تشخيصات قائمة على تقنية كريسبر في نقاط الرعاية مع كواشف مخلوطة مسبقا ومجففة بالتجميد

Summary

هنا ، نقدم التحضير خطوة بخطوة للتضخيم متساوي الحرارة القائم على إعادة التركيب والتعقيم بالتجميد والتفاعلات القائمة على التكرارات المتجانسة القصيرة المتباعدة بانتظام (CRISPR) ، والتي يمكن استخدامها للكشف عن المؤشرات الحيوية للحمض النووي لمسببات الأمراض المعدية أو العلامات الجينية الأخرى ذات الأهمية.

Abstract

تتميز التشخيصات الجزيئية عن طريق الكشف القائم على التكرارات المتجانسة القصيرة العنقودية المتباعدة بانتظام (CRISPR) بدقة تشخيصية عالية وسمات مناسبة للاستخدام في إعدادات نقاط الرعاية مثل أوقات الاستجابة السريعة للنتائج ، والقراءات البسيطة المريحة ، وعدم الحاجة إلى أدوات معقدة. ومع ذلك ، يمكن أن تكون ردود الفعل مرهقة في نقطة الرعاية بسبب مكوناتها العديدة وخطوات المناولة اليدوية. هنا ، نقدم بروتوكولا محسنا خطوة بخطوة للكشف القوي عن مسببات الأمراض والعلامات الجينية من خلال التضخيم متساوي الحرارة القائم على إعادة التركيب والكواشف القائمة على كريسبر ، والتي يتم خلطها مسبقا ثم تجفيفها بالتجميد بتنسيقات سهلة التخزين وجاهزة للاستخدام. يمكن إعادة ترطيب الكواشف المخلوطة مسبقا والمجففة بالتجميد للاستخدام الفوري والاحتفاظ بكفاءة عالية في التضخيم والكشف. نقدم أيضا دليلا لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها للمشكلات الشائعة عند إعداد واستخدام الكواشف المخلوطة مسبقا والمجففة بالتجميد للتشخيصات المستندة إلى كريسبر ، لجعل منصة الكشف أكثر سهولة لمجتمعات التشخيص / الاختبارات الجينية الأوسع.

Introduction

تم الإبلاغ عن التشخيصات المستندة إلى كريسبر للكشف عن المؤشرات الحيوية للحمض النووي لأول مرة في عام 2017^1،2،3،4 ، ومنذ ذلك الحين ، تم إثبات أنها تشخيصات من الجيل التالي من خلال الاختبارات المعتمدة من إدارة الغذاء والدواء (FDA) ، خاصة للكشف عن الحمض النووي الريبي المتلازمة التنفسية الحادة الوخيمة فيروس كورونا 2 (SARS-CoV-2) ، في بلدان^{متعددة 5،6،7،8}. بالإضافة إلى مرض فيروس كورونا 2019....

Protocol

1. تحضير الكواشف المخلوطة مسبقا RT-RPA المجففة بالتجميد

1. إعداد المعدات
   1. قم بإعداد ديوار أو صينية من النيتروجين السائل للتجميد السريع للتفاعلات. املأ الديوار أو الصينية بالنيتروجين السائل.
   2. مجفف التجميد
      1. تحقق من وجود ماء مكثف في أنابيب التصريف وداخل الغرفة ؛ قم بإزالة الماء إذا لزم الأمر.
      2. قم بتنظيف الجزء الداخلي من الغرفة والرف المعدني لأنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل بمحلول إزالة التلوث RNase ، متبوعا بنسبة 70٪ من الإيثانول.
      3. أغلق باب الغرفة وصمام تحرير الفراغ.
      4. قم بتشغيل مجفف التجميد.
      5. اضبط درجة حرارة الرف يدويا على -30 درجة مئوية.
      ....

النتائج

نسلط الضوء على حركية توليد إشارة مضان FAM من الكشف المشترك عن جينات s و n ل SARS-CoV-2 ، وكيف تم استخدام المعلومات لتحديد الظروف المثلى لتركيبات التفاعل المجففة بالتجميد والمخلوطة مسبقا. في جميع الحالات ، قمنا بتضمين عينات ذات قيم C_t جيدا ضمن حد الكشف المحدد (LoD) (C

Discussion

هناك خطوات حاسمة في هذا البروتوكول. لفصل المنطقة ، يوصى باستخدام مساحات منفصلة لاستخراج الحمض النووي ، وإعداد الماستر ميكس (منطقة التضخيم المسبق) ، وإضافة العينة ، واكتشاف الamplicon (منطقة ما بعد التضخيم). يجب تعيين كل منطقة باستخدام مجموعة منفصلة من الأدوات والمعدات. لا تح?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material
Betaine solution	Sigma-Aldrich	B0300-1VL
DEPC-Treated water	Invitrogen	AM9915G
Dithiothreitol (DTT)	Merck	3870-25GM
EpiScript reverse transcriptase	Lucigen	ERT12925K
Gly-Gly-Gly	Sigma-Aldrich	SIA-50239-1G
LwaCas13a	Producing in-house		Strain name:Leptotrichia wadei, Abbreviation: Lwa, Protein name: LwaCas13a
Magnesium chloride solution, 1M	Sigma-Aldrich	M1028-10X1ML
NxGenT7 RNA polymerase	Lucigen	30223-2
Poly(ethylene glycol)	Sigma-Aldrich	81300-1KG
Potassium acetate solution, 5M	Sigma-Aldrich	95843-100ML-F
Riobnucleotide Solution Mix	NEB	N0466L
RNase H	NEB	M0297L
Sucrose	TCI	TCI-S0111-500G
Trehalose Dihydrate	Sigma-Aldrich	SIA-90210-50G
Trizma hydrochloride solution, 1M, pH 7.4	Sigma-Aldrich	T2194-100ML
TwistAmp Basic kit	TwistDx	TABAS03KIT
Equipment
BluPAD Dual LED Blue/White light transilluminator	Bio-Helix	BP001CU
Dry Bath Dual Block	ELITE	4-2-EL-02-220	Model: EL-02
Fluorescence microplate reader	Tecan	30050303	Model: Infinite 200 Pro
Freeze dryer	LABCONCO	794001030	FreeZone Triad Benchtop Freeze Dryer
Microplate 384-well	Greiner	GDE0784076	F-Bottom, small volume, Hibase, Med. Binding, Black
Real-time thermal cycler (CFX Connect Real-Time PCR System)	Bio-Rad	185-5201	Model: CFX Connect Optics Module
Oligonucleotide
s-gene forward RPA primer	IDT		GAAATTAATACGACTCAC TATAGGGAGGTTTCAAAC TTTACTTGCTTTACATAGA
s-gene reverse RPA primer	IDT		TCCTAGGTTGAAGA TAACCCACATAATAAG
n-gene forward RPA primer	IDT		GAAATTAATACGACTC ACTATAGGAACTTCTC CTGCTAGAATGGCTG
n-gene reverse RPA primer	IDT		CAGACATTTTGCTCTC AAGCTGGTTCAATC
LwaCas13a-crRNA for the s gene	Synthego		GAUUUAGACUACCCCAAAAAC GAAGGGGACUAAAACGCAGCA CCAGCUGUCCAACCUGAAGAAG
LwaCas13a-crRNA for the n gene	Synthego		GAUUUAGACUACCCCAAAAACG AAGGGGACUAAAACAAAGCAAG AGCAGCAUCACCGCCAUUGC
FAM-polyU-IABkFQ reporter	IDT		56-FAM/rUrUrUrUrU/3IABkFQ
O-hannah_cytb_F RPA primer	IDT		GAAATTAATACGACTCACTA TAGGGTACGGATGAACCATA CAAAACCTTCACGCAATCG
O-hannah_cytb_R RPA primer	IDT		AAGATCCATAGTAGATTC CTCGTGCGATGTGGATA
synT7crRNA13a_ O_hannah	IDT		GCGCATCCATATTCTTCAT CTGCATTTAGTTTTAGTCC CCTTCGTTTTTGGGGTA GTCTAAATCCCCTATAGT GAGTCGTATTAATTTC