プレミックス試薬とフリーズドライ試薬によるポイントオブケアCRISPRベースの診断

要約

ここでは、感染症病原体やその他の遺伝子マーカーの核酸バイオマーカーの検出に使用できる、プレミックス凍結乾燥リコンビナーゼベースの等温増幅反応とCRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)ベースの反応の段階的な調製について紹介します。

要約

CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)ベースの検出による分子診断は、高い診断精度と特性を備えており、結果のターンアラウンドタイムが短い、便利でシンプルな読み出し、複雑な機器を必要としないなど、ポイントオブケア環境での使用に適しています。しかし、反応は、その多くのコンポーネントと手動の取り扱いステップのために、ケアの時点で行うのが面倒な場合があります。ここでは、リコンビナーゼベースの等温増幅試薬とCRISPRベースの試薬を使用して、疾患病原体と遺伝子マーカーをしっかりと検出するための段階的に最適化されたプロトコルを提供します。これらは事前に混合され、保存が簡単ですぐに使用できる形式で凍結乾燥されます。あらかじめ混合された凍結乾燥試薬は、すぐに使用できるように再水和することができ、高い増幅効率と検出効率を維持することができます。また、CRISPRベースの診断用にプレミックスされた凍結乾燥試薬を調製して使用する際によく見られる問題のトラブルシューティングガイドを提供し、より広範な診断/遺伝子検査コミュニティが検出プラットフォームにアクセスしやすくします。

概要

核酸バイオマーカーの検出のためのCRISPRベースの診断法は、2017年に初めて報告されました 1,2,3,4 それ以来、食品医薬品局(FDA)が承認した検査、特に重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)RNAの検出に関する次世代の診断法として、複数の国で証明されています^5,6,7,8.コロナウイルス病2019(COVID-19)を超えて、これらの技術は、多様なウイルスや細菌^{9,10,11,12,13}、遺伝性疾患の突然変異や欠失の検出に効果的であることが実証されており、タンパク質や低分子バイオ^{マーカー2,12}を検出するように操作できます.CRISPRベースの診断法は、多くの場合、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅(RPA)やループ媒介等温増幅(LAMP)^14,15などの等温増幅法と、標的認識後の「側副」エンドヌクレアーゼ活性を持つRNA誘導CRISPR関連(Cas)酵素を用いたCRISPRベースの検出を組み合わせたものです³.等温増幅とCRISPRベースの検出の二重使用は、技術にいくつかの望ましい属性、特にゴールドスタンダードのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)に近い高い診断精度、および一塩基多型^1,9を含む小さな配列の違いを多重化して検出する能力を与えます。

しかし、CRISPRベースの診断法の最も精度の高い診断法は、複数のコンポーネントとステップを含んでおり、専門家でない人やポイントオブケア(POC)での実施が複雑になる場合があります。高精度のCRISPRベースの診断法の使用をPOC設定にまで拡大するというこの課題に対処するために、私たちは、プレミックス、凍結乾燥、リコンビナーゼベースの等温増幅反応およびCRISPRベースの検出反応を調製するためのプロトコル^{を開発しました。}これらのプロトコルは、CRISPRベースの診断7^{に必要な生}化学的成分の産生に関する追加情報を含むCRISPRベースの診断¹⁴、デザインガイドライン¹、および代替の等温増幅技術2,14,15,16およびCas酵素¹²を使用した製剤を含む、CRISPRベースの診断14に関する既存の優れたプロトコルを補完するべきである.最終的には、CRISPRベースの診断法が、携帯型で機器不要の分析が必要な環境で、迅速で安価、かつ高感度な核検出を実現できることを願っています^1,9,17。

当社のプロトコルでは、主にRPAとCas13ベースの検出を組み合わせて使用しています。RPAは周囲温度に近い温度(37-42°C)で機能するため、エネルギーと機器の要件は低くなっています。その他の等温増幅反応では、より高い温度が必要です(LAMP、60-65°C、ストランド変位増幅(SDA)、60°C、指数関数的増幅反応(EXPAR)、55°C、ヘリカーゼ依存性増幅(HDA)、65°C)²。RPAプライマーの設計も、LAMPプライマーとは異なり複雑ではなく、マルチプレックス増幅^7,9,14に拡張することができる。RPAを使用して2つのターゲットを超えて多重化することは実際には困難ですが、干渉を最小限に抑えるための多重化RPAプライマーの設計方法に関する明確なガイドラインがあります¹⁸。

キャリーオーバー汚染は2ステップワークフローで大きな問題であることに変わりはありませんが、生成されたRPAのアンプリコンは、LAMP¹⁴の大型コンカテメリックアンプリコンと比較してサイズが小さく、キャリーオーバー汚染を引き起こす可能性が低くなります。RPAプライマーは、標準的なガイドライン¹⁴に従って設計することができます:それらは一般的に25〜35ヌクレオチド長で、融解温度は54〜67°Cです。 アンプリコンのサイズは 200 塩基対未満である必要があります。逆転写酵素(RT)をRPAに添加してRNAからの増幅を可能にすることができ、逆転写RPA(RT-RPA)では、別の酵素リボヌクレアーゼH(RNase H)が典型的には少量で添加され、得られたRNA:DNAハイブリッドを分離し、増幅反応を促進する^5,19。Cas13ベースの検出でT7転写を可能にするために、T7 RNAポリメラーゼプロモーターをフォワードRPAプライマーの5'末端に配置することができます。

RPAからアンプリコンが生成された後、crRNAでプログラムされたCas酵素で検出できます。アンプリコン検出に使用できるさまざまなCas酵素の中で、私たちは、その高い切断活性¹と、十分に特徴付けられたポリヌクレオチド切断選好^7,9のために、RNA標的Cas13変異体を好みます。Cas13のcrRNA配列は、スペーサーおよびダイレクトリピート(DR)配列により、産生されたRNAの標的部位に相補的(逆相補的)になるように設計されています。crRNA配列とRPAプライマーは、バックグラウンドおよび偽陽性を増加させるオフターゲット増幅産物の望ましくないCasベースの検出を避けるために、重複してはならない¹⁴。

Casベースの検出は、レポーター核酸分子(Cas13ベースの反応のRNAレ^{ポーター)の}切断をモニターするために、さまざまな検出モダリティに依存しています^1,2,14。さまざまな検出モダリティには、比色分析、電気化学的読み出し、蛍光、シーケンシング読み出し、ラテラルフローストリップ²が含まれます。我々は、単一の青色LED光源を用いて効果的に励起することができるシアニン5(Cy5)、ローダミンX(ROX)、カルボキシフルオレセイン(FAM)などの種々の蛍光色素およびレポーターを与えられた蛍光読み出し、およびそれらの蛍光をマイクロプレートリーダーまたはリアルタイムサーマルサイク^ラー7,14によって分析することに焦点を当てる。さらに、蛍光読み出しはセットアップが簡単で、継続的なモニタリングが可能なため、リアルタイムの定量が可能です。マルチプレックスRPA前増幅とCas酵素を用いたマルチプレックスCas13ベースの検出は、マルチカラー蛍光読み出しと組み合わせることで、複数の遺伝子ターゲットを同時に検出することができます^2,7。

私たちのプロトコルでは、まず、RT-RPA試薬の凍結乾燥型にRNAサンプルを添加することにより、RT-RPAでRNAを等温増幅します(図1)。RT-RPAでは、生成された二本鎖DNAアンプリコンにT7プロモーターが付加されます。その後、RPA産物は、T7 RNAポリメラーゼも含まれる凍結乾燥Cas13ベースの検出に移されます。この検出反応は、DNAアンプリコンを(T7 RNAポリメラーゼを介して)RNAに変換し、crRNAプログラムCas13で容易に検出できます。標的活性化Cas13は、レポーター分子を切断して検出可能な蛍光シグナル^2,7,14を産生します。ここでのプロトコルは、Leptotrichia wadei(LwaCas13a)による検出に関するものですが、直交するCas13およびCas12酵素^7,9を使用して、最大4つのターゲットを同時にマルチプレックス検出するように拡張することができます。RPAとCasベースの検出反応も、感度は低下しますが、1つのチューブに組み合わせることができます¹⁴。

図1:CRISPRベースの検出ワークフロー。 このワークフローは、2つの標的遺伝子の検出を示しています。まず、DNAターゲット内の関心領域をRPAで等温的に増幅します。RNAターゲットを検出する際に、逆転写(RT-RPA)を用いて反応を行うことができます。その後、T7転写はdsDNAアンプリコンをRNAに変換し、次に、標的結合時に側副RNase活性を誘発できるCas13-crRNA複合体によって認識されます。消光された蛍光レポーターの切断により、マイクロプレートリーダーを使用してモニタリングしたり、LEDトランスイルミネーターで可視化したり、リアルタイムのサーマルサイクラーで使用したりできる蛍光シグナルが生成されます。略語:CRISPR =クラスター化された規則的に間隔を空けた短い回文リピート。RT = 逆転写;RPA = リコンビナーゼポリメラーゼ増幅;Cas = CRISPR関連タンパク質;LED = 発光ダイオード。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ここで紹介するプロトコールの主な特徴は、凍結乾燥用のプレミキシング製剤です。プレミキシングにより反応の使用が簡素化され、再現性が向上しますが、RPAおよびCasベースの検出に含まれる多くの成分、特に逆転写やATPなどの不安定な補因子は溶液中で安定していません。したがって、我々は、長期保存および容易な輸送^{および展開のために}凍結乾燥できるように、予混合溶液を配合する^1,9,20。また、予混合された凍結乾燥試薬は、反応を再構成するためにより多くのサンプル量(したがって、より多くのDNA/RNAインプット)を添加することができるため、検出感度の向上にも役立ちます¹⁰。当社の製剤では、凍結乾燥RPAおよびCasベースの検出反応⁷の凍結保護剤として主にトレハロース²¹を使用しています。試薬の保存に加えて、トレハロースは、酵素安定化16,22,23,24の増加およびdsDNAの融解温度の低下²³を介して反応も促進する。トレハロース以外の他の安定剤5,7,21,25,26の探索は、異なる使用シナリオに対してさらに最適な処方をもたらすかもしれない。

プロトコル

1. 凍結乾燥RT-RPAプレミックス試薬の調製

1. 機器の準備
   1. 反応の瞬間凍結のために液体窒素デュワーまたはトレイを準備します。デュワーまたはトレイに液体窒素を入れます。
   2. 凍結乾燥機
      1. 排水管とチャンバー内部に凝縮水がないか確認してください。必要に応じて水を取り除きます。
      2. チャンバー内部と1.5 mL微量遠心チューブの金属ラックをRNase除染溶液で洗浄し、続いて70%エタノールで洗浄します。
      3. チャンバードアと真空解除バルブを閉じます。
      4. 凍結乾燥機の電源を入れます。
      5. シェルフの温度を手動で-30°Cに設定します。
   3. 分子生物学機器
      1. RNase除染液で、ピペット、ピペットチップラック、ボルテックスミキサー、スピンダウンミニ遠心分離機、油性マーカーを洗浄します。
      2. 水道水で以下を掃除してから、クリーニングワイプ紙で拭いてください:マイクロ遠心チューブ用のプラスチックラックと氷用のフォームボックス。
      3. 加熱ブロック(トリグリシン溶液の溶解/再溶解に使用)をRNase除染溶液と70%エタノールで洗浄して調製します。次に、電源を入れて温度を60°Cに設定します。
2. プレミックスRPA反応の調製
   注:この製剤は10反応用です(3つのRPAペレットを使用)。
   1. 使用前にトリグリシン溶液に沈殿物がないか確認してください。沈殿物がある場合は、60°Cでインキュベートし、十分に混合して使用前に溶解してください。他の熱に敏感な試薬を追加する前に、トリグリシン溶液を冷却してください。
      注:チューブを室温で長期間放置すると、沈殿物が発生しやすくなります。
   2. 3本のRPAペレットストリップチューブを冷凍庫から取り出します。ストリップチューブをラボベンチにそっとたたき、白いペレットを外すように軽くたたきます。
   3. 3つのペレットすべてを1.5 mLの微量遠心チューブAに移します。
   4. ヌクレアーゼフリーの水25μLをピペットで注入し、ストリップチューブに残っているRPA粉末をすすぎ、すすぎ液を新しい1.5 mL微量遠心チューブBに移します。
   5. 0.57 Mトリグリシン溶液10 μLとプライマーミックス10 μL(各10 μM)をマスターミックスチューブBに加えます。
   6. ボルテックスミックスチューブB;次に、スピンダウンしてチューブを氷の上に置きます。
   7. 5x RPAバッファー28.4μL(500μLの50%(w/v)PEG20000、250μLの1M Tris pH 7.4、100μLの100 mMジチオスレイトール(DTT)から調製)をマスターミックスチューブBに加え、強く叩くか複数回振とうして十分に混合します。
      注:RPAペレットを可溶化するためにすべてを追加する前に、マスターミックスチューブ内のPEGの粘度を希釈/減少させるために、この方法で溶液を作成します。
   8. ステップ1.2.3でチューブAに回収したペレットをマスターミックスチューブBに移し、マスターミックスチューブを数回反転させて混合します。溶液が均一で単相に見えるかどうかを観察し(わずかに不透明に見える)、チューブを氷の上に置きます。
      注:混合が完全でない場合、PEGは溶液/懸濁液を相分離させる可能性があります。
   9. 0.71 μL の 200 Unit/μL RT と 2.84 μL の 5 Unit/μL RNase H をマスターミックスチューブに加えます。マスターミックスチューブを 何度も軽く たたいたり、上下に動かしたりします。スピンダウンして、チューブを氷の上に置きます。
      注:RTとRNase Hは混合によるせん断に敏感であるため、以前のステップで重く混合した後にこれらの酵素を追加します。RT/RNase H添加後のボルテックスはもうありません。
   10. マスターミックス溶液8.4μLを予冷した1.5mLチューブ10本に分注し、チューブを氷上に置きます。これを行うには、ピペットチップをマスターミックス溶液に突っ込み、マスターミックス溶液をゆっくりと着実にチップに引き込むことで、気泡の形成を防ぎ、正確な体積測定を確保します。マスターミックス溶液を予冷した1.5 mLチューブに分注します。
       注:8.4μLを分注すると、私たちの経験では、マスターミックスチューブには1~2μLの懸濁液が残ります。実験者は、10回の反応すべてに十分な試薬を確保するために、分注量をわずかに調整することができます。粘性溶液を取り扱う際には、適切なピペッティング技術を使用してください。
   11. 分注が完了したら、液体窒素に浸した金属製のラックにチューブを置き、凍結乾燥の準備をします。チューブを液体窒素に5分間沈めます。
       注:凍結乾燥により余分な溶液が除去されるため、DNA/RNAインプットを追加でき、感度の向上に役立ちます。凍結乾燥したプレミックスRPA反応液は、-20°Cで8ヶ月間保存できます。凍結乾燥は、同じバッチで調製されたRPAマスターミックスを使用して特定の実験を行う場合、再現性を高めるのに役立つため、より大きなバッチを作成することも役立ちます。
3. 凍結 乾燥
   1. 凍結乾燥機で、コレクターと棚の温度を確認します。必要に応じて、コレクタ温度が -75 ± 5 °C に達し、シェルフ温度が -30 ± 1 °C に達するまで待ちます。
   2. 金属製ラックの開いたチューブをクリーニングワイプペーパーで覆い、金属製のラックを開いたチューブと一緒に凍結乾燥機の棚に置き、棚のドアを閉じます。
   3. 表 1 に示すプログラムを選択し、スタートを押します。二次乾燥ステップの30分後(20°C、<0.1 mbar、ステップの時間を「無限」に設定することで温度が無限に保持されます)、プログラムの停止を押します。
      注:結露を防ぐために、チューブを凍結乾燥機で温めます。
   4. 真空解除バルブを開いて圧力を解放し、ラックを棚から取り外します。すぐにチューブにキャップをし、凍結乾燥反応液を-20°Cで保存します。
      注:凍結乾燥RPAおよびCRISPR-Cas13aプレミックス反応は、-20°Cで8ヶ月間保存できます。

2. 凍結乾燥CRISPR-Cas13aプレミックス検出試薬の調製

注意: 機器の準備については、手順1.1に従ってください。

1. CRISPR-Cas13aプレミックス反応調製(10反応)
   1. 10 μL の LwaCas13a (^7,8,14 で社内製造) (2 mg/mL)、Cas 保存バッファー、10 ng/μL (225 nM) crRNA、25 mM rNTP、50 Unit/μL T7 RNA ポリメラーゼ、2 μM の FAM 蛍光レポーター。
   2. 148.8 μLのCas保存バッファー(50 mM Tris-HCl pH 7.4、0.6 M NaCl、5%グリセロール、2 mM DTT)を10 μLの2 mg/mL LwaCas13aに加え、126 μg/mL(900 nM)のLwaCas13aの作業溶液を調製します。
   3. CRISPR-Cas13aマスターミックス反応液を次のように調製します:71 μLのRNaseフリー水、20 μLの400 mM Tris pH 7.4、20 μLの60%(w/v)トレハロース、10 μLの10 ng/μL(225 nM)crRNA(ここでは、SARS-CoV-2の s 遺伝子および n 遺伝子を標的とする)、8 μLの100 mM rNTPミックス(各25 mM)、6 μLの50 Unit/μL T7 RNAポリメラーゼ、 25 μL の 2 μM FAM 蛍光レポーター、10 μL の 126 μg/mL (900 nM) LwaCas13aマスターミックスチューブを反転させてよく混ぜます。その後、スピンダウンします。
   4. マスターミックス17μLを氷上に置いた1.5mLチューブ10本に分注します。液体窒素に浸したラックにチューブを置き、チューブを液体窒素に5分間浸します。
2. 凍結 乾燥
   1. 凍結乾燥機で、コレクターと棚の温度を確認し、コレクターの温度が-75±5°Cに達し、棚の温度が-30±1°Cに達するまで待ちます。
   2. チューブを凍結乾燥機に入れます。 表 1 に示すプログラムを選択し、 スタートを押します。二次乾燥ステップの30分後(25°C、<0.1 mbar、ステップの時間を「無限」に設定することにより、温度は無限に保持されます)、プログラム を停止 します。
   3. 真空解除バルブを開いて圧力を解放し、ラックを棚から取り外します。すぐにチューブにキャップをし、凍結乾燥反応液を-20°Cで保存します。
      注:凍結乾燥RPAおよびCRISPR-Cas13aプレミックス試薬は、-20°Cで8ヶ月間保存できます。

3. RT-RPA核酸増幅

注:クロスコンタミネーションを防ぐために、作業場のエリアとピペッターは、前増幅、サンプル追加、および後増幅のために分離する必要があります。フィルター付きピペットチップの使用をお勧めします。

1. 熱振盪インキュベーターを42°Cで予温します。
2. 酢酸マグネシウム(Mg(OAc)₂)と酢酸カリウム(KOAc)溶液混合物(196 mM Mg(OAc)₂ と1.5 M KOAcで構成)を、凍結乾燥された予混合RT-RPAペレット(セクション1)が入ったチューブの側面に1 μL加えます。
   注:Mg(OAc)₂ とKOAcの混合物を添加するコツ:液滴はチューブの1mLの容量マーク付近に配置する必要があります。ここでは、液滴がはっきりと見え、チューブの閉鎖やその他のアクションによって失われる可能性は低くなります。増幅は、チューブの底に液滴を集めるためにスピンダウンした後に開始されます。一度に複数の反応を処理する場合、増幅を同時に開始できます。
3. 12.4 μLのRNAサンプル(またはコントロールサンプル)を加えて、RT-RPAペレットを再懸濁します。
   注:添加の順序は、陰性サンプル/陰性コントロール、テスト対象のRNA / DNA、陽性サンプル/ポジティブコントロールです。
4. RT-RPA反応を開始するには、ステップ3.2および3.3で追加した溶液を、スピンダウンミニ遠心分離機を使用して室温で3秒間短時間スピンダウンします。
5. チューブを慎重に軽くたたいて混合し、次に3秒間別の短いスピンダウンを行います。
6. 反応液を予熱した加熱ブロックまたは熱振盪インキュベーターに入れて、42°Cで60分間インキュベートします。
7. 反応終了後、反応チューブを取り出して氷上に置いてから、CRISPR-Cas検出ステップ(セクション4)に進みます。
   注:RPA増幅製品は、すぐに検出反応に使用することも、4°Cで数日間、または-20°Cで数ヶ月間保存することもできます。

4. CRISPR-Cas13核酸検出

1. 蛍光マイクロプレートリーダーの電源を入れ、加熱温度を37°Cに設定して予熱し、 表2に示すプログラムを選択します。
2. 384ウェルプレートを氷の上に置きます。
3. 凍結乾燥したCRISPR-Casプレミックス検出反応(セクション2)を、17 μLの8 mM塩化マグネシウム溶液を加えて再懸濁します。チューブを慎重に軽くたたいて混ぜます。次に、3秒間短時間スピンダウンし、チューブを氷の上に置きます。
4. 再懸濁した反応混合物18 μLを、氷上で予冷した384ウェルプレートの各ウェルに移します。
5. セクション3で調製したRPA生成物2 μLを各反応ウェルに加えます。
6. プレートを氷から取り出し、予熱した蛍光マイクロプレートリーダーにすばやく入れて、 スタートを押します。
   注:384ウェルプレートを予熱した蛍光マイクロプレートリーダーに移すときに反応開始を同期できるように、384ウェルプレートを氷上に置いた。

結果

SARS-CoV-2の s 遺伝子と n 遺伝子の組み合わせ検出によるFAM蛍光シグナル生成の動態と、凍結乾燥されたプレミックス反応製剤の最適条件を決定するためにその情報がどのように使用されたかに焦点を当てます。いずれの場合も、C_t 値が決定された検出限界(LoD)内に十分収まるサンプル(C_t ~31-33)と、LoDにC_t があるサンプル(C_t ~...

ディスカッション

このプロトコルには重要な手順があります。エリアの分離には、核酸抽出、マスターミックス調製(増幅前領域)、サンプル添加、アンプリコン検出(増幅後領域)に別々のスペースを使用することをお勧めします。各エリアは、個別のツールと機器のセットを使用して設定する必要があります。あるエリアから別のエリアにツールを持ち込まないでください、特にポス?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material
Betaine solution	Sigma-Aldrich	B0300-1VL
DEPC-Treated water	Invitrogen	AM9915G
Dithiothreitol (DTT)	Merck	3870-25GM
EpiScript reverse transcriptase	Lucigen	ERT12925K
Gly-Gly-Gly	Sigma-Aldrich	SIA-50239-1G
LwaCas13a	Producing in-house		Strain name:Leptotrichia wadei, Abbreviation: Lwa, Protein name: LwaCas13a
Magnesium chloride solution, 1M	Sigma-Aldrich	M1028-10X1ML
NxGenT7 RNA polymerase	Lucigen	30223-2
Poly(ethylene glycol)	Sigma-Aldrich	81300-1KG
Potassium acetate solution, 5M	Sigma-Aldrich	95843-100ML-F
Riobnucleotide Solution Mix	NEB	N0466L
RNase H	NEB	M0297L
Sucrose	TCI	TCI-S0111-500G
Trehalose Dihydrate	Sigma-Aldrich	SIA-90210-50G
Trizma hydrochloride solution, 1M, pH 7.4	Sigma-Aldrich	T2194-100ML
TwistAmp Basic kit	TwistDx	TABAS03KIT
Equipment
BluPAD Dual LED Blue/White light transilluminator	Bio-Helix	BP001CU
Dry Bath Dual Block	ELITE	4-2-EL-02-220	Model: EL-02
Fluorescence microplate reader	Tecan	30050303	Model: Infinite 200 Pro
Freeze dryer	LABCONCO	794001030	FreeZone Triad Benchtop Freeze Dryer
Microplate 384-well	Greiner	GDE0784076	F-Bottom, small volume, Hibase, Med. Binding, Black
Real-time thermal cycler (CFX Connect Real-Time PCR System)	Bio-Rad	185-5201	Model: CFX Connect Optics Module
Oligonucleotide
s-gene forward RPA primer	IDT		GAAATTAATACGACTCAC TATAGGGAGGTTTCAAAC TTTACTTGCTTTACATAGA
s-gene reverse RPA primer	IDT		TCCTAGGTTGAAGA TAACCCACATAATAAG
n-gene forward RPA primer	IDT		GAAATTAATACGACTC ACTATAGGAACTTCTC CTGCTAGAATGGCTG
n-gene reverse RPA primer	IDT		CAGACATTTTGCTCTC AAGCTGGTTCAATC
LwaCas13a-crRNA for the s gene	Synthego		GAUUUAGACUACCCCAAAAAC GAAGGGGACUAAAACGCAGCA CCAGCUGUCCAACCUGAAGAAG
LwaCas13a-crRNA for the n gene	Synthego		GAUUUAGACUACCCCAAAAACG AAGGGGACUAAAACAAAGCAAG AGCAGCAUCACCGCCAUUGC
FAM-polyU-IABkFQ reporter	IDT		56-FAM/rUrUrUrUrU/3IABkFQ
O-hannah_cytb_F RPA primer	IDT		GAAATTAATACGACTCACTA TAGGGTACGGATGAACCATA CAAAACCTTCACGCAATCG
O-hannah_cytb_R RPA primer	IDT		AAGATCCATAGTAGATTC CTCGTGCGATGTGGATA
synT7crRNA13a_ O_hannah	IDT		GCGCATCCATATTCTTCAT CTGCATTTAGTTTTAGTCC CCTTCGTTTTTGGGGTA GTCTAAATCCCCTATAGT GAGTCGTATTAATTTC