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Method Article
Aqui, apresentamos a preparação passo a passo de amplificação isotérmica baseada em recombinase liofilizada pré-misturada e reações baseadas em Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR), que podem ser usadas para a detecção de biomarcadores de ácido nucleico de patógenos de doenças infecciosas ou outros marcadores genéticos de interesse.
O diagnóstico molecular por detecção baseada em Repetições Palindrômicas Curtas Agrupadas Regularmente Interespaçadas (CRISPR) tem alta precisão diagnóstica e atributos adequados para uso em ambientes de ponto de atendimento, como tempos de resposta rápidos para resultados, leituras simples e convenientes e sem necessidade de instrumentos complicados. No entanto, as reações podem ser complicadas de realizar no ponto de atendimento devido aos seus muitos componentes e etapas de manuseio manual. Aqui, fornecemos um protocolo otimizado passo a passo para a detecção robusta de patógenos de doenças e marcadores genéticos com amplificação isotérmica baseada em recombinase e reagentes baseados em CRISPR, que são pré-misturados e liofilizados em formatos facilmente armazenados e prontos para uso. Reagentes liofilizados pré-misturados podem ser reidratados para uso imediato e manter altas eficiências de amplificação e detecção. Também fornecemos um guia de solução de problemas para problemas comumente encontrados ao preparar e usar reagentes liofilizados pré-misturados para diagnósticos baseados em CRISPR, para tornar a plataforma de detecção mais acessível às comunidades mais amplas de diagnóstico/testes genéticos.
O diagnóstico baseado em CRISPR para a detecção de biomarcadores de ácidos nucleicos foi relatado pela primeira vez em 2017 1,2,3,4 e, desde então, foi comprovado como diagnóstico de última geração com testes aprovados pela Food and Drug Administration (FDA), particularmente para a detecção de RNA do Coronavírus 2 da Síndrome Respiratória Aguda Grave (SARS-CoV-2), em vários países 5,6,7,8. Além da doença do coronavírus 2019 (COVID-19), as tecnologias demonstraram ser eficazes para detectar diversos vírus e bactérias 9,10,11,12,13, mutações e deleções de doenças genéticas e podem ser projetadas para detectar biomarcadores de proteínas e pequenas moléculas 2,12. Os diagnósticos baseados em CRISPR geralmente combinam métodos de amplificação isotérmica - como amplificação da polimerase recombinase (RPA) ou amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP) 14 , 15 - com detecção baseada em CRISPR usando enzimas associadas a CRISPR (Cas) guiadas por RNA com atividade de endonuclease "colateral" após o reconhecimento do alvo3. O uso duplo de amplificação isotérmica e detecção baseada em CRISPR confere vários atributos desejáveis às tecnologias, particularmente alta precisão diagnóstica próxima à da reação em cadeia da polimerase (PCR) padrão-ouro e capacidade de multiplexar e detectar pequenas diferenças de sequência, incluindo polimorfismos de nucleotídeo único 1,9.
As versões mais precisas do diagnóstico baseado em CRISPR, no entanto, contêm vários componentes e etapas e podem ser complicadas de executar com não especialistas ou no ponto de atendimento (POC). Para enfrentar esse desafio de estender o uso de diagnósticos baseados em CRISPR altamente precisos para configurações de POC, desenvolvemos protocolos para preparar amplificação isotérmica baseada em recombinase pré-misturada, liofilizada e reações de detecção baseadas em CRISPR, que são fáceis de usar e armazenar7. Esses protocolos devem complementar os excelentes protocolos existentes sobre diagnósticos baseados em CRISPR14, que contêm informações adicionais sobre a produção de componentes bioquímicos necessários para diagnósticos baseados em CRISPR7, diretrizes de design1 e formulações usando técnicas alternativas de amplificação isotérmica 2,14,15,16 e enzimas Cas12. Em última análise, esperamos que os diagnósticos baseados em CRISPR possam ajudar a realizar a detecção nucleica rápida, barata e sensível em ambientes onde análises portáteis e sem instrumentais são necessárias 1,9,17.
Usamos principalmente a combinação de detecção baseada em RPA e Cas13 em nossos protocolos. O RPA funciona em temperaturas próximas ao ambiente (37-42 °C) e, portanto, tem baixos requisitos de energia e equipamentos. Outras reações de amplificação isotérmica requerem temperaturas mais altas (LAMP, 60-65 °C; amplificação de deslocamento de fita (SDA), 60 °C; reação de amplificação exponencial (EXPAR), 55 °C; e amplificação dependente de helicase (HDA), 65 °C)2. O design dos primers RPA também não é complexo, ao contrário dos primers LAMP, e pode ser estendido para amplificação multiplexada 7,9,14. Embora a multiplexação além de dois alvos com RPA seja difícil na prática, existem diretrizes claras sobre como projetar primers de RPA multiplexados para minimizar a interferência18.
Embora a contaminação por transferência continue sendo um grande problema no fluxo de trabalho de duas etapas, os amplicons gerados de RPA são pequenos em tamanho e menos propensos a causar contaminação por transferência em comparação com grandes amplicons concateméricos do LAMP14. Os primers RPA podem ser projetados de acordo com as diretrizes padrão14: eles geralmente têm 25-35 nucleotídeos de comprimento com temperaturas de fusão de 54 a 67 °C. O tamanho do amplicon deve ser menor que 200 pares de bases. A enzima transcriptase reversa (RT) pode ser adicionada ao RPA para permitir a amplificação do RNA, e na transcrição reversa-RPA (RT-RPA), outra enzima Ribonuclease H (RNase H) é normalmente adicionada em pequenas quantidades para ajudar a resolver o RNA: DNA híbrido resultante e promover a reação de amplificação 5,19. Para permitir a transcrição de T7 para detecção baseada em Cas13, o promotor da RNA polimerase T7 pode ser colocado na extremidade 5' do primer RPA direto.
Depois que os amplicons são gerados a partir do RPA, eles podem ser detectados com enzimas Cas programadas por crRNA. Entre as várias enzimas Cas que podem ser usadas para detecção de amplicon, preferimos variantes Cas13 direcionadas a RNA devido à sua alta atividade de clivagem1 e preferências de clivagem de polinucleotídeos bem caracterizadas 7,9, a última das quais pode ser usada para detecção multiplexada. A sequência de crRNA para Cas13 é projetada para ser complementar (complemento reverso) ao local alvo no RNA produzido com sequências espaçadoras e de repetição direta (DR). A sequência de crRNA e os primers RPA não devem se sobrepor, para evitar a detecção indesejada baseada em Cas de produtos de amplificação fora do alvo, o que aumenta o fundo e os falsos positivos14.
A detecção baseada em Cas depende de diferentes modalidades de detecção para monitorar a clivagem de moléculas de ácido nucleico repórter (repórteres de RNA para reações baseadas em Cas13) 1 , 2 , 14 . Diferentes modalidades de detecção incluem colorimetria, leituras eletroquímicas, fluorescência, leituras de sequenciamento e tiras de fluxo lateral2. Nós nos concentramos na leitura de fluorescência dada uma variedade de fluoróforos e repórteres, como cianina 5 (Cy5), rodamina X (ROX) e carboxifluoresceína (FAM), que podem ser efetivamente excitados usando uma única fonte de luz LED azul, e sua fluorescência analisada por um leitor de microplacas ou um termociclador em tempo real 7,14. Além disso, a leitura de fluorescência é fácil de configurar e permite monitoramento contínuo, o que permite a quantificação em tempo real. A pré-amplificação multiplexada de RPA e a detecção multiplexada baseada em Cas13 usando enzimas Cas podem ser combinadas com leituras de fluorescência multicoloridas para a detecção simultânea de múltiplos alvos genéticos 2,7.
Em nossos protocolos, primeiro amplificamos isotermicamente o RNA com RT-RPA adicionando a amostra de RNA à forma liofilizada do reagente RT-RPA (Figura 1). Durante o RT-RPA, o promotor T7 é adicionado ao amplicon de DNA de fita dupla gerado. Em seguida, os produtos RPA são transferidos para a detecção liofilizada baseada em Cas13, que também contém RNA polimerase T7. Esta reação de detecção converterá amplicons de DNA em RNA (via T7 RNA polimerase), que pode ser prontamente detectada com Cas13 programada por crRNA. O Cas13 ativado por alvo clivaria as moléculas repórter para produzir um sinal de fluorescência detectável 2,7,14. Embora os protocolos aqui pertençam à detecção por Leptotrichia wadei (LwaCas13a), eles podem ser estendidos para detecção simultânea e multiplexada de até quatro alvos usando enzimas ortogonais Cas13 e Cas12 7,9. As reações de detecção baseadas em RPA e Cas também podem ser combinadas em um único tubo, embora com perda de sensibilidade14.
Figura 1: Fluxo de trabalho de detecção baseado em CRISPR. O fluxo de trabalho ilustra a detecção de dois genes-alvo. Primeiro, as regiões de interesse dentro do alvo de DNA são amplificadas isotermicamente com RPA; a reação pode ser realizada com transcrição reversa (RT-RPA) ao detectar alvos de RNA. Depois disso, a transcrição T7 converte amplicons de dsDNA em RNAs, que por sua vez são reconhecidos por complexos Cas13-crRNA capazes de provocar atividade colateral de RNase após a ligação ao alvo. A clivagem de repórteres de fluorescência temperada produz sinais de fluorescência que podem ser monitorados usando um leitor de microplacas, visualizados por um transiluminador de LED ou usados com um termociclador em tempo real. Abreviaturas: CRISPR = repetições palindrômicas curtas agrupadas regularmente interespaçadas; TR = transcrição reversa; RPA = amplificação da polimerase recombinase; Cas = proteína associada a CRISPR; LED = diodo emissor de luz. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
As principais características dos protocolos apresentados aqui são as formulações de pré-mistura para liofilização. A pré-mistura simplifica o uso da reação e aumenta a reprodutibilidade, mas muitos componentes dentro da detecção baseada em RPA e Cas - particularmente a transcrição reversa e alguns cofatores lábeis, como o ATP, não são estáveis em solução. Portanto, formulamos as soluções pré-misturadas de forma que possam ser liofilizadas para armazenamento de longo prazo e fácil transporte e implantação 1,9,20. Reagentes liofilizados pré-misturados também ajudam a melhorar a sensibilidade de detecção, pois maior volume de amostra (e, portanto, maior entrada de DNA / RNA) pode ser adicionado para reconstituir a reação10. Em nossas formulações, usamos principalmente trealose21 como crioprotetor em reações de detecção liofilizadas de RPA e Cas7. Além da preservação do reagente, a trealose também promove as reações por meio do aumento da estabilização enzimática 16,22,23,24 e da diminuição das temperaturas de fusão do dsDNA 23. Explorações de outros estabilizadores 5,7,21,25,26 além da trealose podem produzir formulações ainda mais ideais para diferentes cenários de uso.
1. Preparação de reagentes pré-misturados RT-RPA liofilizados
2. Preparação de reagentes de detecção pré-misturados CRISPR-Cas13a liofilizados
NOTA: Siga a etapa 1.1 para a preparação do equipamento.
3. Amplificação de ácido nucleico RT-RPA
NOTA: Para evitar contaminação cruzada, as áreas do local de trabalho e os pipetadores devem ser separados para pré-amplificação, adição de amostra e pós-amplificação. Recomendamos o uso de ponteiras de pipeta filtradas.
4. Detecção de ácido nucleico CRISPR-Cas13
Destacamos a cinética da geração do sinal de fluorescência FAM a partir da detecção combinada dos genes s e n do SARS-CoV-2 e como as informações foram usadas para determinar as condições ideais para formulações de reação pré-misturadas liofilizadas. Em todos os casos, incluímos amostras com valores de Ct bem dentro do limite de detecção determinado (LoD) (Ct ~ 31-33), bem como aquelas com Ct no LoD (Ct ~ 35-...
Existem etapas críticas neste protocolo. Para segregação de área, recomenda-se o uso de espaços separados para extração de ácido nucleico, preparação de mastermix (área de pré-amplificação), adição de amostra e detecção de amplicon (área de pós-amplificação). Cada área deve ser definida usando um conjunto separado de ferramentas e equipamentos. Não traga ferramentas de uma área para outra área, especialmente da área de pós-amplificação para a área de pré-a...
M.P. e C.U. registraram uma patente na Tailândia sobre as formulações para detecção multiplexada de RNA SARS-CoV-2. R.K. declara não haver interesses conflitantes.
A reconhece o financiamento do Siam Commercial Bank no âmbito do VISTEC-Siriraj Frontier Research Center e do Thailand Science Research and Innovation (TSRI), fundo fundamental, ano fiscal de 2024, número de concessão FRB670026/0457. RK e MP são apoiados por fundos de bolsa de estudos e assistência de pesquisa da VISTEC, respectivamente.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Material | |||
Betaine solution | Sigma-Aldrich | B0300-1VL | |
DEPC-Treated water | Invitrogen | AM9915G | |
Dithiothreitol (DTT) | Merck | 3870-25GM | |
EpiScript reverse transcriptase | Lucigen | ERT12925K | |
Gly-Gly-Gly | Sigma-Aldrich | SIA-50239-1G | |
LwaCas13a | Producing in-house | Strain name:Leptotrichia wadei, Abbreviation: Lwa, Protein name: LwaCas13a | |
Magnesium chloride solution, 1M | Sigma-Aldrich | M1028-10X1ML | |
NxGenT7 RNA polymerase | Lucigen | 30223-2 | |
Poly(ethylene glycol) | Sigma-Aldrich | 81300-1KG | |
Potassium acetate solution, 5M | Sigma-Aldrich | 95843-100ML-F | |
Riobnucleotide Solution Mix | NEB | N0466L | |
RNase H | NEB | M0297L | |
Sucrose | TCI | TCI-S0111-500G | |
Trehalose Dihydrate | Sigma-Aldrich | SIA-90210-50G | |
Trizma hydrochloride solution, 1M, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T2194-100ML | |
TwistAmp Basic kit | TwistDx | TABAS03KIT | |
Equipment | |||
BluPAD Dual LED Blue/White light transilluminator | Bio-Helix | BP001CU | |
Dry Bath Dual Block | ELITE | 4-2-EL-02-220 | Model: EL-02 |
Fluorescence microplate reader | Tecan | 30050303 | Model: Infinite 200 Pro |
Freeze dryer | LABCONCO | 794001030 | FreeZone Triad Benchtop Freeze Dryer |
Microplate 384-well | Greiner | GDE0784076 | F-Bottom, small volume, Hibase, Med. Binding, Black |
Real-time thermal cycler (CFX Connect Real-Time PCR System) | Bio-Rad | 185-5201 | Model: CFX Connect Optics Module |
Oligonucleotide | |||
s-gene forward RPA primer | IDT | GAAATTAATACGACTCAC TATAGGGAGGTTTCAAAC TTTACTTGCTTTACATAGA | |
s-gene reverse RPA primer | IDT | TCCTAGGTTGAAGA TAACCCACATAATAAG | |
n-gene forward RPA primer | IDT | GAAATTAATACGACTC ACTATAGGAACTTCTC CTGCTAGAATGGCTG | |
n-gene reverse RPA primer | IDT | CAGACATTTTGCTCTC AAGCTGGTTCAATC | |
LwaCas13a-crRNA for the s gene | Synthego | GAUUUAGACUACCCCAAAAAC GAAGGGGACUAAAACGCAGCA CCAGCUGUCCAACCUGAAGAAG | |
LwaCas13a-crRNA for the n gene | Synthego | GAUUUAGACUACCCCAAAAACG AAGGGGACUAAAACAAAGCAAG AGCAGCAUCACCGCCAUUGC | |
FAM-polyU-IABkFQ reporter | IDT | 56-FAM/rUrUrUrUrU/3IABkFQ | |
O-hannah_cytb_F RPA primer | IDT | GAAATTAATACGACTCACTA TAGGGTACGGATGAACCATA CAAAACCTTCACGCAATCG | |
O-hannah_cytb_R RPA primer | IDT | AAGATCCATAGTAGATTC CTCGTGCGATGTGGATA | |
synT7crRNA13a_ O_hannah | IDT | GCGCATCCATATTCTTCAT CTGCATTTAGTTTTAGTCC CCTTCGTTTTTGGGGTA GTCTAAATCCCCTATAGT GAGTCGTATTAATTTC |
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