Önceden Karıştırılmış ve Dondurularak Kurutulmuş Reaktifler ile Bakım Noktası CRISPR Tabanlı Teşhis

Özet

Burada, bulaşıcı hastalık patojenlerinin nükleik asit biyobelirteçlerinin tespiti için kullanılabilecek önceden karıştırılmış, liyofilize rekombinaz bazlı izotermal amplifikasyon ve Kümelenmiş Düzenli Aralıklı Kısa Palindromik Tekrarlar (CRISPR) tabanlı reaksiyonların adım adım hazırlanmasını sunuyoruz.

Özet

Kümelenmiş Düzenli Aralıklı Kısa Palindromik Tekrarlar (CRISPR) tabanlı algılama ile moleküler teşhis, yüksek tanısal doğruluğa ve sonuçlar için hızlı geri dönüş süreleri, uygun basit okumalar ve karmaşık aletlere ihtiyaç duyulmaması gibi bakım noktası ortamlarında kullanıma uygun özelliklere sahiptir. Bununla birlikte, birçok bileşeni ve manuel kullanım adımları nedeniyle reaksiyonların bakım noktasında gerçekleştirilmesi zahmetli olabilir. Burada, önceden karıştırılan ve daha sonra kolayca saklanan ve kullanıma hazır formatlarda dondurularak kurutulan rekombinaz bazlı izotermal amplifikasyon ve CRISPR bazlı reaktifler ile hastalık patojenlerinin ve genetik belirteçlerin sağlam tespiti için adım adım, optimize edilmiş bir protokol sunuyoruz. Önceden karıştırılmış, dondurularak kurutulmuş reaktifler, hemen kullanım için yeniden sulandırılabilir ve yüksek amplifikasyon ve algılama verimliliklerini koruyabilir. Ayrıca, tespit platformunu daha geniş tanılama/genetik test toplulukları için daha erişilebilir hale getirmek amacıyla, CRISPR tabanlı tanılama için önceden karıştırılmış, dondurularak kurutulmuş reaktifler hazırlanırken ve kullanılırken yaygın olarak bulunan sorunlar için bir sorun giderme kılavuzu sağlıyoruz.

Giriş

Nükleik asit biyobelirteçlerinin tespiti için CRISPR tabanlı tanı ilk olarak 2017'de^{rapor edildi 1,2,3,4} ve o zamandan beri, özellikle Şiddetli Akut Solunum Sendromu Koronavirüs 2 (SARS-CoV-2) RNA'sının tespiti için Gıda ve İlaç Dairesi (FDA) onaylı testlerle yeni nesil tanı olarak kanıtlanmıştır, birden fazla ülkede ^5,6,7,8. Koronavirüs hastalığı 2019'un (COVID-19) ötesinde, teknolojilerin çeşitli virüs ve bakterileri ^{9,10,11,12,13}, genetik hastalık mutasyonlarını ve delesyonlarını tespit etmek için etkili olduğu gösterilmiştir ve protein ve küçük moleküllü biyobelirteçleri tespit etmek için tasarlanabilir ^2,12. CRISPR tabanlı tanılama genellikle rekombinaz polimeraz amplifikasyonu (RPA) veya döngü aracılı izotermal amplifikasyon (LAMP)^14,15 gibi izotermal amplifikasyon yöntemlerini, hedef tanımadan sonra "teminatal" endonükleaz aktivitesi ile RNA kılavuzluğunda CRISPR ile ilişkili (Cas) enzimler kullanılarak CRISPR tabanlı algılama ile birleştirir³. İzotermal amplifikasyon ve CRISPR tabanlı tespitin ikili kullanımı, teknolojilere, özellikle altın standart polimeraz zincir reaksiyonununkine (PCR) yaklaşan yüksek tanısal doğruluk ve tek nükleotid polimorfizmleri dahil olmak üzere küçük dizi farklılıklarını çoğullama ve tespit etme yeteneği olmak üzere birçok arzu edilen özellik kazandırır ^1,9.

Bununla birlikte, CRISPR tabanlı tanılamanın en doğru sürümleri, birden fazla bileşen ve adım içerir ve uzman olmayan kişilerle veya bakım noktasında (POC) gerçekleştirilmesi karmaşık olabilir. Yüksek doğrulukta CRISPR tabanlı tanılamaların kullanımını POC ayarlarına genişletmeye yönelik bu zorluğun üstesinden gelmek için, kullanımı ve depolanması kolay olan önceden karıştırılmış, liyofilize, rekombinaz tabanlı izotermal amplifikasyon ve CRISPR tabanlı algılama reaksiyonları hazırlamak için protokoller geliştirdik⁷. Bu protokoller, CRISPR tabanlı tanılama⁷ için gerekli biyokimyasal bileşenlerin üretimi hakkında ek^{bilgiler, tasarım} kılavuzları¹ ve alternatif izotermal amplifikasyon teknikleri ^2,14,15,16 ve Cas enzimleri¹² kullanan formülasyonlar içeren CRISPR tabanlı tanılama¹⁴ üzerindeki mevcut mükemmel protokolleri tamamlamalıdır. Sonuç olarak, CRISPR tabanlı teşhislerin, taşınabilir ve enstrümantal içermeyen analizlerin gerekli olduğu ortamlarda hızlı, ucuz ve hassas nükleik tespitin gerçekleştirilmesine yardımcı olabileceğini umuyoruz ^1,9,17.

Protokollerimizde öncelikle RPA ve Cas13 tabanlı algılama kombinasyonunu kullanıyoruz. RPA, ortama yakın sıcaklıklarda (37-42 °C) çalışır ve bu nedenle düşük enerji ve ekipman gereksinimlerine sahiptir. Diğer izotermal amplifikasyon reaksiyonları daha yüksek sıcaklıklar gerektirir (LAMP, 60-65 °C; iplikçik yer değiştirme amplifikasyonu (SDA), 60 °C; üstel amplifikasyon reaksiyonu (EXPAR), 55 °C; ve helikaz bağımlı amplifikasyon (HDA), 65 °C)². RPA primerlerinin tasarımı da LAMP primerlerinin aksine karmaşık değildir ve çoğullanmış amplifikasyon 7,9,14'e genişletilebilir. RPA ile iki hedefin ötesinde çoğullama pratikte zor olsa da, paraziti en aza indirmek için çoğullanmış RPA primerlerinin nasıl tasarlanacağına dair net yönergeler vardır¹⁸.

Taşıma kontaminasyonu iki adımlı iş akışında büyük bir sorun olmaya devam ederken, RPA'nın üretilen amplikonlarının boyutu küçüktür ve LAMP^14'ün büyük birleştirici amplikonlarına kıyasla taşınma kontaminasyonuna neden olma olasılığı daha düşüktür. RPA primerleri standart yönergelere¹⁴ göre tasarlanabilir: genellikle 25-35 nükleotid uzunluğundadırlar ve erime sıcaklıkları 54 ila 67 °C'dir. Amplikon boyutu 200 baz çiftinden küçük olmalıdır. Ters transkriptaz enzimi (RT), RNA'dan amplifikasyonu sağlamak için RPA'ya eklenebilir ve ters transkripsiyon-RPA'da (RT-RPA), elde edilen RNA'nın çözülmesine yardımcı olmak için tipik olarak başka bir enzim Ribonükleaz H (RNaz H) eklenir: DNA hibriti ve amplifikasyon reaksiyonunu teşvik eder ^5,19. Cas13 tabanlı tespit için T7 transkripsiyonuna izin vermek için, T7 RNA polimeraz promotörü, ileri RPA primerinin 5' ucuna yerleştirilebilir.

RPA'dan amplikonlar üretildikten sonra, crRNA programlı Cas enzimleri ile tespit edilebilirler. Amplikon tespiti için kullanılabilecek çeşitli Cas enzimleri arasında, yüksek bölünme aktiviteleri¹ ve iyi karakterize edilmiş polinükleotid bölünme tercihleri ^7,9 nedeniyle RNA hedefli Cas13 varyantlarını tercih ediyoruz, ikincisi çoğullanmış tespit için kullanılabilir. Cas13 için crRNA dizisi, ara parça ve doğrudan tekrar (DR) dizileri ile üretilen RNA'daki hedef bölgeye tamamlayıcı (ters tamamlayıcı) olacak şekilde tasarlanmıştır. Arka planı ve yanlış pozitifleri artıran hedef dışı amplifikasyon ürünlerinin istenmeyen Cas tabanlı tespitini önlemek için crRNA dizisi ve RPA primerleri üst üste gelmemelidir¹⁴.

Cas tabanlı algılama, raportör nükleik asit moleküllerinin bölünmesini izlemek için farklı algılama modalitelerine dayanır (Cas13 tabanlı reaksiyonlar için RNA raportörleri)^1,2,14. Farklı algılama modaliteleri arasında kolorimetri, elektrokimyasal okumalar, floresan, sıralama okumaları ve yanal akış şeritleri² bulunur. Tek bir mavi LED ışık kaynağı kullanılarak etkili bir şekilde uyarılabilen siyanin 5 (Cy5), rodamin X (ROX) ve karboksifloresein (FAM) gibi çeşitli floroforlar ve raportörler verilen floresan okumasına odaklanıyoruz ve floresanları bir mikroplaka okuyucu veya gerçek zamanlı bir termal döngüleyici ^7,14 tarafından analiz edildi. Ek olarak, floresan okumanın kurulumu kolaydır ve gerçek zamanlı kantitasyon sağlayan sürekli izlemeye izin verir. Cas enzimleri kullanılarak çoğullanmış RPA preamplifikasyonu ve çoğullanmış Cas13 tabanlı algılama, birden fazla genetik hedefin^aynı anda tespiti için çok renkli floresan okumaları ile birleştirilebilir ^2,7.

Protokollerimizde, önce RNA örneğini RT-RPA reaktifinin liyofilize formuna ekleyerek RNA'yı RT-RPA ile izotermal olarak çoğaltıyoruz (Şekil 1). RT-RPA sırasında, T7 promotörü, oluşturulan çift sarmallı DNA ampliconuna eklenir. Daha sonra RPA ürünleri, yine T7 RNA polimeraz içeren liyofilize Cas13 tabanlı algılamaya aktarılır. Bu tespit reaksiyonu, DNA amplikonlarını RNA'ya (T7 RNA polimeraz aracılığıyla) dönüştürecektir, bu da crRNA programlanmış Cas13 ile kolayca tespit edilebilir. Hedefle aktive edilen Cas13, tespit edilebilir floresan sinyali ^2,7,14 üretmek için raportör molekülleri parçalayacaktır. Buradaki protokoller Leptotrichia wadei (LwaCas13a) tarafından tespit ile ilgili olsa da, ortogonal Cas13 ve Cas12 enzimleri ^7,9 kullanılarak dört adede kadar hedefin eşzamanlı, çoğullanmış tespitine genişletilebilir. RPA ve Cas tabanlı algılama reaksiyonları, hassasiyet kaybıyla da olsa tek bir tüpte birleştirilebilir¹⁴.

Şekil 1: CRISPR tabanlı algılama iş akışı. İş akışı, iki hedef genin tespitini gösterir. İlk olarak, DNA hedefi içindeki ilgi alanları RPA ile izotermal olarak amplifiye edilir; reaksiyon, RNA hedefleri tespit edilirken ters transkripsiyon (RT-RPA) ile gerçekleştirilebilir. Daha sonra, T7 transkripsiyonu, dsDNA amplikonlarını RNA'lara dönüştürür ve bu da hedef bağlanma üzerine kollateral RNaz aktivitesini ortaya çıkarabilen Cas13-crRNA kompleksleri tarafından tanınır. Söndürülmüş floresan raportörlerinin bölünmesi, bir mikroplaka okuyucu kullanılarak izlenebilen, bir LED transilluminatör tarafından görselleştirilebilen veya gerçek zamanlı bir termal döngüleyici ile kullanılabilen floresan sinyalleri üretir. Kısaltmalar: CRISPR = Kümelenmiş Düzenli Aralıklı Kısa Palindromik Tekrarlar; RT = ters transkripsiyon; RPA = rekombinaz polimeraz amplifikasyonu; Cas = CRISPR ile ilişkili protein; LED = ışık yayan diyot. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Burada sunulan protokollerin temel özellikleri, liyofilizasyon için ön karıştırma formülasyonlarıdır. Ön karıştırma, reaksiyon kullanımını basitleştirir ve tekrarlanabilirliği artırır, ancak RPA ve Cas tabanlı algılama içindeki birçok bileşen, özellikle ters transkripsiyon ve ATP gibi bazı kararsız kofaktörler çözeltide kararlı değildir. Bu nedenle, önceden karıştırılmış çözeltileri, uzun süreli depolama ve kolay taşıma ve dağıtım için dondurularak kurutulabilecek şekilde formüle ediyoruz ^1,9,20. Önceden karıştırılmış, dondurularak kurutulmuş reaktifler, reaksiyonu¹⁰ yeniden oluşturmak için daha yüksek numune hacmi (ve dolayısıyla daha yüksek DNA/RNA girişi) eklenebileceğinden, algılama hassasiyetinin iyileştirilmesine de yardımcı olur. Formülasyonlarımızda, liyofilize RPA ve Cas bazlı tespit reaksiyonlarında kriyoprotektan olarak öncelikle trehaloz²¹ kullanıyoruz⁷. Reaktif korumasına ek olarak, trehaloz ayrıca enzim stabilizasyonunu ^16,22,23,24 artırarak ve dsDNA^23'ün erime sıcaklıklarını azaltarak reaksiyonları teşvik eder. Trehalozun ötesindeki diğer stabilizatörlerin^5,7,21,25,26 araştırılması, farklı kullanım senaryoları için daha da optimal formülasyonlar sağlayabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. Liyofilize RT-RPA önceden karıştırılmış reaktiflerin hazırlanması

1. Ekipman hazırlığı
   1. Reaksiyonların hızlı dondurulması için bir sıvı nitrojen dewar veya tepsi hazırlayın. Dewar'ı veya tepsiyi sıvı nitrojenle doldurun.
   2. Dondurarak kurutucu
      1. Boşaltma borularında ve haznenin iç kısmında yoğuşan su olup olmadığını kontrol edin; Gerekirse suyu çıkarın.
      2. Haznenin içini ve 1.5 mL mikrosantrifüj tüpü metal rafını RNase dekontaminasyon solüsyonu ve ardından %70 etanol ile temizleyin.
      3. Hazne kapısını ve vakum tahliye vanasını kapatın.
      4. Dondurarak kurutma makinesini açın.
      5. Raf sıcaklığını manuel olarak -30 °C'ye ayarlayın.
   3. Moleküler biyoloji ekipmanları
      1. Aşağıdakileri RNase dekontaminasyon solüsyonu ile temizleyin: pipetler, pipet ucu rafları, bir vorteks karıştırıcı, bir döndürme mini santrifüjü ve kalıcı bir işaretleyici.
      2. Aşağıdakileri musluk suyuyla temizleyin, ardından temizleme kağıdı ile silin: mikrosantrifüj tüpleri için plastik raflar ve buz için bir köpük kutu.
      3. RNase dekontaminasyon solüsyonu ve% 70 etanol ile temizleyerek bir ısıtma bloğu (triglisin solüsyonunu çözmek/yeniden çözündürmek için kullanılır) hazırlayın. Ardından açın ve sıcaklığı 60 °C'ye ayarlayın.
2. Önceden karıştırılmış RPA reaksiyonlarının hazırlanması
   NOT: Bu formülasyon 10 reaksiyon içindir (üç RPA peleti kullanılarak).
   1. Kullanmadan önce triglisin çözeltisinde herhangi bir çökelti olup olmadığını kontrol edin. Çökeltiler varsa, bunları 60 °C'de inkübe ederek ve kullanmadan önce iyice karıştırarak çözün. Diğer ısıya duyarlı reaktifleri eklemeden önce triglisin çözeltisini soğutun.
      NOT: Tüp uzun süre oda sıcaklığında bırakılırsa çökeltiler kolayca oluşabilir.
   2. Dondurucudan üç RPA pelet şeridi tüpünü çıkarın; Beyaz peletleri çıkarmak için şerit tüplerini laboratuvar tezgahına hafifçe vurarak hafifçe vurun.
   3. Üç peleti de 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpü A'ya aktarın.
   4. Şerit tüplerinde kalan RPA tozunu durulamak için 25 μL nükleaz içermeyen su pipetleyin ve durulama solüsyonunu yeni bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpü B'ye aktarın.
   5. Mastermix tüpü B'ye 10 μL 0.57 M triglisin çözeltisi ve 10 μL primer karışımı (her biri 10 μM) ekleyin.
   6. Vorteks karışım tüpü B; Sonra aşağı çevirin ve tüpü buzun üzerine yerleştirin.
   7. 28,4 μL 5x RPA tamponu (500 μL %50 (a/h) PEG20000, 250 μL 1 M Tris pH 7.4 ve 100 μL 100 mM ditiyotreitolden (DTT) hazırlanır) ekleyin) mastermix tüpü B'ye ve birden çok kez güçlü bir şekilde vurarak veya çalkalayarak iyice karıştırın.
      NOT: RPA peletlerini çözündürmek için her şeyi eklemeden önce, mastermix tüpündeki PEG'nin viskozitesini seyreltmeye/azaltmaya yardımcı olmak için çözeltiyi bu şekilde yapıyoruz.
   8. Adım 1.2.3'ten itibaren tüp A'da toplanan peletleri mastermix tüpü B'ye aktarın ve ardından karıştırmak için mastermix tüpünü birkaç kez ters çevirin. Çözeltinin homojen ve monofazik görünüp görünmediğini gözlemleyin (ayrıca biraz opak görünecektir) ve ardından tüpü buzun üzerine yerleştirin.
      NOT: Karıştırma kapsamlı değilse, PEG çözeltinin/süspansiyonun faz ayrışmasına neden olabilir.
   9. Mastermix tüpüne 0.71 μL 200 Birim / μL RT ve 2.84 μL 5 Birim / μL RNase H ekleyin. Mastermix tüpünü birçok kez yukarı ve aşağı hafifçe vurun veya ters çevirin. Döndürün ve tüpü buzun üzerine yerleştirin.
      NOT: RT ve RNase H, karıştırma nedeniyle kesmeye duyarlı olduğundan, bu enzimleri önceki adımların yoğun bir şekilde karıştırılmasından sonra ekliyoruz; RT / RNase H ilavesinden sonra daha fazla girdap yok.
   10. 8.4 μL mastermix solüsyonunu önceden soğutulmuş 10 adet 1.5 mL tüpe ekleyin ve tüpleri buzun üzerine yerleştirin. Bunu yapmak için, pipet ucunu mastermix solüsyonuna daldırın ve hava kabarcıklarının oluşmasını önlemek ve doğru hacim ölçümünü sağlamak için mastermix solüsyonunu yavaş ve sabit bir şekilde uca çekin. Mastermix çözeltisini önceden soğutulmuş 1,5 ml'lik bir tüpe dağıtın.
       NOT: 8.4 μL aliquoted ile, deneyimlerimize göre, mastermix tüpünde ~ 1-2 μL süspansiyon kalacaktır. Deneyci, 10 reaksiyonun tümü için yeterli reaktif sağlamak için alikotasyon hacmini hafifçe azaltabilir. Viskoz çözeltileri tutarken uygun pipetleme tekniklerini kullanın.
   11. Alıntılama tamamlandıktan sonra, tüpleri liyofilizasyona hazırlamak için sıvı nitrojene batırılmış metal bir rafa yerleştirin. Tüplerin 5 dakika boyunca sıvı nitrojene batırılmasına izin verin.
       NOT: Liyofilizasyon fazla çözeltiyi ortadan kaldırdığı için daha fazla DNA/RNA girişi eklememize izin verir, bu da hassasiyeti artırmaya yardımcı olur. Dondurularak kurutulmuş önceden karıştırılmış RPA reaksiyonları -20 °C'de 8 ay saklanabilir. Liyofilizasyon, belirli bir deney aynı partide hazırlanan RPA mastermixleri kullanılarak gerçekleştirilirse tekrarlanabilirliğe yardımcı olur, bu nedenle daha büyük bir parti yapmak da yardımcı olur.
3. Liyofilizasyon
   1. Dondurarak kurutucuda toplayıcı ve raf sıcaklıklarını kontrol edin. Gerekirse, kolektör sıcaklığı -75 ± 5 °C'ye ve raf sıcaklığı -30 ± 1 °C'ye ulaşana kadar bekleyin.
   2. Metal raftaki açık tüpleri bir temizleme kağıdı ile örtün, metal rafı açık tüplerle birlikte dondurarak kurutucu rafına yerleştirin ve raf kapağını kapatın.
   3. Tablo 1'de gösterilen programı seçin ve başlat'a basın. İkincil kurutma adımından 30 dakika sonra (20 °C, <0,1 mbar; adımın süresi "sonsuz" olarak ayarlanarak sıcaklık sonsuz tutulur), programı durdur düğmesine basın.
      NOT: Suyun yoğunlaşmasını önlemek için tüplerin dondurarak kurutucuda ısınmasına izin veriyoruz.
   4. Vakum tahliye vanasını açarak basıncı boşaltın, ardından rafı raftan çıkarın. Tüpleri hemen kapatın ve liyofilize reaksiyonları -20 °C'de saklayın.
      NOT: Liyofilize RPA ve CRISPR-Cas13a önceden karıştırılmış reaksiyonlar -20 °C'de 8 ay süreyle saklanabilir.

2. Liyofilize CRISPR-Cas13a önceden karıştırılmış tespit reaktiflerinin hazırlanması

NOT: Ekipman hazırlığı için adım 1.1'i izleyin.

1. CRISPR-Cas13a önceden karıştırılmış reaksiyon hazırlığı (10 reaksiyon)
   1. Aşağıdaki öğeleri depodan çıkarın ve buzun üzerine koyun: 10 μL LwaCas13a (şirket içinde üretilir ^7,8,14) (2 mg/mL), Cas depolama tamponu, 10 ng/μL (225 nM) crRNA, 25 mM rNTP, 50 Birim/μL T7 RNA polimeraz, 2 μM FAM floresan raportör.
   2. 148.8 μL Cas depolama tamponu (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 0.6 M NaCl, %5 Gliserol, 2 mM DTT) ekleyerek 126 μg/mL'de (900 nM) bir çalışma LwaCas13a çözeltisi hazırlayın.
   3. CRISPR-Cas13a mastermix reaksiyonunu aşağıdaki gibi hazırlayın: 71 μL RNaz içermeyen su, 20 μL 400 mM Tris pH 7.4, 20 μL %60 (a/h) trehaloz, 10 μL 10 ng/μL (225 nM) crRNA (burada, SARS-CoV-2'nin s ve n genlerini hedefleyen), 8 μL 100 mM rNTP karışımı (her biri 25 mM), 6 μL 50 Birim/μL T7 RNA polimeraz, 25 μL 2 μM FAM floresan raportörü ve 10 μL 126 μg/mL (900 nM) LwaCas13a. Mastermix tüpünü ters çevirerek iyice karıştırın; Ardından aşağı döndürün.
   4. Mastermix'in 17 μL'sini buz üzerine yerleştirilmiş 10 adet 1.5 mL'lik tüpe alın. Tüpleri sıvı nitrojene batırılmış bir rafa yerleştirin ve tüplerin 5 dakika boyunca sıvı nitrojene batırılmasına izin verin.
2. Liyofilizasyon
   1. Dondurarak kurutucuda kolektör ve raf sıcaklıklarını kontrol edin ve kolektör sıcaklığı -75 ± 5 °C'ye ve raf sıcaklığı -30 ± 1 °C'ye ulaşana kadar bekleyin.
   2. Tüpleri dondurarak kurutma makinesine yerleştirin. Tablo 1'de gösterilen programı seçin ve başlat'a basın. İkincil kurutma adımından 30 dakika sonra (25 °C, <0,1 mbar; adımın süresi "sonsuz" olarak ayarlanarak sıcaklık sonsuz tutulur), programı durdurun .
   3. Vakum tahliye vanasını açarak basıncı boşaltın ve rafı raftan çıkarın. Tüpleri hemen kapatın ve liyofilize reaksiyonları -20 °C'de saklayın.
      NOT: Liyofilize RPA ve CRISPR-Cas13a önceden karıştırılmış reaktifler -20 °C'de 8 ay saklanabilir.

3. RT-RPA nükleik asit amplifikasyonu

NOT: Çapraz kontaminasyonu önlemek için, çalışma alanı alanları ve pipetleyiciler amplifikasyon öncesi, numune ekleme ve amplifikasyon sonrası için ayrılmalıdır. Filtreli pipet uçları kullanmanızı öneririz.

1. Termal çalkalama inkübatörünü 42 °C'de önceden ısıtın.
2. 1 μL magnezyum asetat (Mg(OAc)₂) ve potasyum asetat (KOAc) çözelti karışımı (196 mM Mg(OAc)₂ ve 1.5 M KOAc'den oluşur) liyofilize, önceden karıştırılmış RT-RPA peletini içeren tüpün yan tarafına ekleyin (bölüm 1'den).
   NOT: Mg(OAc)₂ ve KOAc karışımını eklemek için bir püf noktası: damla, tüpün yaklaşık 1 mL hacim işaretine yerleştirilmelidir. Burada, düşüş açıkça görülecektir ve tüpün kapatılmasından veya diğer işlemlerden dolayı kaybolması muhtemel değildir. Amplifikasyon, tüpün altındaki damlayı toplamak için aşağı döndükten sonra başlayacaktır. Aynı anda birden fazla reaksiyon işlenirken, amplifikasyon aynı anda başlatılabilir.
3. 12.4 μL RNA numunesi (veya kontrol numuneleri) ekleyerek RT-RPA peletini yeniden süspanse edin.
   NOT: Ekleme sırası negatif numune/negatif kontrol, test edilecek RNA/DNA, pozitif numune/pozitif kontroldür.
4. RT-RPA reaksiyonunu başlatmak için, oda sıcaklığında 3 saniye boyunca bir döndürme mini santrifüj kullanarak eklenen çözeltiyi adım 3.2 ve 3.3'ten kısaca aşağı döndürün.
5. Tüpü dikkatlice vurarak karıştırın ve ardından 3 saniye boyunca kısa bir sıkma daha yapın.
6. Reaksiyonu önceden ısıtılmış bir ısıtma bloğuna veya termal çalkalama inkübatörüne yerleştirerek 42 ° C'de 60 dakika inkübe edin.
7. Reaksiyonun sona ermesinden sonra, CRISPR-Cas algılama adımına geçmeden önce reaksiyon tüplerini çıkarın ve buzun üzerine yerleştirin (bölüm 4).
   NOT: RPA ile güçlendirilmiş ürün, algılama reaksiyonunda hemen kullanılabilir veya 4 °C'de birkaç gün veya -20 °C'de birkaç ay saklanabilir.

4. CRISPR-Cas13 nükleik asit tespiti

1. Bir floresan mikroplaka okuyucuyu açın, ısıtma sıcaklığını 37 °C'ye ayarlayın ve önceden ısıtın ve Tablo 2'de gösterilen programı seçin.
2. Buzun üzerine 384 oyuklu bir plaka yerleştirin.
3. 17 μL 8 mM magnezyum klorür çözeltisi ekleyerek liyofilize CRISPR-Cas önceden karıştırılmış algılama reaksiyonunu (bölüm 2'den) yeniden askıya alın. Tüpü dikkatlice vurarak karıştırın; Daha sonra 3 saniye boyunca kısa bir süre döndürün ve tüpü buzun üzerine yerleştirin.
4. 18 μL'lik yeniden askıya alınmış reaksiyon karışımını, buz üzerinde önceden soğutulmuş 384 oyuklu plakanın her bir kuyucuğuna aktarın.
5. Her bir reaksiyon kuyucuğuna 3. bölümde hazırlanan RPA ürününden 2 μL ilave ediniz.
6. Plakayı buzdan çıkarın, hızlı bir şekilde önceden ısıtılmış bir floresan mikroplaka okuyucusuna yerleştirin ve başlat düğmesine basın.
   NOT: 384 oyuklu plaka önceden ısıtılmış bir floresan mikroplaka okuyucusuna aktarıldığında reaksiyon başlatmanın senkronizasyonuna izin vermek için buz üzerine 384 oyuklu bir plaka yerleştirildi.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

SARS-CoV-2'nin s ve n genlerinin birlikte tespitinden FAM floresan sinyali üretiminin kinetiğini ve bilgilerin liyofilize, önceden karıştırılmış reaksiyon formülasyonları için en uygun koşulları belirlemek için nasıl kullanıldığını vurguluyoruz. Tüm durumlarda, protokollerin daha iyi hassasiyetle farklılaşmasına izin vermek için, belirlenen tespit limiti (LoD) (C_t ~ 31-33) dahilinde C t_{değerlerine sahip} numuneleri ve LoD'...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu protokolde kritik adımlar var. Alan ayrımı için, nükleik asit ekstraksiyonu, mastermix hazırlama (ön amplifikasyon alanı), numune ekleme ve amplikon tespiti (amplifikasyon sonrası alan) için ayrı boşluklar kullanılması önerilir. Her alan ayrı bir araç ve gereç seti kullanılarak ayarlanmalıdır. Aletleri bir alandan başka bir alana, özellikle amplifikasyon sonrası alandan ön amplifikasyon alanına getirmeyin. Çalışma alanlarının temizlenmesi gereklidir: ça...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material
Betaine solution	Sigma-Aldrich	B0300-1VL
DEPC-Treated water	Invitrogen	AM9915G
Dithiothreitol (DTT)	Merck	3870-25GM
EpiScript reverse transcriptase	Lucigen	ERT12925K
Gly-Gly-Gly	Sigma-Aldrich	SIA-50239-1G
LwaCas13a	Producing in-house		Strain name:Leptotrichia wadei, Abbreviation: Lwa, Protein name: LwaCas13a
Magnesium chloride solution, 1M	Sigma-Aldrich	M1028-10X1ML
NxGenT7 RNA polymerase	Lucigen	30223-2
Poly(ethylene glycol)	Sigma-Aldrich	81300-1KG
Potassium acetate solution, 5M	Sigma-Aldrich	95843-100ML-F
Riobnucleotide Solution Mix	NEB	N0466L
RNase H	NEB	M0297L
Sucrose	TCI	TCI-S0111-500G
Trehalose Dihydrate	Sigma-Aldrich	SIA-90210-50G
Trizma hydrochloride solution, 1M, pH 7.4	Sigma-Aldrich	T2194-100ML
TwistAmp Basic kit	TwistDx	TABAS03KIT
Equipment
BluPAD Dual LED Blue/White light transilluminator	Bio-Helix	BP001CU
Dry Bath Dual Block	ELITE	4-2-EL-02-220	Model: EL-02
Fluorescence microplate reader	Tecan	30050303	Model: Infinite 200 Pro
Freeze dryer	LABCONCO	794001030	FreeZone Triad Benchtop Freeze Dryer
Microplate 384-well	Greiner	GDE0784076	F-Bottom, small volume, Hibase, Med. Binding, Black
Real-time thermal cycler (CFX Connect Real-Time PCR System)	Bio-Rad	185-5201	Model: CFX Connect Optics Module
Oligonucleotide
s-gene forward RPA primer	IDT		GAAATTAATACGACTCAC TATAGGGAGGTTTCAAAC TTTACTTGCTTTACATAGA
s-gene reverse RPA primer	IDT		TCCTAGGTTGAAGA TAACCCACATAATAAG
n-gene forward RPA primer	IDT		GAAATTAATACGACTC ACTATAGGAACTTCTC CTGCTAGAATGGCTG
n-gene reverse RPA primer	IDT		CAGACATTTTGCTCTC AAGCTGGTTCAATC
LwaCas13a-crRNA for the s gene	Synthego		GAUUUAGACUACCCCAAAAAC GAAGGGGACUAAAACGCAGCA CCAGCUGUCCAACCUGAAGAAG
LwaCas13a-crRNA for the n gene	Synthego		GAUUUAGACUACCCCAAAAACG AAGGGGACUAAAACAAAGCAAG AGCAGCAUCACCGCCAUUGC
FAM-polyU-IABkFQ reporter	IDT		56-FAM/rUrUrUrUrU/3IABkFQ
O-hannah_cytb_F RPA primer	IDT		GAAATTAATACGACTCACTA TAGGGTACGGATGAACCATA CAAAACCTTCACGCAATCG
O-hannah_cytb_R RPA primer	IDT		AAGATCCATAGTAGATTC CTCGTGCGATGTGGATA
synT7crRNA13a_ O_hannah	IDT		GCGCATCCATATTCTTCAT CTGCATTTAGTTTTAGTCC CCTTCGTTTTTGGGGTA GTCTAAATCCCCTATAGT GAGTCGTATTAATTTC