Diagnóstico baseado em CRISPR no local de atendimento com reagentes pré-misturados e liofilizados

Resumo

Aqui, apresentamos a preparação passo a passo de amplificação isotérmica baseada em recombinase liofilizada pré-misturada e reações baseadas em Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR), que podem ser usadas para a detecção de biomarcadores de ácido nucleico de patógenos de doenças infecciosas ou outros marcadores genéticos de interesse.

Resumo

O diagnóstico molecular por detecção baseada em Repetições Palindrômicas Curtas Agrupadas Regularmente Interespaçadas (CRISPR) tem alta precisão diagnóstica e atributos adequados para uso em ambientes de ponto de atendimento, como tempos de resposta rápidos para resultados, leituras simples e convenientes e sem necessidade de instrumentos complicados. No entanto, as reações podem ser complicadas de realizar no ponto de atendimento devido aos seus muitos componentes e etapas de manuseio manual. Aqui, fornecemos um protocolo otimizado passo a passo para a detecção robusta de patógenos de doenças e marcadores genéticos com amplificação isotérmica baseada em recombinase e reagentes baseados em CRISPR, que são pré-misturados e liofilizados em formatos facilmente armazenados e prontos para uso. Reagentes liofilizados pré-misturados podem ser reidratados para uso imediato e manter altas eficiências de amplificação e detecção. Também fornecemos um guia de solução de problemas para problemas comumente encontrados ao preparar e usar reagentes liofilizados pré-misturados para diagnósticos baseados em CRISPR, para tornar a plataforma de detecção mais acessível às comunidades mais amplas de diagnóstico/testes genéticos.

Introdução

O diagnóstico baseado em CRISPR para a detecção de biomarcadores de ácidos nucleicos foi relatado pela primeira vez em 2017 1,2,3,4 e, desde então, foi comprovado como diagnóstico de última geração com testes aprovados pela Food and Drug Administration (FDA), particularmente para a detecção de RNA do Coronavírus 2 da Síndrome Respiratória Aguda Grave (SARS-CoV-2), em vários países ^5,6,7,8. Além da doença do coronavírus 2019 (COVID-19), as tecnologias demonstraram ser eficazes para detectar diversos vírus e bactérias 9,10,11,12,13, mutações e deleções de doenças genéticas e podem ser projetadas para detectar biomarcadores de proteínas e pequenas moléculas ^2,12. Os diagnósticos baseados em CRISPR geralmente combinam métodos de amplificação isotérmica - como amplificação da polimerase recombinase (RPA) ou amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP) ^{14 , 15} - com detecção baseada em CRISPR usando enzimas associadas a CRISPR (Cas) guiadas por RNA com atividade de endonuclease "colateral" após o reconhecimento do alvo³. O uso duplo de amplificação isotérmica e detecção baseada em CRISPR confere vários atributos desejáveis às tecnologias, particularmente alta precisão diagnóstica próxima à da reação em cadeia da polimerase (PCR) padrão-ouro e capacidade de multiplexar e detectar pequenas diferenças de sequência, incluindo polimorfismos de nucleotídeo único ^1,9.

As versões mais precisas do diagnóstico baseado em CRISPR, no entanto, contêm vários componentes e etapas e podem ser complicadas de executar com não especialistas ou no ponto de atendimento (POC). Para enfrentar esse desafio de estender o uso de diagnósticos baseados em CRISPR altamente precisos para configurações de POC, desenvolvemos protocolos para preparar amplificação isotérmica baseada em recombinase pré-misturada, liofilizada e reações de detecção baseadas em CRISPR, que são fáceis de usar e armazenar⁷. Esses protocolos devem complementar os excelentes protocolos existentes sobre diagnósticos baseados em CRISPR¹⁴, que contêm informações adicionais sobre a produção de componentes bioquímicos necessários para diagnósticos baseados em CRISPR⁷, diretrizes de design¹ e formulações usando técnicas alternativas de amplificação isotérmica ^2,14,15,16 e enzimas Cas¹². Em última análise, esperamos que os diagnósticos baseados em CRISPR possam ajudar a realizar a detecção nucleica rápida, barata e sensível em ambientes onde análises portáteis e sem instrumentais são necessárias ^1,9,17.

Usamos principalmente a combinação de detecção baseada em RPA e Cas13 em nossos protocolos. O RPA funciona em temperaturas próximas ao ambiente (37-42 °C) e, portanto, tem baixos requisitos de energia e equipamentos. Outras reações de amplificação isotérmica requerem temperaturas mais altas (LAMP, 60-65 °C; amplificação de deslocamento de fita (SDA), 60 °C; reação de amplificação exponencial (EXPAR), 55 °C; e amplificação dependente de helicase (HDA), 65 °C)². O design dos primers RPA também não é complexo, ao contrário dos primers LAMP, e pode ser estendido para amplificação multiplexada ^7,9,14. Embora a multiplexação além de dois alvos com RPA seja difícil na prática, existem diretrizes claras sobre como projetar primers de RPA multiplexados para minimizar a interferência¹⁸.

Embora a contaminação por transferência continue sendo um grande problema no fluxo de trabalho de duas etapas, os amplicons gerados de RPA são pequenos em tamanho e menos propensos a causar contaminação por transferência em comparação com grandes amplicons concateméricos do LAMP¹⁴. Os primers RPA podem ser projetados de acordo com as diretrizes padrão¹⁴: eles geralmente têm 25-35 nucleotídeos de comprimento com temperaturas de fusão de 54 a 67 °C. O tamanho do amplicon deve ser menor que 200 pares de bases. A enzima transcriptase reversa (RT) pode ser adicionada ao RPA para permitir a amplificação do RNA, e na transcrição reversa-RPA (RT-RPA), outra enzima Ribonuclease H (RNase H) é normalmente adicionada em pequenas quantidades para ajudar a resolver o RNA: DNA híbrido resultante e promover a reação de amplificação ^5,19. Para permitir a transcrição de T7 para detecção baseada em Cas13, o promotor da RNA polimerase T7 pode ser colocado na extremidade 5' do primer RPA direto.

Depois que os amplicons são gerados a partir do RPA, eles podem ser detectados com enzimas Cas programadas por crRNA. Entre as várias enzimas Cas que podem ser usadas para detecção de amplicon, preferimos variantes Cas13 direcionadas a RNA devido à sua alta atividade de clivagem¹ e preferências de clivagem de polinucleotídeos bem caracterizadas ^7,9, a última das quais pode ser usada para detecção multiplexada. A sequência de crRNA para Cas13 é projetada para ser complementar (complemento reverso) ao local alvo no RNA produzido com sequências espaçadoras e de repetição direta (DR). A sequência de crRNA e os primers RPA não devem se sobrepor, para evitar a detecção indesejada baseada em Cas de produtos de amplificação fora do alvo, o que aumenta o fundo e os falsos positivos¹⁴.

A detecção baseada em Cas depende de diferentes modalidades de detecção para monitorar a clivagem de moléculas de ácido nucleico repórter (repórteres de RNA para reações baseadas em Cas13) ^{1 , 2 , 14} . Diferentes modalidades de detecção incluem colorimetria, leituras eletroquímicas, fluorescência, leituras de sequenciamento e tiras de fluxo lateral². Nós nos concentramos na leitura de fluorescência dada uma variedade de fluoróforos e repórteres, como cianina 5 (Cy5), rodamina X (ROX) e carboxifluoresceína (FAM), que podem ser efetivamente excitados usando uma única fonte de luz LED azul, e sua fluorescência analisada por um leitor de microplacas ou um termociclador em tempo real ^7,14. Além disso, a leitura de fluorescência é fácil de configurar e permite monitoramento contínuo, o que permite a quantificação em tempo real. A pré-amplificação multiplexada de RPA e a detecção multiplexada baseada em Cas13 usando enzimas Cas podem ser combinadas com leituras de fluorescência multicoloridas para a detecção simultânea de múltiplos alvos genéticos ^2,7.

Em nossos protocolos, primeiro amplificamos isotermicamente o RNA com RT-RPA adicionando a amostra de RNA à forma liofilizada do reagente RT-RPA (Figura 1). Durante o RT-RPA, o promotor T7 é adicionado ao amplicon de DNA de fita dupla gerado. Em seguida, os produtos RPA são transferidos para a detecção liofilizada baseada em Cas13, que também contém RNA polimerase T7. Esta reação de detecção converterá amplicons de DNA em RNA (via T7 RNA polimerase), que pode ser prontamente detectada com Cas13 programada por crRNA. O Cas13 ativado por alvo clivaria as moléculas repórter para produzir um sinal de fluorescência detectável ^2,7,14. Embora os protocolos aqui pertençam à detecção por Leptotrichia wadei (LwaCas13a), eles podem ser estendidos para detecção simultânea e multiplexada de até quatro alvos usando enzimas ortogonais Cas13 e Cas12 ^7,9. As reações de detecção baseadas em RPA e Cas também podem ser combinadas em um único tubo, embora com perda de sensibilidade¹⁴.

Figura 1: Fluxo de trabalho de detecção baseado em CRISPR. O fluxo de trabalho ilustra a detecção de dois genes-alvo. Primeiro, as regiões de interesse dentro do alvo de DNA são amplificadas isotermicamente com RPA; a reação pode ser realizada com transcrição reversa (RT-RPA) ao detectar alvos de RNA. Depois disso, a transcrição T7 converte amplicons de dsDNA em RNAs, que por sua vez são reconhecidos por complexos Cas13-crRNA capazes de provocar atividade colateral de RNase após a ligação ao alvo. A clivagem de repórteres de fluorescência temperada produz sinais de fluorescência que podem ser monitorados usando um leitor de microplacas, visualizados por um transiluminador de LED ou usados com um termociclador em tempo real. Abreviaturas: CRISPR = repetições palindrômicas curtas agrupadas regularmente interespaçadas; TR = transcrição reversa; RPA = amplificação da polimerase recombinase; Cas = proteína associada a CRISPR; LED = diodo emissor de luz. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

As principais características dos protocolos apresentados aqui são as formulações de pré-mistura para liofilização. A pré-mistura simplifica o uso da reação e aumenta a reprodutibilidade, mas muitos componentes dentro da detecção baseada em RPA e Cas - particularmente a transcrição reversa e alguns cofatores lábeis, como o ATP, não são estáveis em solução. Portanto, formulamos as soluções pré-misturadas de forma que possam ser liofilizadas para armazenamento de longo prazo e fácil transporte e implantação ^1,9,20. Reagentes liofilizados pré-misturados também ajudam a melhorar a sensibilidade de detecção, pois maior volume de amostra (e, portanto, maior entrada de DNA / RNA) pode ser adicionado para reconstituir a reação¹⁰. Em nossas formulações, usamos principalmente trealose²¹ como crioprotetor em reações de detecção liofilizadas de RPA e Cas⁷. Além da preservação do reagente, a trealose também promove as reações por meio do aumento da estabilização enzimática 16,22,23,24 e da diminuição das temperaturas de fusão do dsDNA 23. Explorações de outros estabilizadores 5,7,21,25,26 além da trealose podem produzir formulações ainda mais ideais para diferentes cenários de uso.

Protocolo

1. Preparação de reagentes pré-misturados RT-RPA liofilizados

1. Preparação do equipamento
   1. Prepare um dewar ou bandeja de nitrogênio líquido para congelamento rápido de reações. Encha o dewar ou a bandeja com nitrogênio líquido.
   2. Liofilizador
      1. Verifique se há água condensada nos tubos de drenagem e no interior da câmara; Remova a água, se necessário.
      2. Limpe o interior da câmara e o rack de metal do tubo de microcentrífuga de 1,5 mL com solução de descontaminação RNase, seguida de etanol a 70%.
      3. Feche a porta da câmara e a válvula de liberação de vácuo.
      4. Ligue o liofilizador.
      5. Defina manualmente a temperatura da prateleira para -30 °C.
   3. Equipamento de biologia molecular
      1. Limpe o seguinte com a solução de descontaminação RNase: pipetas, racks de ponteira de pipeta, um misturador de vórtice, uma minicentrífuga spin-down e um marcador permanente.
      2. Limpe o seguinte com água da torneira e, em seguida, limpe com papel de limpeza: racks de plástico para tubos de microcentrífuga e uma caixa de espuma para gelo.
      3. Prepare um bloco de aquecimento (usado para dissolver/resolubilizar a solução de triglicina) limpando-o com solução de descontaminação RNase e etanol a 70%. Em seguida, ligue-o e ajuste a temperatura para 60 °C.
2. Preparação de reações de RPA pré-misturadas
   NOTA: Esta formulação é para 10 reações (usando três pastilhas de RPA).
   1. Verifique se há algum precipitado na solução de triglicina antes de usar. Se houver precipitados, dissolva-os incubando a 60 °C e misturando bem antes de usar. Resfrie a solução de triglicina antes de adicionar outros reagentes sensíveis ao calor.
      NOTA: Os precipitados podem se formar facilmente se o tubo for deixado em temperatura ambiente por um período prolongado.
   2. Remova três tubos de tiras de pellets RPA do freezer; Bata nos tubos de tira batendo-os suavemente contra a bancada do laboratório para desalojar os pellets brancos.
   3. Transfira todos os três pellets para um tubo de microcentrífuga A de 1,5 mL.
   4. Pipete 25 μL de água sem nuclease para enxaguar qualquer pó de RPA restante nos tubos de tira e transfira a solução de enxágue para um novo tubo de microcentrífuga B de 1,5 mL.
   5. Adicione 10 μL da solução de triglicina 0,57 M e 10 μL de mistura de primer (10 μM cada) ao tubo master mix B.
   6. Tubo de mistura de vórtice B; Em seguida, gire para baixo e coloque o tubo no gelo.
   7. Adicione 28,4 μL do tampão RPA 5x (preparado a partir de 500 μL de 50% (p/v) PEG20000, 250 μL de 1 M Tris pH 7,4 e 100 μL de ditiotreitol (DTT) 100 mM ao tubo mastermix B e misture bem batendo forte ou agitando várias vezes.
      NOTA: Fazemos a solução desta maneira para ajudar a diluir/diminuir a viscosidade do PEG no tubo mastermix, antes de adicionar tudo para solubilizar os pellets de RPA.
   8. Transfira os pellets coletados no tubo A da Etapa 1.2.3 para o tubo mastermix B e, em seguida, inverta o tubo mastermix várias vezes para misturar. Observe se a solução parece homogênea e monofásica (também parecerá ligeiramente opaca) e, em seguida, coloque o tubo no gelo.
      NOTA: Se a mistura não for completa, o PEG pode fazer com que a solução/suspensão se separe em fases.
   9. Adicione 0,71 μL de 200 unidades/μL RT e 2,84 μL de 5 unidades/μL RNase H ao tubo mastermix. Bata suavemente ou inverta o tubo mastermix para cima e para baixo várias vezes. Gire para baixo e coloque o tubo no gelo.
      NOTA: Adicionamos essas enzimas após mistura pesada de etapas anteriores, uma vez que RT e RNase H são sensíveis ao cisalhamento devido à mistura; não há mais vórtice após a adição de RT / RNase H.
   10. Alicote 8,4 μL da solução mastermix para 10 tubos pré-resfriados de 1,5 mL e coloque os tubos no gelo. Para fazer isso, mergulhe a ponta da pipeta na solução mastermix e puxe a solução mastermix para a ponta lenta e continuamente para evitar a formação de bolhas de ar e garantir uma medição precisa do volume. Dispense a solução mastermix em um tubo pré-resfriado de 1,5 ml.
       NOTA: Com 8,4 μL alíquotas, em nossa experiência, haverá ~ 1-2 μL de suspensão restante no tubo mastermix. O experimentador pode ajustar ligeiramente o volume de alíquota para baixo para garantir reagentes suficientes para todas as 10 reações. Use técnicas de pipetagem adequadas ao manusear soluções viscosas.
   11. Após a conclusão da alíquota, coloque os tubos em uma prateleira de metal submersa em nitrogênio líquido para prepará-los para a liofilização. Deixe os tubos submergirem em nitrogênio líquido por 5 min.
       NOTA: Como a liofilização remove o excesso de solução, ela nos permite adicionar mais entrada de DNA / RNA, o que ajuda a aumentar a sensibilidade. As reações RPA pré-misturadas liofilizadas podem ser armazenadas a -20 °C por 8 meses. A liofilização ajuda na reprodutibilidade se um determinado experimento for realizado usando mastermixes RPA preparados no mesmo lote, portanto, fazer um lote maior também ajuda.
3. Liofilização
   1. No liofilizador, verifique as temperaturas do coletor e da prateleira. Se necessário, aguarde até que a temperatura do coletor atinja -75 ± 5 °C e a temperatura da prateleira atinja -30 ± 1 °C.
   2. Cubra os tubos abertos no rack de metal com uma folha de papel de limpeza, coloque o rack de metal junto com os tubos abertos na prateleira do liofilizador e feche a porta da prateleira.
   3. Selecione o programa mostrado na Tabela 1 e pressione iniciar. Após 30 min da etapa de secagem secundária (20 °C, <0.1 mbar; a temperatura é mantida infinitamente definindo o tempo da etapa para "infinito"), pressione parar o programa.
      NOTA: Deixamos os tubos aquecerem no liofilizador para evitar a condensação de água.
   4. Libere a pressão abrindo a válvula de liberação de vácuo e, em seguida, remova o rack da prateleira. Tampe os tubos imediatamente e armazene as reações liofilizadas a -20 °C.
      NOTA: As reações pré-misturadas liofilizadas de RPA e CRISPR-Cas13a podem ser armazenadas a -20 °C por 8 meses.

2. Preparação de reagentes de detecção pré-misturados CRISPR-Cas13a liofilizados

NOTA: Siga a etapa 1.1 para a preparação do equipamento.

1. Preparação de reação pré-misturada CRISPR-Cas13a (10 reações)
   1. Remova os seguintes itens do armazenamento e coloque-os no gelo: 10 μL de LwaCas13a (produzido internamente ^7,8,14) (2 mg / mL), tampão de armazenamento Cas, 10 ng / μL (225 nM) crRNA, 25 mM rNTP, 50 Unidade / μL T7 RNA polimerase, 2 μM de repórter de fluorescência FAM.
   2. Prepare uma solução de trabalho de LwaCas13a a 126 μg / mL (900 nM) adicionando 148,8 μL de tampão de armazenamento de Cas (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 0,6 M NaCl, 5% de glicerol, 2 mM DTT) a 10 μL de 2 mg / mL de LwaCas13a.
   3. Prepare a reação mastermix CRISPR-Cas13a da seguinte forma: 71 μL de água livre de RNase, 20 μL de 400 mM Tris pH 7,4, 20 μL de trealose a 60% (p/v), 10 μL de 10 ng/μL (225 nM) crRNA (aqui, visando os genes s e n do SARS-CoV-2), 8 μL de mistura rNTP 100 mM (25 mM cada), 6 μL de 50 unidades/μL T7 RNA polimerase, 25 μL de 2 μM de repórter de fluorescência FAM e 10 μL de 126 μg/mL (900 nM) LwaCas13a. Misture bem invertendo o tubo mastermix; Então, gire para baixo.
   4. Alíquota de 17 μL do mastermix em 10 tubos de 1,5 mL colocados no gelo. Coloque os tubos em uma prateleira submersa em nitrogênio líquido e deixe os tubos submersos em nitrogênio líquido por 5 min.
2. Liofilização
   1. No liofilizador, verifique as temperaturas do coletor e da prateleira e espere até que a temperatura do coletor atinja -75 ± 5 °C e a temperatura da prateleira atinja -30 ± 1 °C.
   2. Coloque os tubos no liofilizador. Selecione o programa mostrado na Tabela 1 e pressione iniciar. Após 30 min da etapa de secagem secundária (25 °C, <0.1 mbar; a temperatura é mantida infinitamente ajustando o tempo da etapa para "infinito"), pare o programa.
   3. Libere a pressão abrindo a válvula de liberação de vácuo e remova o rack da prateleira. Tampe os tubos imediatamente e armazene as reações liofilizadas a -20 °C.
      NOTA: Os reagentes pré-misturados liofilizados de RPA e CRISPR-Cas13a podem ser armazenados a -20 °C por 8 meses.

3. Amplificação de ácido nucleico RT-RPA

NOTA: Para evitar contaminação cruzada, as áreas do local de trabalho e os pipetadores devem ser separados para pré-amplificação, adição de amostra e pós-amplificação. Recomendamos o uso de ponteiras de pipeta filtradas.

1. Pré-aqueça uma incubadora de agitação térmica a 42 °C.
2. Adicione 1 μL de mistura de solução de acetato de magnésio (Mg (OAc) ₂) e acetato de potássio (KOAc) (composta de 196 mM Mg (OAc) ₂ e 1,5 M KOAc) na lateral do tubo que contém o pellet RT-RPA liofilizado e pré-misturado (da seção 1).
   NOTA: Um truque para adicionar a mistura de Mg(OAc)₂ e KOAc: a gota deve ser colocada em torno da marca de volume de 1 mL do tubo. Aqui, a queda será claramente visível e provavelmente não será perdida com o fechamento do tubo ou outras ações. A amplificação começará depois de girar para baixo para coletar a gota no fundo do tubo. Ao processar mais de uma reação por vez, a amplificação pode ser iniciada simultaneamente.
3. Ressuspenda o pellet RT-RPA adicionando 12,4 μL da amostra de RNA (ou das amostras de controle).
   NOTA: A sequência de adição é amostra negativa/controle negativo, RNA/DNA a ser testado, amostra positiva/controle positivo.
4. Para iniciar a reação RT-RPA, gire brevemente a solução adicionada das etapas 3.2 e 3.3 usando uma minicentrífuga de rotação à temperatura ambiente por 3 s.
5. Misture batendo cuidadosamente no tubo e, em seguida, faça outro breve centrifugação por 3 s.
6. Incubar a reação a 42 °C durante 60 minutos, colocando-a num bloco de aquecimento pré-aquecido ou numa incubadora de agitação térmica.
7. Após o término da reação, retire os tubos de reação e coloque-os no gelo antes de prosseguir para a etapa de detecção CRISPR-Cas (seção 4).
   NOTA: O produto amplificado por RPA pode ser usado na reação de detecção imediatamente ou pode ser armazenado a 4 °C por vários dias ou a -20 °C por vários meses.

4. Detecção de ácido nucleico CRISPR-Cas13

1. Ligue um leitor de microplacas de fluorescência, defina e pré-aqueça a temperatura de aquecimento para 37 °C e selecione o programa mostrado na Tabela 2.
2. Coloque uma placa de 384 poços no gelo.
3. Ressuspenda a reação de detecção pré-misturada CRISPR-Cas liofilizada (da seção 2) adicionando 17 μL de solução de cloreto de magnésio 8 mM. Misture batendo cuidadosamente no tubo; Em seguida, gire brevemente para baixo por 3 s e coloque o tubo no gelo.
4. Transfira 18 μL da mistura de reação ressuspensa para cada poço da placa pré-resfriada de 384 poços em gelo.
5. Adicionar 2 μL do produto RPA preparado no ponto 3 a cada poço de reação.
6. Remova a placa do gelo, coloque-a rapidamente em um leitor de microplacas de fluorescência pré-aquecido e pressione iniciar.
   NOTA: Uma placa de 384 poços foi colocada no gelo para permitir a sincronização do início da reação quando a placa de 384 poços é transferida para um leitor de microplacas de fluorescência pré-aquecido.

Resultados

Destacamos a cinética da geração do sinal de fluorescência FAM a partir da detecção combinada dos genes s e n do SARS-CoV-2 e como as informações foram usadas para determinar as condições ideais para formulações de reação pré-misturadas liofilizadas. Em todos os casos, incluímos amostras com valores de C_t bem dentro do limite de detecção determinado (LoD) (C_t ~ 31-33), bem como aquelas com C_t no LoD (C_t ~ 35-...

Discussão

Existem etapas críticas neste protocolo. Para segregação de área, recomenda-se o uso de espaços separados para extração de ácido nucleico, preparação de mastermix (área de pré-amplificação), adição de amostra e detecção de amplicon (área de pós-amplificação). Cada área deve ser definida usando um conjunto separado de ferramentas e equipamentos. Não traga ferramentas de uma área para outra área, especialmente da área de pós-amplificação para a área de pré-a...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material
Betaine solution	Sigma-Aldrich	B0300-1VL
DEPC-Treated water	Invitrogen	AM9915G
Dithiothreitol (DTT)	Merck	3870-25GM
EpiScript reverse transcriptase	Lucigen	ERT12925K
Gly-Gly-Gly	Sigma-Aldrich	SIA-50239-1G
LwaCas13a	Producing in-house		Strain name:Leptotrichia wadei, Abbreviation: Lwa, Protein name: LwaCas13a
Magnesium chloride solution, 1M	Sigma-Aldrich	M1028-10X1ML
NxGenT7 RNA polymerase	Lucigen	30223-2
Poly(ethylene glycol)	Sigma-Aldrich	81300-1KG
Potassium acetate solution, 5M	Sigma-Aldrich	95843-100ML-F
Riobnucleotide Solution Mix	NEB	N0466L
RNase H	NEB	M0297L
Sucrose	TCI	TCI-S0111-500G
Trehalose Dihydrate	Sigma-Aldrich	SIA-90210-50G
Trizma hydrochloride solution, 1M, pH 7.4	Sigma-Aldrich	T2194-100ML
TwistAmp Basic kit	TwistDx	TABAS03KIT
Equipment
BluPAD Dual LED Blue/White light transilluminator	Bio-Helix	BP001CU
Dry Bath Dual Block	ELITE	4-2-EL-02-220	Model: EL-02
Fluorescence microplate reader	Tecan	30050303	Model: Infinite 200 Pro
Freeze dryer	LABCONCO	794001030	FreeZone Triad Benchtop Freeze Dryer
Microplate 384-well	Greiner	GDE0784076	F-Bottom, small volume, Hibase, Med. Binding, Black
Real-time thermal cycler (CFX Connect Real-Time PCR System)	Bio-Rad	185-5201	Model: CFX Connect Optics Module
Oligonucleotide
s-gene forward RPA primer	IDT		GAAATTAATACGACTCAC TATAGGGAGGTTTCAAAC TTTACTTGCTTTACATAGA
s-gene reverse RPA primer	IDT		TCCTAGGTTGAAGA TAACCCACATAATAAG
n-gene forward RPA primer	IDT		GAAATTAATACGACTC ACTATAGGAACTTCTC CTGCTAGAATGGCTG
n-gene reverse RPA primer	IDT		CAGACATTTTGCTCTC AAGCTGGTTCAATC
LwaCas13a-crRNA for the s gene	Synthego		GAUUUAGACUACCCCAAAAAC GAAGGGGACUAAAACGCAGCA CCAGCUGUCCAACCUGAAGAAG
LwaCas13a-crRNA for the n gene	Synthego		GAUUUAGACUACCCCAAAAACG AAGGGGACUAAAACAAAGCAAG AGCAGCAUCACCGCCAUUGC
FAM-polyU-IABkFQ reporter	IDT		56-FAM/rUrUrUrUrU/3IABkFQ
O-hannah_cytb_F RPA primer	IDT		GAAATTAATACGACTCACTA TAGGGTACGGATGAACCATA CAAAACCTTCACGCAATCG
O-hannah_cytb_R RPA primer	IDT		AAGATCCATAGTAGATTC CTCGTGCGATGTGGATA
synT7crRNA13a_ O_hannah	IDT		GCGCATCCATATTCTTCAT CTGCATTTAGTTTTAGTCC CCTTCGTTTTTGGGGTA GTCTAAATCCCCTATAGT GAGTCGTATTAATTTC