쥐 비장 조직 형성을 조사하기 위한 Basement Membrane Matrix Encapsulated Cell Aggregation

요약

이 기사에서는 반고체 기저막 매트릭스 내에서 비장 세포를 응집하고 캡슐화하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 기저막 매트릭스 구축물은 오가노이드 발달 연구 또는 생체 내 이식 및 조직 재생 연구를 위한 3차원 배양에 사용할 수 있습니다.

초록

비장은 혈액 매개 면역 반응에 중요한 역할을 하는 면역 기관입니다. 이 조직의 해부학적 또는 기능적 손실은 심각한 혈액 감염 및 패혈증에 대한 감수성을 증가시킵니다. 비장 절편의 자가 이식은 손실된 조직을 대체하고 면역 기능을 회복하기 위해 임상적으로 사용되었습니다. 그러나 견고하고 면역학적으로 기능하는 비장 조직 재생을 유도하는 메커니즘은 완전히 설명되지 않았습니다. 여기에서 우리는 비장 조직 형성을 위한 세포 요구 사항을 조사하기 위해 반고체 매트릭스 내에서 비장 세포를 응집하고 캡슐화하는 방법을 개발하는 것을 목표로 합니다. 기저막 매트릭스 캡슐화된 세포 구조는 3차원 오가노이드의 체외 조직 배양과 생체 내 조직 형성을 직접 평가하기 위한 신장 캡슐 아래 이식 모두에 적용할 수 있습니다. 응집 및 캡슐화를 위해 입력 세포를 조작함으로써 동물 이식 모델에서 비장 조직 재생에 이식편 유래 PDGFRβ⁺MAdCAM-1^- 신생아 기질 세포가 필요하다는 것을 입증합니다.

서문

비장의 외상성 파열과 신체에 다발성 비장 결절의 출현은 비장 조직이 재생 능력을 가지고 있다는 첫 번째 징후^{중 하나였습니다 1,2}. 이후 응급 비장 절제술이 필요한 환자의 비장 조직을 보존하기 위해 비장 자가이식술이 임상에 도입되었다³. 그러나 수십 년 동안 임상 진료의 일부였음에도 불구하고 비장이 어떻게 재생되는지에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 동물 이식 모델은 비장 재생 및 면역 기능의 여러 매개변수에 대한 통찰력을 제공했습니다 ^4,5. 특히, 이식편 전처리 방법에 대한 실험적 변형을 통해 조직 재생을 세포 및 분자 수준에서 더 자세히 연구할 수 있게 되었습니다.

전체 비장 절편을 포함하는 이식은 새로운 비장 구조가 재건되기 전에 대량 괴사 단계를 거친다⁶. 이식편 괴사의 초기 단계는 이식된 조직의 대부분이 적혈구와 백혈구로 구성되어 있으며 비장 재생에 필요하지 않다는 것을 시사합니다. 이것은 쥐 신장 캡슐 아래에 이식하기 전에 비장 이식편에서 조혈 세포를 배제하여 실험적으로 조사되었습니다. 여기서, 기질 및 내피 세포를 포함하는 비장의 비-백혈구/비-적혈구 분획은 새로운 조직 형성을 유도하기에 충분한 것으로 나타났다⁷. 비장 기질 조직은 단일 세포 현탁액으로 추가 처리될 수 있어 세포 분류 기술을 사용하여 세포 이식편 조성을 조작할 수 있습니다. 후보 세포 유형을 선택적으로 제거함으로써 이식편 발달에 필수적인 두 개의 CD45-TER-119^- 기질 세포 집단, 즉 내피 유사 CD31⁺CD105⁺MAdCAM-1⁺ 세포 집단과 보다 광범위하게 정의된 PDGFRβ⁺ 중간엽 세포 집단⁸을 식별했습니다.

비장 세포에서 이식편을 만드는 것은 지지 재료와 세포 로딩 과정 측면에서 다양합니다. 조직 공학적 비장은 이전에 비장 단위를 폴리글리콜산/폴리-L 젖산 중합체 스캐폴드 ^5,9에 로딩하여 제조되었습니다. 흥미롭게도, 콜라겐 스펀지에 흡수된 비장 기질 세포는 생착에 실패한 반면, 콜라겐 시트 위에 응집되어 로드된 기질 세포는 비장 재생을 촉진했다⁸. Matrigel 매트릭스 내부의 비장 기질 세포의 재부유는 또한 3차원 배양 조건 하에서 세포 응집을 유도하는 것으로 입증되었다¹⁰. 그러나 이 방법은 이식 모델에 사용하기 위해 테스트되지 않았습니다. 현재 프로토콜의 전반적인 목표는 기저막 매트릭스 내에서 직접 비장 기질 세포를 강제로 응집하고 캡슐화하는 것이며, 이후 3차원 체외 조직 배양 시스템으로 옮기거나 동물 모델 이식을 위한 수단으로 사용할 수 있습니다(보충 그림 1).

프로토콜

모든 동물 시술은 퀸즐랜드 대학교 동물 윤리 위원회(UQBR/079/19)에서 승인한 실험 프로토콜에 따라 수행되었습니다.

1. 조직 수집 및 기질 세포 준비

1. 0.5-1.5일 된 수컷 및/또는 암컷 BALB/c 신생아 기증자 마우스를 티슈 페이퍼에 싸서 >10분 동안 으깬 얼음 아래에 두어 저체온증을 유도하여 안락사시킵니다.
   참고: 이 프로토콜은 다양한 마우스 균주, 연령 및 동물 수에 맞게 조정할 수 있습니다.
2. 멸균 수술 기구를 준비하십시오.
3. 마우스를 오른쪽 측면 위치에 놓습니다. 80 % 에탄올로 피부를 닦고 아이리스 수술 용 가위로 1cm를 절개하여 복막 벽을 노출시킵니다.
4. 비장 위로 0.5cm를 더 절개하고 가는 집게를 사용하여 조직을 부드럽게 들어 올립니다. 수술용 가위를 사용하여 혈관을 자르고 조직을 절제합니다. 조직을 얼음처럼 차가운 인산염 완충 식염수(PBS)가 포함된 페트리 접시에 옮깁니다. 비장에 붙어 있는 남아 있는 결합 조직을 제거합니다.
   알림: 실체현미경은 수술 기구를 조작하는 데 필요한 미세 운동 움직임을 지원할 수 있습니다.
5. 전체 조직을 해리하려면 신생아 비장(10개 이하의 웅덩이)을 거꾸로 된 14mL 원뿔형 튜브 캡의 안쪽 가장자리로 옮깁니다. 1mL 주사기 플런저의 플라스틱 뒤쪽 끝을 사용하여 누르는 동작으로 조직을 기계적으로 파괴합니다.
6. 10mL의 차가운 PBS가 들어 있는 14mL 원뿔형 튜브 위에 캡을 단단히 놓고 고정합니다. 튜브를 5번 뒤집어 캡에서 부서진 모든 조직을 튜브로 씻어냅니다.
7. 나머지 조직에 대해 1.6단계를 반복합니다.
8. 튜브를 얼음 위에 1분 동안 두어 조직이 튜브 바닥에 가라앉도록 합니다.
9. 상층액(조혈 세포 포함)을 가역 70μm 세포 여과기에 통과시켜 조심스럽게 폐기합니다.
10. 1mg/mL 콜라겐분해효소 IV, 40μg/mL DNase I 및 2% 소 태아 혈청(FBS)을 함유한 2mL의 보충된 Dulbecco's Modified Eagle Medium(sDMEM)을 사용하여 여과기를 뒤집고 기질 조직을 14mL 원뿔형 튜브로 다시 세척하여 불용성 기질 분획을 회수합니다.
    주의 : 콜라겐 분해 효소 IV 및 콜라겐 분해 효소 D는 유해 물질이며 적절한 개인 보호 장비와 함께 생물 안전 캐비닛 내부에서 취급해야합니다.
11. 단일 세포 현탁액을 준비하려면 37°C에서 10분 동안 일정한 회전으로 통합 조직(최대 20개)을 효소로 분해합니다.
12. 1mg/mL 콜라겐분해효소 D, 40μg/mL DNase I 및 2% FBS가 포함된 4mL의 갓 준비된 sDMEM을 기질 조직이 포함된 튜브에 직접 추가합니다. 일정한 회전으로 37°C에서 10분 더 배양합니다.
13. 얼음처럼 차가운 PBS 8mL를 추가하여 소화를 중단합니다. 4°C에서 5분 동안 200 x g 에서 원심분리하여 세포를 수집합니다.
14. 상층액을 버리고 1mL의 콜드 PBS에 재현탁하고 4°C에서 5분 동안 200 x g 에서 원심분리하여 세포를 두 번 세척합니다. 세포를 얼음 위에 두십시오.
    알림: 세포를 계산하고 원하는 농도로 조정할 수 있습니다. 이를 위해서는 다양한 세포 집단에 대한 최적화가 필요할 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용하면 일반적으로 기증 마우스의 나이에 따라 0.5 x 10⁶- 1 x 10⁶ 기질 세포/비장이 회수됩니다. 이 단계에서 세포를 선택적으로 염색하고 FACS를 분류하여 세포 조성을 정의할 수 있습니다.

2. 세포 응집체의 매트릭스 캡슐화

1. 멸균 P200 피펫 팁을 -20°C 냉동고 내부에서 사전 냉각합니다.
2. 유연한 실험실 필름(예: Parafilm)을 1cm x 2cm 조각으로 자르고 80% 에탄올에 10분 동안 담근 다음 PBS에 10분 동안 담가 멸균합니다. 실험실 필름은 미리 준비하여 멸균 상태로 보관할 수 있습니다.
3. 4°C에서 5분 동안 200 x g에서 원심분리하여 0.5 x 10 6-2.5 x^{10 6} 세포를 준비합니다. 상층액을 조심스럽게 흡입하여 약 20μL의 나머지 PBS 부피를 남깁니다. 세포 펠릿을 얼음 위에 두십시오.
   알림: 나머지 PBS는 부피를 확인하기 위해 셀 펠릿을 방해하지 않고 부드럽게 흡인할 수 있습니다.
4. P20 피펫터를 사용하여 2μL의 얼음처럼 차가운 기저막 매트릭스를 사전 냉각된 P200 피펫 팁에 흡입합니다.
   알림: 고농축 기저막 매트릭스(예: Corning Matrigel Matrix High Concentration)는 강력한 응고 플러그를 형성하는 데 도움이 됩니다.
5. 부드럽게 비틀어 피펫 팁을 빼냅니다. 실험실 필름의 사전 멸균된 스트립을 늘려 필름을 뚫지 않도록 주의하면서 피펫 팁 끝에 놓습니다. 피펫 팁을 밀봉하기 위해 팁을 필름에 계속 감쌉니다. 밀봉된 팁을 얼음 위에 직접 조심스럽게 놓고 필름이 파열되지 않도록 주의하십시오.
6. 나머지 PBS에 세포 펠릿을 재현탁시키고 용액을 기저막 매트릭스 위에 부드럽게 층을 이룹니다. 구조물을 얼음 위에 두십시오.
7. 14mL 원뿔형 튜브 안에 1.2mL 클러스터 튜브를 넣어 원심분리 튜브를 준비합니다.
8. 피펫 팁을 중첩 튜브 구성 내부에 놓고 400 x g 및 4°C에서 5분 동안 원심분리기를 놓습니다.
9. 14mL 코니컬 튜브를 수직 방향으로 놓고 37°C에서 15분 동안 배양하여 기저막 매트릭스가 피펫 팁 내부에서 응고되도록 합니다.
   참고: 14mL 코니컬 튜브는 다운스트림 적용에 필요할 때까지 얼음 위에 놓을 수 있습니다.

3. 3차원 오가노이드 배양

1. 피펫 팁에서 실험실 필름을 조심스럽게 제거합니다.
2. 피펫 팁의 더 큰 구멍을 통해 얇은 스테인리스강 와이어 플런저를 삽입합니다.
3. 10% FBS, 1x 글루타맥스, 1x 비필수 아미노산(NEAA), 10μM 암석 억제제, 10U/mL 페니실린/스트렙토마이신 및 50μM β-메르캅토에탄올이 보충된 2mL의 sDMEM을 포함하는 처리되지 않은 6웰 조직 배양 플레이트의 한 웰로 팁을 통해 분리될 때까지 매트릭스 플러그를 배출합니다.
   참고: 조직 배양 용기와 해당 배지 부피는 필요에 따라 조정할 수 있습니다.
   주의 : NEAA, 페니실린/스트렙토마이신 및 β-메르캅토에탄올은 유해 물질이므로 적절한 개인 보호 장비와 함께 생물 안전 캐비닛 내에서 취급해야 합니다.
4. 4-12주 동안 37°C, 5% CO₂ 및 95% 습도에서 오가노이드 배양.
5. 5일마다 배지의 절반을 교체하십시오.
   참고: 오가노이드가 조직 배양 플레이트에 부착되기 시작하면 새 웰로 옮깁니다.

4. 신장 캡슐 이식

1. 멸균 수술 기구를 준비하십시오.
2. 기저막 매트릭스 플러그의 피막하 신장 이식을 수행합니다.
   1. 기관 동물 윤리 지침에 따라 8주 된 BALB/c 암컷 수용 마우스를 이소플루란으로 마취합니다.
      주의 : 이소플루란은 유해 물질입니다. 폐가스는 작업 환경으로의 유입을 방지하기 위해 청소해야 합니다.
   2. 마우스를 오른쪽 측면 위치에 놓습니다.
   3. 수술 부위의 털을 면도하고 기관 지침에 따라 피부를 소독합니다.
      알림: 수술 부위는 요오드 기반 또는 클로르헥시딘 기반 및 알코올 기반 스크럽을 번갈아 가며 원을 그리며 세 번 소독하는 것이 좋습니다.
   4. 척추에 수직으로 피부를 2cm 절개하여 복막벽을 노출시킵니다.
      알림: 미세한 수술용 가위 또는 메스 날을 피부 절개에 사용할 수 있습니다. 사용자는 기관 동물 윤리 지침 또는 표준 운영 절차를 따라야 합니다.
   5. 신장 위의 복막 벽을 0.5cm 더 작게 절개합니다.
      참고: 절개는 이식 중에 신장이 외부로 유지되도록 신장 너비에 근접해야 합니다.
   6. 엄지와 검지를 사용하여 아래쪽 압력을 가하여 복막 입구를 통해 신장을 외부로 만듭니다. 한 쌍의 링 핀셋을 사용하여 외부화를 지원할 수 있습니다. 면봉을 사용하여 멸균 PBS를 정기적으로 도포하여 시술 내내 신장이 촉촉한지 확인하십시오.
   7. 실체현미경으로 신장 캡슐의 신장 주위 지방을 신장의 한쪽 극에 있는 한 쌍의 구부러진 초미세 집게로 꼬집습니다. 두 번째 구부러진 초미세 겸자를 사용하여 신장 캡슐 막을 반대 방향으로 위쪽으로 부드럽게 찢어 작은 구멍을 만듭니다.
   8. 한 집게의 갈래를 캡슐 멤브레인 아래에 조심스럽게 삽입합니다. 천천히 쓸어 올리는 동작을 사용하여 신장 실질에서 캡슐 막을 분리합니다.
   9. 피펫 팁에서 실험실 필름을 제거하여 이식을 위한 기저막 매트릭스 플러그를 준비합니다.
   10. 겸자의 한쪽 갈래를 사용하여 신장 캡슐을 들어 올리고 구멍을 통해 피펫 팁을 삽입하여 신장의 반대쪽 극 쪽으로 밀어 넣습니다.
   11. 와이어 플런저를 피펫 팁에 삽입하고 매트릭스 플러그를 배출하는 동시에 피펫 팁을 신장에서 빼냅니다.
   12. PBS로 신장을 적시고 다시 내면화하십시오.
   13. 하나의 5-0 Vicryl 봉합사로 복막 벽을 닫고 두 개의 자동 클립으로 피부를 닫습니다.
   14. 진통제(부프레노르핀 0.05-0.1mg/kg을 피하 투여하거나 기관 동물 윤리 지침에 따름)를 투여합니다.
       주의 : 부프레노르핀은 유해 물질이므로 적절한 개인 보호 장비로 취급해야 합니다.
3. 이소플루란의 흐름을 차단하되 쥐가 의식을 얻기 시작할 때까지 순수한 산소를 호흡할 수 있도록 산소 흐름을 유지하십시오.
4. 마우스를 케이지로 되돌립니다. 회복 중에 케이지를 가열 패드 위나 열 램프 아래에 부분적으로 놓아 동물을 따뜻하게 유지하고 쥐가 마취에서 완전히 회복될 때까지 모니터링합니다.
5. 처음 2주 동안 또는 기관 지침에서 요구하는 대로 수술 후 회복을 모니터링합니다.

결과

세포 응집은 세포 간 접촉 및 신호 전달을 촉진하는 데 중요합니다. 기저막 매트릭스 내부에 세포 응집체를 감싸는 것은 체외 조직 오가노이드 형성을 위한 3차원 배양을 모두 지원하고 이식편 이식을 위해 신장 캡슐로 세포를 기계적으로 전달하는 것을 용이하게 했습니다. 이러한 구조를 확립하기 위해, 기저막 매트릭스는 먼저 얼음처럼 차가운 조건에서 유체 상태로 유지되었습니다. 세?...

토론

반고체 배지 내부의 신생아 비장 세포의 응집은 비장 구조를 생성하기 위한 실행 가능한 방법을 나타냅니다. 유사한 기저막 매트릭스 기반 프로토콜이 3차원 비장 배양을 시작하기 위해 사용되어^{왔다 10}. 여기에서 우리는 비장 구조가 in vitro 오가노이드 배양 시스템뿐만 아니라 in vivo 이식 모델에도 동일하게 적용된다는 것을 보여줍니다. 참고로, 체외 배양 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 Well Polypropylene 1.2 mL Cluster Tubes	Corning	CLS4401	For placing inside a 14 ml conical tube
B-mercaptoethanol	Gibco	21985023	Stock 55 mM, use at 50 uM
Collagenase D	Roche	11088858001
Collagenase IV	Sigma-Aldrich	C5138	From Clostridium histolyticum
Deoxyribonuclease I (DNase I)	Sigma-Aldrich	D4513	Deoxyribonuclease I from bovine pancreas,Type II-S, lyophilized powder, Protein ≥80 %, ≥2,000 units/mg protein
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796	4500 mg/L Glucose, L-Glutamine, and Sodium Bicarbonate, without Sodium Pyruvate, Liquid. Sterile Filtered.
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537	Without calcium chloride and magnesium chloride, sterile-filtered
Eclipse 200 μl Pipette Tips	Labcon	1030-260-000	Bevel Point
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	26140-079	Lot# 1382243
GlutaMAX	Gibco	35050061	Stock 100X, use at 1X
Matrigel	Corning	354263	Matrigel matrix basement membrane High Concentration, Lot# 7330186
MEM Non-essential Amino Acids	Gibco	11140076	Stock 100X, use at 1X
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140122	Stock 10,000 units/ml Penicillin, 10,000 ug/ml Streptomycin
Reversible Cell Strainer	STEMCELL Technologies	27216	70 μm
Ring Tweezers	NAPOX	A-26	Ring size: 3 mm
Rock Inhibitor (Y-27632)	MedChemExpres	HY-10071
Thermofisher Heraeus Megafuge 40R Centrifuge	Thermofisher		Acceleration and deceleration speeds were set to 8
Ultra Fine Tweezers	EMS	78340-51S	Style 51S. Antimagnetic/anti-acid SA low carbon austenitic steel tweezers are corrosion resistant. Anti-glare satin finish.
Vicryl 5/0 Suture Ligapak Reel	Ethicon	J283G
Wiretrol II Long Wire Plunger	Drummond	5-000-2002-L	Stainless Steel Plunger, 25 & 50 μL/WRTL II, Long
Wound Clip Applier	MikRon	427630
Wound Clips	MikRon	427631	9 mm