Point-of-Care CRISPR-basierte Diagnostik mit vorgemischten und gefriergetrockneten Reagenzien

Zusammenfassung

Hier stellen wir die Schritt-für-Schritt-Vorbereitung von vorgemischten, lyophilisierten rekombinasebasierten isothermen Amplifikationen und Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-basierten Reaktionen vor, die für den Nachweis von Nukleinsäure-Biomarkern von Krankheitserregern oder anderen genetischen Markern von Interesse verwendet werden können.

Zusammenfassung

Die molekulare Diagnostik durch CRISPR-basierte Detektion (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) weist eine hohe diagnostische Genauigkeit und Eigenschaften auf, die für den Einsatz in Point-of-Care-Umgebungen geeignet sind, wie z. B. schnelle Durchlaufzeiten für Ergebnisse, bequeme, einfache Auslesungen und keine komplizierten Instrumente. Die Reaktionen können jedoch aufgrund ihrer vielen Komponenten und manuellen Handhabungsschritte am Point-of-Care umständlich durchzuführen sein. Darin bieten wir ein schrittweises, optimiertes Protokoll für den robusten Nachweis von Krankheitserregern und genetischen Markern mit rekombinasebasierter isothermer Amplifikation und CRISPR-basierten Reagenzien, die vorgemischt und dann in leicht zu lagernden und gebrauchsfertigen Formaten gefriergetrocknet werden. Vorgemischte, gefriergetrocknete Reagenzien können für den sofortigen Einsatz rehydriert werden und behalten eine hohe Amplifikations- und Nachweiseffizienz bei. Wir bieten auch einen Leitfaden zur Fehlerbehebung für häufig auftretende Probleme bei der Vorbereitung und Verwendung von vorgemischten, gefriergetrockneten Reagenzien für die CRISPR-basierte Diagnostik, um die Nachweisplattform für die breitere Diagnostik-/Gentest-Community zugänglicher zu machen.

Einleitung

CRISPR-basierte Diagnostika zum Nachweis von Nukleinsäure-Biomarkern wurden erstmals im Jahr 2017 berichtet 1,2,3,4 und haben sich seitdem in mehreren Ländern in mehreren Ländern als Diagnostika der nächsten Generation mit von der Food and Drug Administration (FDA) zugelassenen Tests bewährt, insbesondere für den Nachweis von RNA des schweren akuten respiratorischen Syndroms Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) 5,6,7,8 . Über die Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19) hinaus haben sich die Technologien als wirksam für den Nachweis verschiedener Viren und Bakterien 9,10,11,12,13, genetischer Krankheitsmutationen und Deletionen erwiesen und können zum Nachweis von Protein- und niedermolekularen Biomarkern entwickelt werden ^2,12. CRISPR-basierte Diagnostika kombinieren häufig isotherme Amplifikationsmethoden wie die Rekombinase-Polymerase-Amplifikation (RPA) oder die schleifenvermittelte isotherme Amplifikation (LAMP)^14,15 mit der CRISPR-basierten Detektion unter Verwendung von RNA-gesteuerten CRISPR-assoziierten (Cas) Enzymen mit "kollateraler" Endonuklease-Aktivität nach Zielerkennung³. Die doppelte Verwendung von isothermer Amplifikation und CRISPR-basierter Detektion verleiht den Technologien mehrere wünschenswerte Eigenschaften, insbesondere eine hohe diagnostische Genauigkeit, die sich der der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) als Goldstandard annähert, und die Fähigkeit, kleine Sequenzunterschiede, einschließlich Einzelnukleotid-Polymorphismen, zu multiplexen und zu detektieren ^1,9.

Die genauesten Versionen der CRISPR-basierten Diagnostik enthalten jedoch mehrere Komponenten und Schritte und können mit Laien oder am Point-of-Care (POC) kompliziert durchzuführen sein. Um dieser Herausforderung zu begegnen, den Einsatz hochpräziser CRISPR-basierter Diagnostik auf POC-Umgebungen auszuweiten, haben wir Protokolle zur Herstellung von vorgemischten, lyophilisierten, rekombinasebasierten isothermen Amplifikations- und CRISPR-basierten Nachweisreaktionen entwickelt, die einfach zu verwenden und zu lagern sind⁷. Diese Protokolle sollten bestehende ausgezeichnete Protokolle zur CRISPR-basierten Diagnostik¹⁴ ergänzen, die zusätzliche Informationen über die Herstellung biochemischer Komponenten, die für die CRISPR-basierte Diagnostik benötigt werden⁷, Designrichtlinien¹ und Formulierungen unter Verwendung alternativer isothermer Amplifikationstechniken ^2,14,15,16 und Cas-Enzyme¹² enthalten. Letztendlich hoffen wir, dass die CRISPR-basierte Diagnostik dazu beitragen kann, einen schnellen, kostengünstigen und sensitiven Nukleiniknachweis in Umgebungen zu realisieren, in denen tragbare und instrumentenfreie Analysen erforderlich sind ^1,9,17.

Wir verwenden in unseren Protokollen hauptsächlich die Kombination aus RPA- und Cas13-basierter Detektion. RPA funktioniert bei Umgebungstemperaturen (37-42 °C) und hat daher einen geringen Energie- und Gerätebedarf. Andere isotherme Amplifikationsreaktionen erfordern höhere Temperaturen (LAMP, 60-65 °C; Strang-Verschiebungs-Amplifikation (SDA), 60 °C; exponentielle Amplifikationsreaktion (EXPAR), 55 °C; und helikaseabhängige Amplifikation (HDA), 65 °C)². Das Design von RPA-Primern ist im Gegensatz zu LAMP-Primern ebenfalls nicht komplex und kann auf Multiplex-Amplifikation erweitert werden ^7,9,14. Auch wenn das Multiplexen über zwei Ziele mit RPA in der Praxis schwierig ist, gibt es klare Richtlinien für die Gestaltung von Multiplex-RPA-Primern, um Interferenzen zu minimieren¹⁸.

Während Verschleppungskontaminationen im zweistufigen Arbeitsablauf ein großes Problem bleiben, sind die generierten Amplikons von RPA klein und verursachen im Vergleich zu großen konkatemerischen Amplikons aus LAMP¹⁴ weniger wahrscheinlich eine Verschleppungskontamination. RPA-Primer können nach den Standardrichtlinien¹⁴ ausgelegt werden: Sie sind in der Regel 25-35 Nukleotide lang und haben Schmelztemperaturen von 54 bis 67 °C. Die Amplikongröße sollte kleiner als 200 Basenpaare sein. Das reverse Transkriptase-Enzym (RT) kann zu RPA hinzugefügt werden, um die Amplifikation aus RNA zu ermöglichen, und bei der reversen Transkriptions-RPA (RT-RPA) wird ein weiteres Enzym, Ribonuklease H (RNase H), typischerweise in kleinen Mengen hinzugefügt, um die Auflösung des resultierenden RNA-DNA-Hybrids zu unterstützen und die Amplifikationsreaktion zu fördern ^5,19. Um die T7-Transkription für den Cas13-basierten Nachweis zu ermöglichen, kann der T7-RNA-Polymerase-Promotor am 5'-Ende des vorderen RPA-Primers platziert werden.

Nachdem Amplikons aus RPA erzeugt wurden, können sie mit crRNA-programmierten Cas-Enzymen nachgewiesen werden. Unter den verschiedenen Cas-Enzymen, die für die Amplikondetektion verwendet werden können, bevorzugen wir RNA-targetende Cas13-Varianten aufgrund ihrer hohen Spaltungsaktivität¹ und gut charakterisierten Polynukleotid-Spaltpräferenzen ^7,9, von denen letztere für die Multiplexdetektion verwendet werden können. Die crRNA-Sequenz für Cas13 ist so konzipiert, dass sie komplementär (reverse komplementär) zur Zielstelle in der produzierten RNA mit Spacer- und Direct Repeat (DR)-Sequenzen ist. Die crRNA-Sequenz und die RPA-Primer sollten sich nicht überlappen, um einen unerwünschten Cas-basierten Nachweis von Off-Target-Amplifikationsprodukten zu vermeiden, der die Hintergrund- und Falsch-Positiv-Ergebnisse erhöht¹⁴.

Der Cas-basierte Nachweis beruht auf verschiedenen Nachweismodalitäten, um die Spaltung von Reporter-Nukleinsäuremolekülen (RNA-Reporter für Cas13-basierte Reaktionen^{) zu} überwachen1,2,14. Zu den verschiedenen Detektionsmodalitäten gehören Kolorimetrie, elektrochemische Auslesungen, Fluoreszenz, Sequenzieranzeigen und Lateral-Flow-Strips². Wir konzentrieren uns auf die Fluoreszenzauslesung bei einer Vielzahl von Fluorophoren und Reportern wie Cyanin 5 (Cy5), Rhodamin X (ROX) und Carboxyfluorescein (FAM), die mit einer einzigen blauen LED-Lichtquelle effektiv angeregt werden können, und deren Fluoreszenz mit einem Mikroplatten-Reader oder einem Echtzeit-Thermocycler analysiert wird ^7,14. Darüber hinaus ist die Fluoreszenzauslesung einfach einzurichten und ermöglicht eine kontinuierliche Überwachung, die eine Quantifizierung in Echtzeit ermöglicht. Die Multiplex-RPA-Präamplifikation und die Multiplex-Cas13-basierte Detektion unter Verwendung von Cas-Enzymen können mit mehrfarbigen Fluoreszenzauslesungen für den gleichzeitigen Nachweis mehrerer genetischer Ziele kombiniert werden ^2,7.

In unseren Protokollen amplifizieren wir zunächst RNA isotherm mit RT-RPA, indem wir die RNA-Probe zur lyophilisierten Form des RT-RPA-Reagenzes hinzufügen (Abbildung 1). Während der RT-RPA wird der T7-Promotor an das erzeugte doppelsträngige DNA-Amplikon angehängt. Danach werden die RPA-Produkte auf den lyophilisierten Cas13-basierten Nachweis übertragen, der auch die T7-RNA-Polymerase enthält. Diese Nachweisreaktion wandelt DNA-Amplikons in RNA um (über die T7-RNA-Polymerase), die mit crRNA-programmiertem Cas13 leicht nachgewiesen werden kann. Target-aktiviertes Cas13 spaltet Reportermoleküle, um ein nachweisbares Fluoreszenzsignal zu erzeugen ^2,7,14. Während sich die Protokolle hier auf den Nachweis durch Leptotrichia wadei (LwaCas13a) beziehen, können sie auf den gleichzeitigen, multiplexierten Nachweis von bis zu vier Zielen unter Verwendung orthogonaler Cas13- und Cas12-Enzyme erweitert werden ^7,9. RPA- und Cas-basierte Nachweisreaktionen können ebenfalls in einem einzigen Röhrchen kombiniert werden, wenn auch mit einem Verlust an Empfindlichkeit¹⁴.

Abbildung 1: Arbeitsablauf bei der CRISPR-basierten Detektion. Der Workflow veranschaulicht den Nachweis von zwei Zielgenen. Zunächst werden interessante Regionen innerhalb des DNA-Ziels mit RPA isotherm amplifiziert; Die Reaktion kann mit reverser Transkription (RT-RPA) beim Nachweis von RNA-Zielen durchgeführt werden. Danach wandelt die T7-Transkription dsDNA-Amplikons in RNAs um, die wiederum von Cas13-crRNA-Komplexen erkannt werden, die in der Lage sind, kollaterale RNase-Aktivität bei der Zielbindung auszulösen. Die Spaltung von abgeschreckten Fluoreszenzreportern erzeugt Fluoreszenzsignale, die mit einem Mikroplatten-Reader überwacht, durch einen LED-Transilluminator visualisiert oder mit einem Echtzeit-Thermocycler verwendet werden können. Abkürzungen: CRISPR = Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats; RT = reverse Transkription; RPA = Rekombinase-Polymerase-Amplifikation; Cas = CRISPR-assoziiertes Protein; LED = Leuchtdiode. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die Hauptmerkmale der hier vorgestellten Protokolle sind die Vormischformulierungen für die Lyophilisation. Das Vormischen vereinfacht die Anwendung der Reaktion und verbessert die Reproduzierbarkeit, aber viele Komponenten der RPA- und Cas-basierten Detektion, insbesondere die reverse Transkription und einige labile Cofaktoren wie ATP, sind in Lösung nicht stabil. Daher formulieren wir die vorgemischten Lösungen so, dass sie für die Langzeitlagerung und den einfachen Transport und Einsatz gefriergetrocknet werden können ^1,9,20. Vorgemischte, gefriergetrocknete Reagenzien tragen ebenfalls zur Verbesserung der Nachweisempfindlichkeit bei, da ein höheres Probenvolumen (und damit ein höherer DNA/RNA-Input) hinzugefügt werden kann, um die Reaktion zu rekonstituieren¹⁰. In unseren Formulierungen verwenden wir hauptsächlich Trehalose²¹ als Kryoprotektivum in lyophilisierten RPA- und Cas-basierten Nachweisreaktionen⁷. Neben der Konservierung der Reagenzien fördert Trehalose auch die Reaktionen durch Erhöhung der Enzymstabilisierung 16,22,23,24 und Senkung der Schmelztemperaturen von dsDNA²³. Die Erforschung anderer Stabilisatoren 5,7,21,25,26 über Trehalose hinaus kann zu noch optimaleren Formulierungen für verschiedene Anwendungsszenarien führen.

Protokoll

1. Herstellung von lyophilisierten RT-RPA-Remixen

1. Vorbereitung der Ausrüstung
   1. Bereiten Sie einen Dewar oder ein Tablett mit flüssigem Stickstoff für das Schockfrosten von Reaktionen vor. Füllen Sie den Dewar oder das Tablett mit flüssigem Stickstoff.
   2. Gefriertrockner
      1. Überprüfen Sie, ob sich die Abflussrohre und das Innere der Kammer auf Kondenswasser befinden. Entfernen Sie bei Bedarf das Wasser.
      2. Reinigen Sie das Innere der Kammer und das Metallgestell des 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchens mit RNase-Dekontaminationslösung, gefolgt von 70 % Ethanol.
      3. Schließen Sie die Kammertür und das Vakuumablassventil.
      4. Schalten Sie den Gefriertrockner ein.
      5. Stellen Sie die Regaltemperatur manuell auf -30 °C ein.
   3. Geräte für die Molekularbiologie
      1. Reinigen Sie mit der RNase-Dekontaminationslösung: Pipetten, Pipettenspitzenracks, einen Vortex-Mischer, eine Spin-down-Minizentrifuge und einen Permanentmarker.
      2. Reinigen Sie mit Leitungswasser und wischen Sie dann mit Reinigungspapier ab: Kunststoffgestelle für Mikrozentrifugenröhrchen und eine Schaumstoffbox für Eis.
      3. Bereiten Sie einen Heizblock vor (der zum Auflösen/Resolubilisieren der Triglycinlösung verwendet wird), indem Sie ihn mit RNase-Dekontaminationslösung und 70%igem Ethanol reinigen. Schalten Sie es dann ein und stellen Sie die Temperatur auf 60 °C ein.
2. Vorbereitung von vorgemischten RPA-Reaktionen
   HINWEIS: Diese Formulierung ist für 10 Reaktionen (mit drei RPA-Pellets).
   1. Prüfen Sie vor der Anwendung, ob die Triglycinlösung Niederschlag enthält. Wenn Ausfällungen vorhanden sind, lösen Sie diese auf, indem Sie sie bei 60 °C inkubieren und vor der Verwendung gründlich mischen. Kühlen Sie die Triglycinlösung ab, bevor Sie andere wärmeempfindliche Reagenzien hinzufügen.
      HINWEIS: Ausfällungen können sich leicht bilden, wenn das Rohr über einen längeren Zeitraum bei Raumtemperatur belassen wird.
   2. Entfernen Sie drei RPA-Pelletstreifenrohre aus dem Gefrierschrank. Klopfen Sie auf die Streifenröhrchen, indem Sie sie vorsichtig gegen den Labortisch schlagen, um die weißen Kügelchen zu lösen.
   3. Übertragen Sie alle drei Pellets in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen A.
   4. Pipettieren Sie 25 μl nukleasefreies Wasser, um das verbleibende RPA-Pulver in den Streifenröhrchen zu spülen, und überführen Sie die Spüllösung in ein neues 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen B.
   5. Geben Sie 10 μl der 0,57 M Triglycinlösung und 10 μl Primermischung (je 10 μM) in das Mastermix-Röhrchen B.
   6. Vortex-Mix-Rohr B; Dann schleudern Sie nach unten und legen Sie das Rohr auf Eis.
   7. Geben Sie 28,4 μl des 5x RPA-Puffers (hergestellt aus 500 μl 50 % (w/v) PEG20000, 250 μl 1 M Tris pH 7,4 und 100 μl 100 mM Dithiothreitol (DTT)) in das Mastermix-Röhrchen B und mischen Sie es gründlich durch mehrmaliges kräftiges Klopfen oder Schütteln.
      HINWEIS: Wir stellen die Lösung auf diese Weise her, um die Viskosität von PEG in der Mastermix-Tube zu verdünnen/zu verringern, bevor wir alles hinzufügen, um RPA-Pellets zu lösen.
   8. Übertragen Sie die in Röhrchen A aus Schritt 1.2.3 gesammelten Pellets in das Mastermix-Röhrchen B und drehen Sie dann das Mastermix-Röhrchen mehrmals um, um es zu mischen. Beobachten Sie, ob die Lösung homogen und einphasig erscheint (sie sieht auch leicht undurchsichtig aus) und stellen Sie dann das Röhrchen auf Eis.
      HINWEIS: Wenn das Mischen nicht gründlich ist, kann PEG dazu führen, dass die Lösung/Suspension phasengetrennt wird.
   9. Geben Sie 0,71 μl 200 Einheiten/μl RT und 2,84 μl 5 Einheiten/μl RNase H in das Mastermix-Röhrchen. Klopfen oder indrehen Sie das Mastermix-Rohr viele Male vorsichtig auf und ab. Schleudern Sie nach unten und legen Sie die Röhre auf Eis.
      HINWEIS: Wir fügen diese Enzyme nach starkem Mischen früherer Schritte hinzu, da RT und RNase H aufgrund des Mischens empfindlich auf Scherung reagieren. kein Vortexen mehr nach RT/RNase H-Zugabe.
   10. Aliquotieren Sie 8,4 μl der Mastermix-Lösung auf 10 vorgekühlte 1,5-ml-Röhrchen und legen Sie die Röhrchen auf Eis. Tauchen Sie dazu die Pipettenspitze in die Mastermix-Lösung und ziehen Sie die Mastermix-Lösung langsam und gleichmäßig in die Spitze, um die Bildung von Luftblasen zu verhindern und eine genaue Volumenmessung zu gewährleisten. Geben Sie die Mastermix-Lösung in ein vorgekühltes 1,5-ml-Röhrchen.
       HINWEIS: Bei aliquotierten 8,4 μl verbleiben unserer Erfahrung nach ~1-2 μl Suspension in der Mastermix-Tube. Der Experimentator kann das aliquotierende Volumen leicht nach unten einstellen, um sicherzustellen, dass genügend Reagenzien für alle 10 Reaktionen zur Verfügung stehen. Verwenden Sie die richtigen Pipettiertechniken, wenn Sie mit viskosen Lösungen umgehen.
   11. Nachdem die Aliquotierung abgeschlossen ist, legen Sie die Röhrchen in ein Metallgestell, das in flüssigen Stickstoff getaucht ist, um sie für die Gefriertrocknung vorzubereiten. Lassen Sie die Röhrchen 5 Minuten lang in flüssigen Stickstoff eintauchen.
       HINWEIS: Da die Lyophilisierung überschüssige Lösung entfernt, können wir mehr DNA/RNA-Input hinzufügen, was zur Erhöhung der Empfindlichkeit beiträgt. Gefriergetrocknete vorgemischte RPA-Reaktionen können 8 Monate bei -20 °C gelagert werden. Die Lyophilisierung trägt zur Reproduzierbarkeit bei, wenn ein bestimmtes Experiment mit RPA-Mastermixen durchgeführt wird, die in derselben Charge hergestellt wurden, so dass auch die Herstellung einer größeren Charge hilfreich ist.
3. Gefriertrocknung
   1. Überprüfen Sie am Gefriertrockner die Kollektor- und Regaltemperatur. Warten Sie gegebenenfalls, bis die Kollektortemperatur -75 ± 5 °C und die Regaltemperatur -30 ± 1 °C erreicht.
   2. Decken Sie die offenen Röhrchen im Metallgestell mit einem Blatt Reinigungspapier ab, legen Sie das Metallgestell zusammen mit den offenen Röhrchen in das Gefriertrocknerregal und schließen Sie die Einschubtür.
   3. Wählen Sie das in Tabelle 1 gezeigte Programm aus und drücken Sie Start. Nach 30 min des zweiten Trocknungsschritts (20 °C, <0,1 mbar; die Temperatur wird unendlich gehalten, indem die Zeit des Schritts auf "unendlich" eingestellt wird) drücken Sie auf Stopp des Programms.
      HINWEIS: Wir lassen die Rohre im Gefriertrockner erwärmen, um Wasserkondensation zu vermeiden.
   4. Lassen Sie den Druck ab, indem Sie das Vakuumablassventil öffnen, und nehmen Sie dann das Gestell aus dem Regal. Verschließen Sie die Röhrchen sofort und lagern Sie die lyophilisierten Reaktionen bei -20 °C.
      HINWEIS: Lyophilisierte RPA- und CRISPR-Cas13a-Vormischungen können 8 Monate lang bei -20 °C gelagert werden.

2. Herstellung von lyophilisierten CRISPR-Cas13a-Nachweisreagenzien

HINWEIS: Befolgen Sie Schritt 1.1 zur Vorbereitung der Ausrüstung.

1. CRISPR-Cas13a vorgemischte Reaktionsvorbereitung (10 Reaktionen)
   1. Nehmen Sie die folgenden Gegenstände aus dem Lager und legen Sie sie auf Eis: 10 μl LwaCas13a (hauseigene^{Herstellung 7,8,14}) (2 mg/ml), Cas-Lagerpuffer, 10 ng/μl (225 nM) crRNA, 25 mM rNTP, 50 Einheit/μl T7-RNA-Polymerase, 2 μM FAM-Fluoreszenzreporter.
   2. Bereiten Sie eine Arbeitslösung von LwaCas13a mit 126 μg/ml (900 nM) her, indem Sie 148,8 μl Cas-Speicherpuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 0,6 M NaCl, 5 % Glycerin, 2 mM DTT) zu 10 μl 2 mg/ml LwaCas13a hinzufügen.
   3. Bereiten Sie die CRISPR-Cas13a-Mastermix-Reaktion wie folgt vor: 71 μl RNase-freies Wasser, 20 μl 400 mM Tris pH 7,4, 20 μl 60 % (w/v) Trehalose, 10 μl 10 ng/μl (225 nM) crRNA (hier auf die s - und n-Gene von SARS-CoV-2 abzielend), 8 μl 100 mM rNTP-Mix (je 25 mM), 6 μl 50 Einheiten/μl T7-RNA-Polymerase, 25 μl 2 μM FAM Fluoreszenzreporter und 10 μl 126 μg/mL (900 nM) LwaCas13a. Gut mischen, indem Sie das Mastermix-Rohr umkehren; Drehen Sie dann nach unten.
   4. Aliquotieren Sie 17 μl des Mastermixes in 10 1,5-ml-Röhrchen, die auf Eis gelegt werden. Legen Sie die Röhrchen in ein in flüssigen Stickstoff getauchtes Gestell und lassen Sie die Röhrchen 5 Minuten lang in flüssigen Stickstoff eintauchen.
2. Gefriertrocknung
   1. Überprüfen Sie am Gefriertrockner die Kollektor- und Regaltemperaturen und warten Sie, bis die Kollektortemperatur -75 ± 5 °C und die Einschubtemperatur -30 ± 1 °C erreicht.
   2. Legen Sie die Röhrchen in den Gefriertrockner. Wählen Sie das in Tabelle 1 gezeigte Programm aus und drücken Sie Start. Nach 30 min des zweiten Trocknungsschritts (25 °C, <0,1 mbar; die Temperatur wird unendlich gehalten, indem die Zeit des Schritts auf "unendlich" eingestellt wird) wird das Programm gestoppt .
   3. Lassen Sie den Druck ab, indem Sie das Vakuumablassventil öffnen und das Gestell aus dem Regal nehmen. Verschließen Sie die Röhrchen sofort und lagern Sie die lyophilisierten Reaktionen bei -20 °C.
      HINWEIS: Lyophilisierte RPA- und CRISPR-Cas13a-Reagenzien können 8 Monate lang bei -20 °C gelagert werden.

3. RT-RPA-Nukleinsäure-Amplifikation

HINWEIS: Um eine Kreuzkontamination zu vermeiden, sollten Arbeitsbereiche und Pipettierer für die Voramplifikation, die Probenzugabe und die Nachamplifikation getrennt werden. Wir empfehlen die Verwendung von gefilterten Pipettenspitzen.

1. Einen Thermoschüttel-Inkubator auf 42 °C vorwärmen.
2. Geben Sie 1 μl Magnesiumacetat (Mg(OAc)₂) und Kaliumacetat (KOAc) Lösungsgemisch (bestehend aus 196 mM Mg(OAc)₂ und 1,5 M KOAc) an die Seite des Röhrchens, das das lyophilisierte, vorgemischte RT-RPA-Pellet (aus Abschnitt 1) enthält.
   HINWEIS: Ein Trick, um die Mischung aus Mg(OAc)₂ und KOAc hinzuzufügen: Der Tropfen sollte etwa an der 1-ml-Volumenmarkierung des Röhrchens platziert werden. Hier ist der Tropfen deutlich sichtbar und es ist unwahrscheinlich, dass er durch das Schließen der Tube oder andere Aktionen verloren geht. Die Verstärkung beginnt nach dem Herunterdrehen, um den Tropfen am Röhrenboden aufzufangen. Wenn mehr als eine Reaktion gleichzeitig verarbeitet wird, kann die Amplifikation gleichzeitig eingeleitet werden.
3. Resuspendieren Sie das RT-RPA-Pellet, indem Sie 12,4 μl der RNA-Probe (oder der Kontrollproben) hinzufügen.
   HINWEIS: Die Additionssequenz ist Negativprobe/Negativkontrolle, zu testende RNA/DNA, Positivprobe/Positivkontrolle.
4. Um die RT-RPA-Reaktion einzuleiten, wird die aus den Schritten 3.2 und 3.3 hinzugefügte Lösung mit einer Spin-down-Minizentrifuge bei Raumtemperatur 3 s lang kurz heruntergeschleudert.
5. Mixen Sie, indem Sie vorsichtig auf die Tube klopfen und dann noch einmal kurz für 3 s drehen.
6. Inkubieren Sie die Reaktion 60 Minuten lang bei 42 °C, indem Sie sie in einen vorgeheizten Heizblock oder einen thermischen Schüttelinkubator stellen.
7. Nehmen Sie nach Beendigung der Reaktion die Reaktionsgefäße heraus und legen Sie sie auf Eis, bevor Sie mit dem CRISPR-Cas-Detektionsschritt fortfahren (Abschnitt 4).
   HINWEIS: Das RPA-amplifizierte Produkt kann sofort in der Nachweisreaktion verwendet werden oder kann mehrere Tage lang bei 4 °C oder mehrere Monate bei -20 °C gelagert werden.

4. Nachweis von CRISPR-Cas13-Nukleinsäuren

1. Schalten Sie einen Fluoreszenz-Mikroplatten-Reader ein, stellen Sie die Heiztemperatur auf 37 °C ein, heizen Sie sie vor und wählen Sie das in Tabelle 2 gezeigte Programm aus.
2. Lege eine 384-Well-Platte auf Eis.
3. Resuspendieren Sie die lyophilisierte CRISPR-Cas-vorgemischte Nachweisreaktion (aus Abschnitt 2) durch Zugabe von 17 μl 8 mM Magnesiumchloridlösung. Mischen Sie, indem Sie vorsichtig auf das Röhrchen klopfen; Dann kurz 3 s nach unten schleudern und den Schlauch auf Eis legen.
4. Übertragen Sie 18 μl des resuspendierten Reaktionsgemisches in jede Vertiefung der vorgekühlten 384-Well-Platte auf Eis.
5. Geben Sie 2 μl des in Abschnitt 3 hergestellten RPA-Produkts in jede Reaktionsvertiefung.
6. Nehmen Sie die Platte aus dem Eis, legen Sie sie schnell in einen vorgewärmten Fluoreszenz-Mikroplatten-Reader und drücken Sie auf Start.
   HINWEIS: Eine 384-Well-Platte wurde auf Eis gelegt, um eine Synchronisierung der Reaktionsinitiierung zu ermöglichen, wenn die 384-Well-Platte in einen vorgewärmten Fluoreszenz-Mikroplatten-Reader übertragen wird.

Ergebnisse

Wir beleuchten die Kinetik der FAM-Fluoreszenzsignalerzeugung aus dem kombinierten Nachweis von s - und n-Genen von SARS-CoV-2 und wie die Informationen verwendet wurden, um optimale Bedingungen für lyophilisierte, vorgemischte Reaktionsformulierungen zu bestimmen. In allen Fällen schlossen wir Proben mit C_t-Werten ein, die deutlich innerhalb der ermittelten Nachweisgrenze (LoD) (C_t ~31-33) lagen, sowie Proben mit C_t an der LoD (C_...

Diskussion

Dieses Protokoll enthält wichtige Schritte. Für die Bereichstrennung wird empfohlen, separate Räume für die Nukleinsäureextraktion, die Mastermix-Vorbereitung (Bereich vor der Amplifikation), die Probenzugabe und die Amplikondetektion (Bereich nach der Amplifikation) zu verwenden. Jeder Bereich sollte mit einem separaten Satz von Werkzeugen und Geräten eingestellt werden. Bringen Sie keine Werkzeuge von einem Bereich in einen anderen, insbesondere nicht aus dem Bereich nach der Ver...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material
Betaine solution	Sigma-Aldrich	B0300-1VL
DEPC-Treated water	Invitrogen	AM9915G
Dithiothreitol (DTT)	Merck	3870-25GM
EpiScript reverse transcriptase	Lucigen	ERT12925K
Gly-Gly-Gly	Sigma-Aldrich	SIA-50239-1G
LwaCas13a	Producing in-house		Strain name:Leptotrichia wadei, Abbreviation: Lwa, Protein name: LwaCas13a
Magnesium chloride solution, 1M	Sigma-Aldrich	M1028-10X1ML
NxGenT7 RNA polymerase	Lucigen	30223-2
Poly(ethylene glycol)	Sigma-Aldrich	81300-1KG
Potassium acetate solution, 5M	Sigma-Aldrich	95843-100ML-F
Riobnucleotide Solution Mix	NEB	N0466L
RNase H	NEB	M0297L
Sucrose	TCI	TCI-S0111-500G
Trehalose Dihydrate	Sigma-Aldrich	SIA-90210-50G
Trizma hydrochloride solution, 1M, pH 7.4	Sigma-Aldrich	T2194-100ML
TwistAmp Basic kit	TwistDx	TABAS03KIT
Equipment
BluPAD Dual LED Blue/White light transilluminator	Bio-Helix	BP001CU
Dry Bath Dual Block	ELITE	4-2-EL-02-220	Model: EL-02
Fluorescence microplate reader	Tecan	30050303	Model: Infinite 200 Pro
Freeze dryer	LABCONCO	794001030	FreeZone Triad Benchtop Freeze Dryer
Microplate 384-well	Greiner	GDE0784076	F-Bottom, small volume, Hibase, Med. Binding, Black
Real-time thermal cycler (CFX Connect Real-Time PCR System)	Bio-Rad	185-5201	Model: CFX Connect Optics Module
Oligonucleotide
s-gene forward RPA primer	IDT		GAAATTAATACGACTCAC TATAGGGAGGTTTCAAAC TTTACTTGCTTTACATAGA
s-gene reverse RPA primer	IDT		TCCTAGGTTGAAGA TAACCCACATAATAAG
n-gene forward RPA primer	IDT		GAAATTAATACGACTC ACTATAGGAACTTCTC CTGCTAGAATGGCTG
n-gene reverse RPA primer	IDT		CAGACATTTTGCTCTC AAGCTGGTTCAATC
LwaCas13a-crRNA for the s gene	Synthego		GAUUUAGACUACCCCAAAAAC GAAGGGGACUAAAACGCAGCA CCAGCUGUCCAACCUGAAGAAG
LwaCas13a-crRNA for the n gene	Synthego		GAUUUAGACUACCCCAAAAACG AAGGGGACUAAAACAAAGCAAG AGCAGCAUCACCGCCAUUGC
FAM-polyU-IABkFQ reporter	IDT		56-FAM/rUrUrUrUrU/3IABkFQ
O-hannah_cytb_F RPA primer	IDT		GAAATTAATACGACTCACTA TAGGGTACGGATGAACCATA CAAAACCTTCACGCAATCG
O-hannah_cytb_R RPA primer	IDT		AAGATCCATAGTAGATTC CTCGTGCGATGTGGATA
synT7crRNA13a_ O_hannah	IDT		GCGCATCCATATTCTTCAT CTGCATTTAGTTTTAGTCC CCTTCGTTTTTGGGGTA GTCTAAATCCCCTATAGT GAGTCGTATTAATTTC