JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، نقدم التحضير خطوة بخطوة للتضخيم متساوي الحرارة القائم على إعادة التركيب والتعقيم بالتجميد والتفاعلات القائمة على التكرارات المتجانسة القصيرة المتباعدة بانتظام (CRISPR) ، والتي يمكن استخدامها للكشف عن المؤشرات الحيوية للحمض النووي لمسببات الأمراض المعدية أو العلامات الجينية الأخرى ذات الأهمية.

Abstract

تتميز التشخيصات الجزيئية عن طريق الكشف القائم على التكرارات المتجانسة القصيرة العنقودية المتباعدة بانتظام (CRISPR) بدقة تشخيصية عالية وسمات مناسبة للاستخدام في إعدادات نقاط الرعاية مثل أوقات الاستجابة السريعة للنتائج ، والقراءات البسيطة المريحة ، وعدم الحاجة إلى أدوات معقدة. ومع ذلك ، يمكن أن تكون ردود الفعل مرهقة في نقطة الرعاية بسبب مكوناتها العديدة وخطوات المناولة اليدوية. هنا ، نقدم بروتوكولا محسنا خطوة بخطوة للكشف القوي عن مسببات الأمراض والعلامات الجينية من خلال التضخيم متساوي الحرارة القائم على إعادة التركيب والكواشف القائمة على كريسبر ، والتي يتم خلطها مسبقا ثم تجفيفها بالتجميد بتنسيقات سهلة التخزين وجاهزة للاستخدام. يمكن إعادة ترطيب الكواشف المخلوطة مسبقا والمجففة بالتجميد للاستخدام الفوري والاحتفاظ بكفاءة عالية في التضخيم والكشف. نقدم أيضا دليلا لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها للمشكلات الشائعة عند إعداد واستخدام الكواشف المخلوطة مسبقا والمجففة بالتجميد للتشخيصات المستندة إلى كريسبر ، لجعل منصة الكشف أكثر سهولة لمجتمعات التشخيص / الاختبارات الجينية الأوسع.

Introduction

تم الإبلاغ عن التشخيصات المستندة إلى كريسبر للكشف عن المؤشرات الحيوية للحمض النووي لأول مرة في عام 20171،2،3،4 ، ومنذ ذلك الحين ، تم إثبات أنها تشخيصات من الجيل التالي من خلال الاختبارات المعتمدة من إدارة الغذاء والدواء (FDA) ، خاصة للكشف عن الحمض النووي الريبي المتلازمة التنفسية الحادة الوخيمة فيروس كورونا 2 (SARS-CoV-2) ، في بلدانمتعددة 5،6،7،8. بالإضافة إلى مرض فيروس كورونا 2019 (COVID-19) ، أثبتت التقنيات فعاليتها في الكشف عن الفيروسات والبكتيريا المتنوعة9،10،11،12،13 ، والطفرات والحذف في الأمراض الوراثية ، ويمكن تصميمها للكشف عن البروتين والمؤشرات الحيوية للجزيئات الصغيرة2،12. غالبا ما تجمع التشخيصات المستندة إلى كريسبر بين طرق التضخيم متساوي الحرارة - مثل تضخيم البوليميراز المدمج (RPA) أو التضخيم متساوي الحرارة بوساطة الحلقة (LAMP) 14،15 - مع الكشف المستند إلى CRISPR باستخدام الإنزيمات المرتبطة ب CRISPR (Cas) الموجهة بالحمض النووي الريبي مع نشاط نوكلياز داخلي "جانبي" بعد التعرف على الهدف3. يمنح الاستخدام المزدوج للتضخيم متساوي الحرارة والكشف المستند إلى CRISPR العديد من السمات المرغوبة للتقنيات ، لا سيما دقة التشخيص العالية التي تقترب من تفاعل البوليميراز المتسلسل القياسي الذهبي (PCR) ، والقدرة على تعدد الإرسال واكتشاف اختلافات التسلسل الصغيرة ، بما في ذلك تعدد أشكال النوكليوتيداتالمفردة 1،9.

ومع ذلك ، تحتوي الإصدارات الأكثر دقة من التشخيصات المستندة إلى كريسبر على مكونات وخطوات متعددة ويمكن أن تكون معقدة لتنفيذها مع غير الخبراء أو في نقطة الرعاية (POC). لمواجهة هذا التحدي المتمثل في توسيع نطاق استخدام التشخيصات عالية الدقة المستندة إلى CRISPR إلى إعدادات POC ، قمنا بتطوير بروتوكولات لإعداد التضخيم متساوي الحرارة القائم على الخلط مسبقا ، والمجفف بالتجميد ، وإعادة التركيب ، وتفاعلات الكشف القائمة على CRISPR ، والتي يسهل استخدامهاوتخزينها. يجب أن تكمل هذه البروتوكولات البروتوكولات الممتازة الحالية بشأن التشخيص المستند إلى كريسبر14 ، والتي تحتوي على معلومات إضافية حول إنتاج المكونات الكيميائية الحيوية اللازمة للتشخيص المستندإلى كريسبر 7 ، وإرشادات التصميم1 ، والتركيبات التي تستخدم تقنيات التضخيم متساوي الحرارةالبديلة 2 ، 14 ، 15 ، 16 وإنزيمات كاس12. في النهاية ، نأمل أن تساعد التشخيصات المستندة إلى كريسبر في تحقيق الكشف النووي السريع وغير المكلف والحساس في الأماكن التي تتطلب تحليلات محمولة وخالية من الأدوات1،9،17.

نحن نستخدم بشكل أساسي مجموعة من الكشف المستند إلى RPA و Cas13 في بروتوكولاتنا. تعمل تقنية RPA في درجات حرارة قريبة من البيئة المحيطة (37-42 درجة مئوية) ، وبالتالي ، لديها متطلبات منخفضة للطاقة والمعدات. تتطلب تفاعلات التضخيم متساوية الحرارة الأخرى درجات حرارة أعلى (LAMP ، 60-65 درجة مئوية ؛ تضخيم إزاحة الخيوط (SDA) ، 60 درجة مئوية ؛ تفاعل التضخيم الأسي (EXPAR) ، 55 درجة مئوية ؛ والتضخيم المعتمد على الهليكياز (HDA) ، 65 درجة مئوية) 2. كما أن تصميم بادئات RPA ليس معقدا ، على عكس بادئات LAMP ، ويمكن تمديده إلى تضخيم متعددالإرسال 7،9،14. على الرغم من أن تعدد الإرسال إلى ما بعد هدفين باستخدام تقنية RPA أمر صعب من الناحية العملية، إلا أن هناك إرشادات واضحة حول كيفية تصميم بادئات RPA متعددة الإرسال لتقليل التداخل18.

في حين أن التلوث المرحل لا يزال يمثل مشكلة كبيرة في سير العمل المكون من خطوتين ، فإن amplicons التي تم إنشاؤها من RPA صغيرة الحجم وأقل عرضة للتسبب في تلوث ترحيل مقارنة بالأمبليكونات المتسلسلة الكبيرة من LAMP14. يمكن تصميم بادئات RPA وفقا للإرشادات القياسية14: فهي بشكل عام 25-35 نيوكليوتيدات مع درجات حرارة انصهار تتراوح من 54 إلى 67 درجة مئوية. يجب أن يكون حجم الأمبليكون أصغر من 200 زوج أساسي. يمكن إضافة إنزيم النسخ العكسي (RT) إلى RPA لتمكين التضخيم من الحمض النووي الريبي ، وفي النسخ العكسي - RPA (RT-RPA) ، عادة ما تتم إضافة إنزيم آخر Ribonuclease H (RNase H) بكميات صغيرة للمساعدة في حل الحمض النووي الريبي الناتج: هجين الحمض النووي وتعزيز تفاعل التضخيم5،19. للسماح بنسخ T7 للكشف المستند إلى Cas13 ، يمكن وضع محفز بوليميراز T7 RNA في نهاية 5 'من برايمر RPA الأمامي.

بعد إنشاء الأمبليكونات من RPA ، يمكن اكتشافها باستخدام إنزيمات Cas المبرمجة بواسطة crRNA. من بين إنزيمات Cas المختلفة التي يمكن استخدامها للكشف عن Amplicon ، نفضل متغيرات Cas13 التي تستهدف الحمض النووي الريبي نظرا لنشاط الانقسام العالي1 وتفضيلات انقسام عديد النوكليوتيدات المميزةجيدا 7،9 ، والتي يمكن استخدام الأخيرة للكشف عن الإرسال المتعدد. تم تصميم تسلسل crRNA ل Cas13 ليكون مكملا (مكملا عكسيا) للموقع المستهدف في الحمض النووي الريبي المنتج مع تسلسل فاصل وتكرار مباشر (DR). يجب ألا يتداخل تسلسل crRNA وبادئات RPA ، لتجنب الكشف غير المرغوب فيه المستند إلى Cas لمنتجات التضخيم خارج الهدف ، مما يزيد من الخلفية والإيجابيات الخاطئة14.

يعتمد الكشف المستند إلى Cas على طرق الكشف المختلفة لمراقبة انقسام جزيئات الحمض النووي المراسل (مراسلو الحمض النووي الريبي للتفاعلات المستندة إلى Cas13) 1،2،14. تشمل طرق الكشف المختلفة قياس الألوان ، والقراءات الكهروكيميائية ، والتألق ، وقراءات التسلسل ، وشرائط التدفق الجانبي2. نحن نركز على قراءة التألق بالنظر إلى مجموعة متنوعة من الفلوروفورات والمراسلين مثل السيانين 5 (Cy5) ، والرودامين X (ROX) ، والكربوكسي فلورسين (FAM) ، والتي يمكن إثارتها بشكل فعال باستخدام مصدر ضوء LED أزرق واحد ، ويتم تحليل تألقها بواسطة قارئ صفيحة دقيقة أو جهاز تدوير حراري في الوقت الفعلي7،14. بالإضافة إلى ذلك ، من السهل إعداد قراءة التألق وتسمح بالمراقبة المستمرة ، مما يتيح القياس الكمي في الوقت الفعلي. يمكن دمج التضخيم المسبق ل RPA متعدد الإرسال والكشف المتعدد المستند إلى Cas13 باستخدام إنزيمات Cas مع قراءات مضان متعددة الألوان للكشف المتزامن عن الأهداف الجينية المتعددة2،7.

في بروتوكولاتنا ، نقوم أولا بتضخيم الحمض النووي الريبي متساوي الحرارة باستخدام RT-RPA عن طريق إضافة عينة الحمض النووي الريبي إلى الشكل المجفف بالتجميد لكاشف RT-RPA (الشكل 1). أثناء RT-RPA ، تتم إضافة محفز T7 إلى مضخم الحمض النووي مزدوج الشريطة. بعد ذلك ، يتم نقل منتجات RPA إلى الكشف القائم على Cas13 المجفف بالتجميد ، والذي يحتوي أيضا على بوليميراز T7 RNA. سيقوم تفاعل الكشف هذا بتحويل أمبليكونات الحمض النووي إلى حمض نوال أربي (عبر بوليميراز الحمض النووي الريبي T7) ، والذي يمكن اكتشافه بسهولة باستخدام Cas13 المبرمج بواسطة crRNA. سوف يشق Cas13 الذي يتم تنشيطه الهدف جزيئات المراسل لإنتاج إشارة مضان قابلة للاكتشاف2،7،14. في حين أن البروتوكولات هنا تتعلق بالكشف بواسطة Leptotrichia wadei (LwaCas13a) ، يمكن توسيعها إلى الكشف المتزامن ومضاعف الإرسال لما يصل إلى أربعة أهداف باستخدام إنزيمات Cas13 و Cas12 المتعامدة7،9. يمكن أيضا دمج تفاعلات الكشف المستندة إلى RPA و Cas في أنبوب واحد ، وإن كان ذلك مع فقدان الحساسية14.

figure-introduction-8135
الشكل 1: سير عمل الكشف المستند إلى CRISPR. يوضح سير العمل اكتشاف جينين مستهدفين. أولا ، يتم تضخيم مناطق الأهمية داخل هدف الحمض النووي متساوي الحرارة باستخدام RPA. يمكن إجراء التفاعل باستخدام النسخ العكسي (RT-RPA) عند اكتشاف أهداف الحمض النووي الريبي. بعد ذلك ، يقوم نسخ T7 بتحويل أمبليكونات dsDNA إلى RNAs ، والتي بدورها يتم التعرف عليها بواسطة مجمعات Cas13-crRNA القادرة على استنباط نشاط RNase الجانبي عند الارتباط المستهدف. ينتج عن انقسام مراسلي التألق المروي إشارات مضان يمكن مراقبتها باستخدام قارئ صفيحة دقيقة ، أو يتم تصورها بواسطة مصباح إضاءة LED ، أو استخدامها مع جهاز تدوير حراري في الوقت الفعلي. الاختصارات: كريسبر = التكرارات المتجانسة القصيرة العنقودية المتباعدة بانتظام ؛ RT = النسخ العكسي ؛ RPA = تضخيم البوليميراز المركب ؛ كاس = البروتين المرتبط بكريسبر. LED = الصمام الثنائي الباعث للضوء. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

السمات الرئيسية للبروتوكولات المعروضة هنا هي تركيبات الخلط المسبق للتجميد بالتجميد. يعمل الخلط المسبق على تبسيط استخدام التفاعل ويعزز قابلية التكاثر ، ولكن العديد من المكونات داخل RPA والكشف المستند إلى Cas - وخاصة النسخ العكسي وبعض العوامل المساعدة القابلة للتغيير مثل ATP ليست مستقرة في المحلول. لذلك ، نقوم بصياغة الحلول المخلوطة مسبقا بحيث يمكن تجفيفها بالتجميد للتخزين طويل الأجل وسهولة النقل والنشر1،9،20. تساعد الكواشف المخلوطة مسبقا والمجففة بالتجميد أيضا على تحسين حساسية الكشف ، حيث يمكن إضافة حجم عينة أعلى (وبالتالي ، مدخلات أعلى للحمض النووي / الحمض النووي الريبي) لإعادة تكوين التفاعل10. في تركيباتنا ، نستخدم في المقام الأول تريهالوز21 كمادة ساخنة بالتبريد في تفاعلات الكشف عن RPA المجففة بالتجميد وتفاعلات الكشف المستندةإلى Cas 7. بالإضافة إلى الحفاظ على الكاشف ، يعزز التريهالوز أيضا التفاعلات عن طريق زيادة استقرار الإنزيم16،22،23،24 وتقليل درجات حرارة انصهار dsDNA23. قد ينتج عن استكشاف مثبتات أخرى5،7،21،25،26 خارج تريهالوز تركيبات أكثر مثالية لسيناريوهات الاستخدام المختلفة.

Protocol

1. تحضير الكواشف المخلوطة مسبقا RT-RPA المجففة بالتجميد

  1. إعداد المعدات
    1. قم بإعداد ديوار أو صينية من النيتروجين السائل للتجميد السريع للتفاعلات. املأ الديوار أو الصينية بالنيتروجين السائل.
    2. مجفف التجميد
      1. تحقق من وجود ماء مكثف في أنابيب التصريف وداخل الغرفة ؛ قم بإزالة الماء إذا لزم الأمر.
      2. قم بتنظيف الجزء الداخلي من الغرفة والرف المعدني لأنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل بمحلول إزالة التلوث RNase ، متبوعا بنسبة 70٪ من الإيثانول.
      3. أغلق باب الغرفة وصمام تحرير الفراغ.
      4. قم بتشغيل مجفف التجميد.
      5. اضبط درجة حرارة الرف يدويا على -30 درجة مئوية.
    3. معدات البيولوجيا الجزيئية
      1. قم بتنظيف ما يلي باستخدام محلول إزالة التلوث RNase: الماصات ورفوف أطراف الماصة وخلاط دوامة وجهاز طرد مركزي صغير دوار لأسفل وعلامة دائمة.
      2. نظف ما يلي بماء الصنبور ، ثم امسحه بورق تنظيف مناديل: رفوف بلاستيكية لأنابيب الطرد المركزي الدقيقة وصندوق رغوي للثلج.
      3. قم بإعداد كتلة تسخين (تستخدم لإذابة / إذابة محلول الدهون الثلاثية) عن طريق تنظيفها بمحلول إزالة التلوث RNase و 70٪ من الإيثانول. ثم قم بتشغيله واضبط درجة الحرارة على 60 درجة مئوية.
  2. تحضير تفاعلات RPA المختلطة مسبقا
    ملاحظة: هذه الصيغة مخصصة ل 10 تفاعلات (باستخدام ثلاث كريات RPA).
    1. تحقق مما إذا كان هناك أي راسب في محلول الدهون الثلاثية قبل الاستخدام. إذا كانت هناك رواسب ، فقم بإذابتها عن طريق احتضانها عند 60 درجة مئوية وخلطها جيدا قبل الاستخدام. قم بتبريد محلول الدهون الثلاثية قبل إضافة الكواشف الأخرى الحساسة للحرارة.
      ملاحظة: يمكن أن تتشكل الرواسب بسهولة إذا ترك الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لفترة طويلة.
    2. قم بإزالة ثلاثة أنابيب شريط بيليه RPA من الفريزر ؛ اضغط على أنابيب الشريط عن طريق طرقها برفق على مقعد المختبر لإخراج الكريات البيضاء.
    3. انقل جميع الكريات الثلاثة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل A.
    4. الماصة 25 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز لشطف أي مسحوق RPA متبقي في الأنابيب الشريطية ونقل محلول الشطف إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 مل B.
    5. أضف 10 ميكرولتر من محلول الدهون الثلاثية 0.57 M و 10 ميكرولتر من مزيج التمهيدي (10 ميكرومتر لكل منهما) إلى أنبوب Mastermix B.
    6. أنبوب مزيج دوامة ب ؛ ثم قم بالدوران وضع الأنبوب على الجليد.
    7. أضف 28.4 ميكرولتر من المخزن المؤقت 5x RPA (محضر من 500 ميكرولتر من 50٪ (وزن / حجم) PEG20000 ، و 250 ميكرولتر من 1 M Tris pH 7.4 ، و 100 ميكرولتر من 100 ملي مولار dithiothreitol (DTT)) إلى أنبوب Mastermix B واخلطه جيدا عن طريق النقر القوي أو الاهتزاز عدة مرات.
      ملاحظة: نصنع الحل بهذه الطريقة للمساعدة في تخفيف / تقليل لزوجة PEG في أنبوب الماستر ميكس ، قبل إضافة كل شيء لإذابة كريات RPA.
    8. انقل الكريات التي تم جمعها في الأنبوب A من الخطوة 1.2.3 إلى أنبوب الماستر ميكس B ثم اقلب أنبوب الماستر ميكس عدة مرات للخلط. لاحظ ما إذا كان المحلول يبدو متجانسا وأحادي الطور (سيبدو أيضا معتما قليلا) ثم ضع الأنبوب على الجليد.
      ملاحظة: إذا لم يكن الخلط شاملا ، يمكن أن يتسبب PEG في فصل المحلول / التعليق عن الطور.
    9. أضف 0.71 ميكرولتر من 200 وحدة / ميكرولتر RT و 2.84 ميكرولتر من 5 وحدات / ميكرولتر RNase H إلى أنبوب الماسترمكس. اضغط برفق على أنبوب الماستر ميكس أو اقلبه لأعلى ولأسفل عدة مرات. قم بالدوران وضع الأنبوب على الجليد.
      ملاحظة: نضيف هذه الإنزيمات بعد الخلط الثقيل للخطوات السابقة لأن RT و RNase H حساسان للقص بسبب الخلط ؛ لا مزيد من الدوامة بعد إضافة RT / RNase H.
    10. Aliquot 8.4 ميكرولتر من محلول mastermix إلى 10 أنابيب مبردة مسبقا سعة 1.5 مل ووضع الأنابيب على الجليد. للقيام بذلك، قم بغمر طرف الماصة في محلول الماستر ميكس واسحب محلول الماصة في الطرف ببطء وثبات لمنع تكون فقاعات الهواء ولضمان قياس الحجم بدقة. قم بتوزيع محلول الماستر ميكس في أنبوب مبرد مسبقا سعة 1.5 مل.
      ملاحظة: مع 8.4 ميكرولتر مقتبس ، في تجربتنا ، سيكون هناك ~ 1-2 ميكرولتر معلق متبقي في أنبوب الماسترميكس. يمكن للمجرب ضبط حجم الاقتباس قليلا لضمان كواشف كافية لجميع التفاعلات العشرة. استخدم تقنيات سحب العينات المناسبة عند التعامل مع المحاليل اللزجة.
    11. بعد اكتمال الاقتباس ، ضع الأنابيب في رف معدني مغمور في النيتروجين السائل لإعدادها للتجميد بالتجميد. اترك الأنابيب مغمورة في النيتروجين السائل لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: نظرا لأن التجميد يزيل المحلول الزائد ، فإنه يسمح لنا بإضافة المزيد من مدخلات الحمض النووي / الحمض النووي الريبي ، مما يساعد على زيادة الحساسية. يمكن تخزين تفاعلات RPA المخلوطة مسبقا المجففة بالتجميد عند -20 درجة مئوية لمدة 8 أشهر. يساعد التجميد بالتجميد في قابلية التكاثر إذا تم إجراء تجربة معينة باستخدام خلطات RPA الرئيسية المعدة في نفس الدفعة ، لذا فإن صنع دفعة أكبر يساعد أيضا.
  3. التجميد بالتجميد
    1. في مجفف التجميد ، تحقق من درجات حرارة المجمع والرف. إذا لزم الأمر ، انتظر حتى تصل درجة حرارة المجمع إلى -75 ± 5 درجة مئوية وتصل درجة حرارة الرف إلى -30 ± 1 درجة مئوية.
    2. قم بتغطية الأنابيب المفتوحة في الرف المعدني بورقة من ورق التنظيف ، ضع الرف المعدني مع الأنابيب المفتوحة في رف مجفف التجميد ، وأغلق باب الرف.
    3. حدد البرنامج الموضح في الجدول 1 واضغط على ابدأ. بعد 30 دقيقة من خطوة التجفيف الثانوية (20 درجة مئوية ، <0.1 ملي بار ؛ يتم الاحتفاظ بدرجة الحرارة بلا حدود عن طريق ضبط وقت الخطوة على "لانهائي") ، اضغط على إيقاف البرنامج.
      ملاحظة: نترك الأنابيب تسخن في مجفف التجميد لمنع تكثيف الماء.
    4. حرر الضغط عن طريق فتح صمام تحرير الفراغ ، ثم قم بإزالة الرف من الرف. قم بتغطية الأنابيب على الفور وقم بتخزين التفاعلات المجففة بالتجميد عند -20 درجة مئوية.
      ملاحظة: يمكن تخزين تفاعلات RPA المجففة بالتجميد و CRISPR-Cas13a مسبقا عند -20 درجة مئوية لمدة 8 أشهر.

2. تحضير كواشف الكشف CRISPR-Cas13a المجففة بالتجميد

ملاحظة: اتبع الخطوة 1.1 لإعداد المعدات.

  1. تحضير تفاعل CRISPR-Cas13a مسبقا (10 تفاعلات)
    1. قم بإزالة العناصر التالية من التخزين وضعها على الثلج: 10 ميكرولتر من LwaCas13a (يتم إنتاجه داخليا7،8،14) (2 مجم / مل) ، مخزن تخزين Cas ، 10 نانوغرام / ميكرولتر (225 نانومتر) crRNA ، 25 ملي مولار rNTP ، 50 وحدة / ميكرولتر T7 بوليميراز الحمض النووي الريبي ، 2 ميكرومتر من مراسل مضان FAM.
    2. قم بإعداد محلول عملي ل LwaCas13a عند 126 ميكروغرام / مل (900 نانومتر) عن طريق إضافة 148.8 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتخزين Cas (50 ملي مولار Tris-HCl الرقم الهيدروجيني 7.4 ، 0.6 م كلوريد الصوديوم ، 5٪ جلسرين ، 2 ملي DTT) إلى 10 ميكرولتر من 2 مجم / مل LwaCas13a.
    3. قم بإعداد تفاعل CRISPR-Cas13a mastermix على النحو التالي: 71 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase ، 20 ميكرولتر من 400 ملي مولار تريس الرقم الهيدروجيني 7.4 ، 20 ميكرولتر من 60٪ (وزن / حجم) تريهالوز ، 10 ميكرولتر من 10 نانوغرام / ميكرولتر (225 نانومتر) crRNA (هنا ، يستهدف جينات s و n من SARS-CoV-2) ، 8 ميكرولتر من مزيج 100 ملي مولار rNTP (25 ملي مولار لكل منهما) ، 6 ميكرولتر من 50 وحدة / ميكرولتر T7 بوليميراز الحمض النووي الريبي ، 25 ميكرولتر من 2 ميكرومتر من تقرير مضان FAM ، و 10 ميكرولتر من 126 ميكروغرام / مل (900 نانومتر) LwaCas13a. تخلط جيدا عن طريق عكس أنبوب الماسترميكس. ثم تدور لأسفل.
    4. Aliquot 17 ميكرولتر من الماستر ميكس إلى 10 أنابيب 1.5 مل موضوعة على الجليد. ضع الأنابيب في رف مغمور في النيتروجين السائل واترك الأنابيب مغمورة في النيتروجين السائل لمدة 5 دقائق.
  2. التجميد بالتجميد
    1. في مجفف التجميد ، تحقق من درجات حرارة المجمع والرف وانتظر حتى تصل درجة حرارة المجمع إلى -75 ± 5 درجة مئوية وتصل درجة حرارة الرف إلى -30 ± 1 درجة مئوية.
    2. ضع الأنابيب في مجفف التجميد. حدد البرنامج الموضح في الجدول 1 واضغط على ابدأ. بعد 30 دقيقة من خطوة التجفيف الثانوية (25 درجة مئوية ، <0.1 ملي بار ؛ يتم الاحتفاظ بدرجة الحرارة بشكل لا نهائي عن طريق ضبط وقت الخطوة على "لانهائي") ، أوقف البرنامج.
    3. حرر الضغط عن طريق فتح صمام تحرير الفراغ وإزالة الرف من الرف. قم بتغطية الأنابيب على الفور وقم بتخزين التفاعلات المجففة بالتجميد عند -20 درجة مئوية.
      ملاحظة: يمكن تخزين الكواشف المخلوطة مسبقا RPA و CRISPR-Cas13a المجففة بالتجميد عند -20 درجة مئوية لمدة 8 أشهر.

3. تضخيم الحمض النووي RT-RPA

ملاحظة: لمنع التلوث المتبادل، يجب فصل مناطق مكان العمل والماصات للتضخيم المسبق وإضافة العينة والتضخيم اللاحق. نوصي باستخدام أطراف الماصة المفلترة.

  1. قم بتسخين حاضنة الاهتزاز الحراري عند 42 درجة مئوية.
  2. أضف 1 ميكرولتر من خلات المغنيسيوم (Mg (OAc) 2) ومزيج محلول أسيتات البوتاسيوم (KOAc) (يتكون من 196 ملي مولار مجم (OAc) 2 و 1.5 م KOAc) إلى جانب الأنبوب الذي يحتوي على حبيبات RT-RPA المجففة بالتجميد (من القسم 1).
    ملاحظة: خدعة لإضافة مزيج Mg (OAc) 2 و KOAc: يجب وضع القطرة عند علامة حجم 1 مل للأنبوب. هنا ، سيكون الانخفاض مرئيا بوضوح ومن غير المحتمل أن يضيع من إغلاق الأنبوب أو الإجراءات الأخرى. سيبدأ التضخيم بعد الدوران لأسفل لجمع القطرة في قاع الأنبوب. عند معالجة أكثر من تفاعل واحد في وقت واحد ، يمكن بدء التضخيم في وقت واحد.
  3. أعد تعليق حبيبات RT-RPA بإضافة 12.4 ميكرولتر من عينة الحمض النووي الريبي (أو عينات التحكم).
    ملاحظة: تسلسل الإضافة هو العينة السلبية / التحكم السلبي ، الحمض النووي الريبي / الحمض النووي المراد اختباره ، العينة الإيجابية / التحكم الإيجابي.
  4. لبدء تفاعل RT-RPA ، قم بتدوير الحل المضاف لفترة وجيزة من الخطوتين 3.2 و 3.3 باستخدام جهاز طرد مركزي صغير دائري في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 ثوان.
  5. امزج عن طريق النقر بعناية على الأنبوب ثم قم بتدوير قصير آخر لمدة 3 ثوان.
  6. احتضان التفاعل عند 42 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة عن طريق وضعه في كتلة تسخين مسخنة مسبقا أو حاضنة اهتزاز حراري.
  7. بعد نهاية التفاعل ، أخرج أنابيب التفاعل وضعها على الجليد قبل الانتقال إلى خطوة الكشف عن CRISPR-Cas (القسم 4).
    ملاحظة: يمكن استخدام المنتج المضخم بتقنية RPA في تفاعل الكشف على الفور أو يمكن تخزينه عند 4 درجات مئوية لعدة أيام أو عند -20 درجة مئوية لعدة أشهر.

4. كشف الحمض النووي CRISPR-Cas13

  1. قم بتشغيل قارئ الألواح الدقيقة الفلورية ، واضبط درجة حرارة التسخين وقم بتسخينها مسبقا على 37 درجة مئوية ، وحدد البرنامج الموضح في الجدول 2.
  2. ضع طبقا بسعة 384 بئرا على الثلج.
  3. أعد تعليق تفاعل الكشف الممزوج مسبقا CRISPR-Cas المجفف بالتجميد (من القسم 2) بإضافة 17 ميكرولتر من محلول كلوريد المغنيسيوم 8 ملليمتر. امزج عن طريق النقر بعناية على الأنبوب. ثم قم بالدوران لفترة وجيزة لمدة 3 ثوان وضع الأنبوب على الجليد.
  4. انقل 18 ميكرولتر من مزيج التفاعل المعلق إلى كل بئر من الصفيحة المبردة مسبقا المكونة من 384 بئرا على الجليد.
  5. أضف 2 ميكرولتر من ناتج RPA المحضر في القسم 3 إلى كل تفاعل جيد.
  6. قم بإزالة اللوحة من الجليد ، وضعها بسرعة في قارئ صفيحة مضان مسخن مسبقا ، واضغط على ابدأ.
    ملاحظة: تم وضع صفيحة 384 بئرا على الجليد للسماح بمزامنة بدء التفاعل عند نقل اللوحة المكونة من 384 بئرا إلى قارئ صفيحة مضان مسخن مسبقا.

النتائج

نسلط الضوء على حركية توليد إشارة مضان FAM من الكشف المشترك عن جينات s و n ل SARS-CoV-2 ، وكيف تم استخدام المعلومات لتحديد الظروف المثلى لتركيبات التفاعل المجففة بالتجميد والمخلوطة مسبقا. في جميع الحالات ، قمنا بتضمين عينات ذات قيم Ct جيدا ضمن حد الكشف المحدد (LoD) (C

Discussion

هناك خطوات حاسمة في هذا البروتوكول. لفصل المنطقة ، يوصى باستخدام مساحات منفصلة لاستخراج الحمض النووي ، وإعداد الماستر ميكس (منطقة التضخيم المسبق) ، وإضافة العينة ، واكتشاف الamplicon (منطقة ما بعد التضخيم). يجب تعيين كل منطقة باستخدام مجموعة منفصلة من الأدوات والمعدات. لا تح?...

Disclosures

قدمت MP و C.U. براءة اختراع في تايلاند بشأن تركيبات الكشف المتعدد عن الحمض النووي الريبي SARS-CoV-2. تعلن ر. ك. عن عدم وجود مصالح متضاربة.

Acknowledgements

تعترف CU بالتمويل المقدم من بنك سيام التجاري التابع لمركز أبحاث VISTEC-Siriraj Frontier ، ومن تايلاند لأبحاث العلوم والابتكار (TSRI) ، الصندوق الأساسي ، السنة المالية 2024 ، رقم المنحة FRB670026/0457. يتم دعم R.K. و M.P. من خلال أموال المنح الدراسية والمساعدة البحثية من VISTEC ، على التوالي.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Material
Betaine solutionSigma-AldrichB0300-1VL
DEPC-Treated waterInvitrogenAM9915G
Dithiothreitol (DTT)Merck3870-25GM
EpiScript reverse transcriptaseLucigenERT12925K
Gly-Gly-Gly Sigma-AldrichSIA-50239-1G
LwaCas13aProducing in-houseStrain name:Leptotrichia wadei, Abbreviation: Lwa, Protein name: LwaCas13a
Magnesium chloride solution, 1MSigma-AldrichM1028-10X1ML
NxGenT7 RNA polymeraseLucigen30223-2
Poly(ethylene glycol)Sigma-Aldrich81300-1KG
Potassium acetate solution, 5MSigma-Aldrich95843-100ML-F
Riobnucleotide Solution MixNEBN0466L
RNase HNEBM0297L
SucroseTCITCI-S0111-500G
Trehalose DihydrateSigma-AldrichSIA-90210-50G
Trizma hydrochloride solution, 1M, pH 7.4Sigma-AldrichT2194-100ML
TwistAmp Basic kitTwistDxTABAS03KIT
Equipment
BluPAD Dual LED Blue/White light transilluminatorBio-HelixBP001CU
Dry Bath Dual BlockELITE4-2-EL-02-220Model: EL-02
Fluorescence microplate readerTecan30050303Model: Infinite 200 Pro
Freeze dryerLABCONCO794001030FreeZone Triad Benchtop Freeze Dryer
Microplate 384-wellGreinerGDE0784076F-Bottom, small volume, Hibase, Med. Binding, Black
Real-time thermal cycler (CFX Connect Real-Time PCR System)Bio-Rad185-5201Model: CFX Connect Optics Module
Oligonucleotide
s-gene forward RPA primerIDTGAAATTAATACGACTCAC
TATAGGGAGGTTTCAAAC
TTTACTTGCTTTACATAGA
s-gene reverse RPA primerIDTTCCTAGGTTGAAGA
TAACCCACATAATAAG
n-gene forward RPA primerIDTGAAATTAATACGACTC
ACTATAGGAACTTCTC
CTGCTAGAATGGCTG
n-gene reverse RPA primerIDTCAGACATTTTGCTCTC
AAGCTGGTTCAATC
LwaCas13a-crRNA for the s geneSynthegoGAUUUAGACUACCCCAAAAAC
GAAGGGGACUAAAACGCAGCA
CCAGCUGUCCAACCUGAAGAAG
LwaCas13a-crRNA for the n geneSynthegoGAUUUAGACUACCCCAAAAACG
AAGGGGACUAAAACAAAGCAAG
AGCAGCAUCACCGCCAUUGC
FAM-polyU-IABkFQ reporterIDT56-FAM/rUrUrUrUrU/3IABkFQ
O-hannah_cytb_F RPA primerIDTGAAATTAATACGACTCACTA
TAGGGTACGGATGAACCATA
CAAAACCTTCACGCAATCG
O-hannah_cytb_R RPA primerIDTAAGATCCATAGTAGATTC
CTCGTGCGATGTGGATA
synT7crRNA13a_ O_hannah IDTGCGCATCCATATTCTTCAT
CTGCATTTAGTTTTAGTCC
CCTTCGTTTTTGGGGTA
GTCTAAATCCCCTATAGT
GAGTCGTATTAATTTC

References

  1. Gootenberg, J. S., et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science. 356 (6336), 438-442 (2017).
  2. Kaminski, M. M., Abudayyeh, O. O., Gootenberg, J. S., Zhang, F., Collins, J. J. CRISPR-based diagnostics. Nat Biomed Eng. 5 (7), 643-656 (2021).
  3. Makarova, K. S., Koonin, E. V. Annotation and classification of CRISPR-Cas systems. Methods Mol Biol. (1311), 47-75 (2015).
  4. Chen, J. S., et al. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science. 360 (6387), 436-439 (2018).
  5. Arizti-Sanz, J., et al. Simplified Cas13-based assays for the fast identification of SARS-CoV-2 and its variants. Nat Biomed Eng. 6 (8), 932-943 (2022).
  6. Broughton, J. P., et al. CRISPR-Cas12-based detection of SARS-CoV-2. Nat Biotechnol. 38 (7), 870-874 (2020).
  7. Patchsung, M., et al. A multiplexed Cas13-based assay with point-of-care attributes for simultaneous COVID-19 diagnosis and variant surveillance. CRISPR J. 6 (2), 99-115 (2023).
  8. Patchsung, M., et al. Clinical validation of a Cas13-based assay for the detection of SARS-CoV-2 RNA. Nat Biomed Eng. 4 (12), 1140-1149 (2020).
  9. Gootenberg, J. S., et al. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. Science. 360 (6387), 439-444 (2018).
  10. Lee, R. A., et al. Ultrasensitive CRISPR-based diagnostic for field-applicable detection of Plasmodium species in symptomatic and asymptomatic malaria. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (41), 25722-25731 (2020).
  11. Myhrvold, C., et al. Field-deployable viral diagnostics using CRISPR-Cas13. Science. 360 (6387), 444-448 (2018).
  12. Wu, H., et al. Versatile detection with CRISPR/Cas system from applications to challenges. Trends Analyt Chem. 135, 116150 (2021).
  13. Yao, R., et al. CRISPR-Cas13a-based detection for bovine viral diarrhea virus. Front Vet Sci. 8, 603919 (2021).
  14. Kellner, M. J., Koob, J. G., Gootenberg, J. S., Abudayyeh, O. O., Zhang, F. SHERLOCK: nucleic acid detection with CRISPR nucleases. Nat Protoc. 14 (10), 2986-3012 (2019).
  15. Selvam, K., et al. RT-LAMP CRISPR-Cas12/13-based SARS-CoV-2 detection methods. Diagnostics (Basel). 11 (9), 1646 (2021).
  16. Carter, C., Akrami, K., Hall, D., Smith, D., Aronoff-Spencer, E. Lyophilized visually readable loop-mediated isothermal reverse transcriptase nucleic acid amplification test for detection Ebola Zaire RNA. J Virol Methods. 244, 32-38 (2017).
  17. Bhardwaj, P., Kant, R., Behera, S. P., Dwivedi, G. R., Singh, R. Next-generation diagnostic with CRISPR/Cas: Beyond nucleic acid detection. Int J Mol Sci. 23 (11), 6052 (2022).
  18. Twistamp. . Twistamp® assay design manual. , (2023).
  19. Qian, J., et al. An enhanced isothermal amplification assay for viral detection. Nat Commun. 11 (1), 5920 (2020).
  20. Ghouneimy, A., Mahas, A., Marsic, T., Aman, R., Mahfouz, M. CRISPR-based diagnostics: Challenges and toward point-of-care applications. ACSSynth Biol. 12 (1), 1-16 (2023).
  21. Jones, K. L., Drane, D., Gowans, E. J. Long-term storage of DNA-free RNA for use in vaccine studies. Biotechniques. 43 (5), 675-681 (2007).
  22. Fang, X., et al. Real-time monitoring of strand-displacement DNA amplification by a contactless electrochemical microsystem using interdigitated electrodes. Lab Chip. 12 (17), 3190-3196 (2012).
  23. Mok, E., Wee, E., Wang, Y., Trau, M. Comprehensive evaluation of molecular enhancers of the isothermal exponential amplification reaction. Sci Rep. 6 (1), 37837 (2016).
  24. Wan, J., et al. Development of a test kit for visual loop-mediated isothermal amplification of Salmonella in spiked ready-to-eat fruits and vegetables. J Microbiol Methods. 169, 105830 (2020).
  25. Curti, L. A., et al. Evaluation of a lyophilized CRISPR-Cas12 assay for a ensitive, specific, and rapid detection of SARS-CoV-2. Viruses. 13 (3), 420 (2021).
  26. Joung, J., et al. Detection of SARS-CoV-2 with SHERLOCK one-pot testing. N Engl J Med. 383 (15), 1492-1494 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved