для помощи экстериоризации. Следите за тем, чтобы почка была влажной на протяжении всей процедуры, регулярно нанося стерильный PBS с помощью ватного тампона.
   7. Под стереомикроскопом зажмите околопочечный жир капсулы почки парой изогнутых ультратонких щипцов на одном полюсе почки. Используйте вторую пару изогнутых ультратонких щипцов, чтобы осторожно разорвать мембрану капсулы почки вверх в противоположном направлении, создавая небольшое отверстие.
   8. Осторожно введите зубец одного щипца под мембрану капсулы. Медленными размашистыми движениями отделите мембрану капсулы от паренхимы почки.
   9. Подготовьте матричную пробку базальной мембраны к трансплантации, сняв лабораторную пленку с наконечника пипетки.
   10. Приподнимите капсулу почки с помощью одного зубца щипцов и введите кончик пипетки через отверстие, проталкивая его к противоположному полюсу почки.
   11. Вставьте проволочный поршень в наконечник пипетки и выньте матричную пробку, одновременно извлекая наконечник пипетки из почки.
   12. Смочите почку PBS и повторно усвоите.
   13. Закройте стенку брюшины одним швом 5-0 Vicryl и закройте кожу двумя автоклипсами.
   14. Назначают обезболивающее средство (бупренорфин в дозе 0,05-0,1 мг/кг подкожно или в соответствии с рекомендациями по этике животных).
       ВНИМАНИЕ: Бупренорфин является опасным веществом, и с ним необходимо обращаться с соответствующими средствами индивидуальной защиты.
3. Выключите поток изофлурана, но оставьте поток кислорода включенным, чтобы мышь могла дышать чистым кислородом до тех пор, пока она не начнет приходить в сознание.
4. Верните мышь в клетку. Держите животное в тепле во время выздоровления, частично поместив клетку на грелку или под тепловую лампу, и наблюдайте до тех пор, пока мышь полностью не оправится от анестезии.
5. Наблюдайте за послеоперационным восстановлением в течение первых двух недель или в соответствии с требованиями институциональных рекомендаций.

Результаты

Клеточная агрегация важна для развития межклеточного контакта и передачи сигналов. Помещение клеточных агрегатов внутрь матрицы базальной мембраны поддерживало как 3-мерные культуры для формирования тканевых органоидов in vitro, так и облегчало механическую доставку клеток в капсу...

Обсуждение

Агрегация клеток селезенки новорожденных в полутвердой среде представляет собой жизнеспособный метод создания селезеночных конструкций. Аналогичные протоколы на основе базальной мембраны были использованы для инициирования трехмерных культур селезенки¹⁰. Здесь мы дем?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 Well Polypropylene 1.2 mL Cluster Tubes	Corning	CLS4401	For placing inside a 14 ml conical tube
B-mercaptoethanol	Gibco	21985023	Stock 55 mM, use at 50 uM
Collagenase D	Roche	11088858001
Collagenase IV	Sigma-Aldrich	C5138	From Clostridium histolyticum
Deoxyribonuclease I (DNase I)	Sigma-Aldrich	D4513	Deoxyribonuclease I from bovine pancreas,Type II-S, lyophilized powder, Protein ≥80 %, ≥2,000 units/mg protein
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796	4500 mg/L Glucose, L-Glutamine, and Sodium Bicarbonate, without Sodium Pyruvate, Liquid. Sterile Filtered.
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537	Without calcium chloride and magnesium chloride, sterile-filtered
Eclipse 200 μl Pipette Tips	Labcon	1030-260-000	Bevel Point
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	26140-079	Lot# 1382243
GlutaMAX	Gibco	35050061	Stock 100X, use at 1X
Matrigel	Corning	354263	Matrigel matrix basement membrane High Concentration, Lot# 7330186
MEM Non-essential Amino Acids	Gibco	11140076	Stock 100X, use at 1X
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140122	Stock 10,000 units/ml Penicillin, 10,000 ug/ml Streptomycin
Reversible Cell Strainer	STEMCELL Technologies	27216	70 μm
Ring Tweezers	NAPOX	A-26	Ring size: 3 mm
Rock Inhibitor (Y-27632)	MedChemExpres	HY-10071
Thermofisher Heraeus Megafuge 40R Centrifuge	Thermofisher		Acceleration and deceleration speeds were set to 8
Ultra Fine Tweezers	EMS	78340-51S	Style 51S. Antimagnetic/anti-acid SA low carbon austenitic steel tweezers are corrosion resistant. Anti-glare satin finish.
Vicryl 5/0 Suture Ligapak Reel	Ethicon	J283G
Wiretrol II Long Wire Plunger	Drummond	5-000-2002-L	Stainless Steel Plunger, 25 & 50 μL/WRTL II, Long
Wound Clip Applier	MikRon	427630
Wound Clips	MikRon	427631	9 mm