Diagnostics basés sur CRISPR au point d’intervention avec réactifs prémélangés et lyophilisés

Résumé

Ici, nous présentons la préparation étape par étape de l’amplification isotherme prémélangée et lyophilisée basée sur la recombinase et des réactions basées sur CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats), qui peuvent être utilisées pour la détection de biomarqueurs d’acides nucléiques d’agents pathogènes de maladies infectieuses ou d’autres marqueurs génétiques d’intérêt.

Résumé

Le diagnostic moléculaire par détection basée sur CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) a une grande précision diagnostique et des attributs qui conviennent à une utilisation sur le lieu d’intervention, tels que des délais d’exécution rapides pour les résultats, des lectures simples et pratiques et l’absence d’instruments compliqués. Cependant, les réactions peuvent être lourdes à réaliser sur le lieu d’intervention en raison de leurs nombreux composants et des étapes de manutention manuelles. Dans ce document, nous fournissons un protocole optimisé étape par étape pour la détection robuste des agents pathogènes et des marqueurs génétiques avec une amplification isotherme basée sur la recombinase et des réactifs basés sur CRISPR, qui sont prémélangés puis lyophilisés dans des formats faciles à stocker et prêts à l’emploi. Les réactifs prémélangés et lyophilisés peuvent être réhydratés pour une utilisation immédiate et conserver des efficacités d’amplification et de détection élevées. Nous fournissons également un guide de dépannage pour les problèmes couramment rencontrés lors de la préparation et de l’utilisation de réactifs prémélangés et lyophilisés pour les diagnostics basés sur CRISPR, afin de rendre la plate-forme de détection plus accessible aux communautés plus larges de diagnostic/tests génétiques.

Introduction

Le diagnostic basé sur CRISPR pour la détection de biomarqueurs d’acides nucléiques a été signalé pour la première fois en 2017 1,2,3,4, et depuis lors, il a fait ses preuves en tant que diagnostic de nouvelle génération avec des tests approuvés par la Food and Drug Administration (FDA), en particulier pour la détection de l’ARN du coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère 2 (SRAS-CoV-2), dans plusieurs pays ^5,6,7,8. Au-delà de la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19), les technologies se sont avérées efficaces pour détecter divers virus et bactéries 9,10,11,12,13, des mutations et des délétions de maladies génétiques, et peuvent être modifiées pour détecter des biomarqueurs de protéines et de petites molécules ^2,12. Les diagnostics basés sur CRISPR combinent souvent des méthodes d’amplification isotherme, telles que l’amplification par polymérase recombinase (RPA) ou l’amplification isotherme médiée par boucle (LAMP)^14,15, avec une détection basée sur CRISPR utilisant des enzymes associées à CRISPR (Cas) guidées par ARN avec une activité endonucléase « collatérale » après la reconnaissance de la cible³. La double utilisation de l’amplification isotherme et de la détection basée sur CRISPR confère plusieurs attributs souhaitables aux technologies, en particulier une précision de diagnostic élevée proche de celle de la réaction en chaîne par polymérase (PCR) de référence, et la capacité de multiplexer et de détecter de petites différences de séquence, y compris les polymorphismes mononucléotidiques ^1,9.

Cependant, les versions les plus précises des diagnostics basés sur CRISPR contiennent plusieurs composants et étapes et peuvent être compliquées à réaliser avec des non-experts ou sur le lieu d’intervention (POC). Pour relever ce défi d’étendre l’utilisation de diagnostics basés sur CRISPR très précis aux paramètres POC, nous avons développé des protocoles pour préparer des réactions d’amplification isotherme prémélangées, lyophilisées, basées sur la recombinase et des réactions de détection basées sur CRISPR, qui sont faciles à utiliser et à stocker⁷. Ces protocoles devraient compléter les excellents protocoles existants sur les diagnostics basés sur CRISPR¹⁴, qui contiennent des informations supplémentaires sur la production de composants biochimiques nécessaires aux diagnostics basés sur CRISPR⁷, les directives de conception¹ et les formulations utilisant des techniques alternatives d’amplification isotherme 2,14,15,16 et des enzymes Cas ¹². En fin de compte, nous espérons que les diagnostics basés sur CRISPR pourront aider à réaliser une détection nucléique rapide, peu coûteuse et sensible dans des environnements où des analyses portables et sans instrument sont nécessaires ^1,9,17.

Nous utilisons principalement la combinaison de la détection basée sur la RPA et Cas13 dans nos protocoles. La RPA fonctionne à des températures proches de la température ambiante (37-42 °C) et nécessite donc peu d’énergie et d’équipement. D’autres réactions d’amplification isotherme nécessitent des températures plus élevées (LAMP, 60-65 °C ; amplification par déplacement de brin (SDA), 60 °C ; réaction d’amplification exponentielle (EXPAR), 55 °C ; et amplification dépendante de l’hélicase (HDA), 65 °C)². La conception des amorces RPA n’est pas non plus complexe, contrairement aux amorces LAMP, et peut être étendue à l’amplification multiplexée ^7,9,14. Même si le multiplexage au-delà de deux cibles avec la RPA est difficile dans la pratique, il existe des directives claires sur la façon de concevoir des amorces RPA multiplexées pour minimiser les interférences¹⁸.

Bien que la contamination par transfert reste un problème majeur dans le flux de travail en deux étapes, les amplicons générés de RPA sont de petite taille et moins susceptibles de provoquer une contamination par transfert par rapport aux grands amplicons concatémériques de LAMP¹⁴. Les amorces RPA peuvent être conçues selon les directives standard¹⁴ : elles ont généralement une longueur de 25 à 35 nucléotides avec des températures de fusion de 54 à 67 °C. La taille de l’amplicon doit être inférieure à 200 paires de bases. L’enzyme transcriptase inverse (RT) peut être ajoutée à la RPA pour permettre l’amplification de l’ARN, et dans la transcription inverse-RPA (RT-RPA), une autre enzyme Ribonuclease H (RNase H) est généralement ajoutée en petites quantités pour aider à résoudre l’hybride ARN : ADN résultant et favoriser la réaction d’amplification ^5,19. Pour permettre la transcription de T7 pour la détection basée sur Cas13, le promoteur de l’ARN polymérase T7 peut être placé à l’extrémité 5' de l’amorce RPA directe.

Une fois que les amplicons sont générés à partir de la RPA, ils peuvent être détectés avec des enzymes Cas programmées par l’ARNcr. Parmi les diverses enzymes Cas qui peuvent être utilisées pour la détection d’amplicons, nous préférons les variants de Cas13 ciblant l’ARN en raison de leur activité de clivage élevée¹ et de leurs préférences de clivage polynucléotidique bien caractérisées ^7,9, ce dernier pouvant être utilisé pour la détection multiplexée. La séquence d’ARNcr de Cas13 est conçue pour être complémentaire (complément inverse) au site cible dans l’ARN produit avec des séquences d’espacement et de répétition directe (DR). La séquence d’ARNcr et les amorces RPA ne doivent pas se chevaucher, afin d’éviter la détection indésirable de produits d’amplification hors cible, ce qui augmente le bruit de fond et les faux positifs¹⁴.

La détection basée sur le cas repose sur différentes modalités de détection pour surveiller le clivage des molécules d’acide nucléique rapporteures (ARN rapporteurs pour les réactions basées sur Cas13)^1,2,14. Les différentes modalités de détection comprennent la colorimétrie, les lectures électrochimiques, la fluorescence, les lectures de séquençage et les bandes de flux latéral². Nous nous concentrons sur la lecture de la fluorescence à partir d’une variété de fluorophores et de rapporteurs tels que la cyanine 5 (Cy5), la rhodamine X (ROX) et la carboxyfluorescéine (FAM), qui peuvent être efficacement excités à l’aide d’une seule source de lumière LED bleue, et leur fluorescence analysée par un lecteur de microplaques ou un thermocycleur en temps réel ^7,14. De plus, la lecture de la fluorescence est facile à configurer et permet une surveillance continue, ce qui permet une quantification en temps réel. La préamplification RPA multiplexée et la détection multiplexée basée sur Cas13 à l’aide d’enzymes Cas peuvent être combinées avec des lectures de fluorescence multicolores pour la détection simultanée de plusieurs cibles génétiques ^2,7.

Dans nos protocoles, nous amplifions d’abord de manière isotherme l’ARN avec le RT-RPA en ajoutant l’échantillon d’ARN à la forme lyophilisée du réactif RT-RPA (Figure 1). Au cours de la RT-RPA, le promoteur T7 est ajouté à l’amplicon d’ADN double brin généré. Par la suite, les produits RPA sont transférés vers la détection lyophilisée basée sur Cas13, qui contient également de l’ARN polymérase T7. Cette réaction de détection convertira les amplicons d’ADN en ARN (via l’ARN polymérase T7), qui peut être facilement détecté avec Cas13 programmé par l’ARNcr. Cas13 activé par la cible clivra les molécules rapporteures pour produire un signal de fluorescence détectable ^2,7,14. Bien que les protocoles ici concernent la détection par Leptotrichia wadei (LwaCas13a), ils peuvent être étendus à la détection simultanée et multiplexée d’un maximum de quatre cibles à l’aide des enzymes orthogonales Cas13 et Cas12 ^7,9. Les réactions de détection basées sur la RPA et le Cas peuvent également être combinées dans un seul tube, bien qu’avec une perte de sensibilité¹⁴.

Figure 1 : Flux de travail de détection basé sur CRISPR. Le flux de travail illustre la détection de deux gènes cibles. Tout d’abord, les régions d’intérêt au sein de la cible d’ADN sont amplifiées de manière isotherme avec la RPA ; la réaction peut être réalisée par transcription inverse (RT-RPA) lors de la détection de cibles d’ARN. Par la suite, la transcription T7 convertit les amplicons d’ADNdb en ARN, qui sont à leur tour reconnus par des complexes Cas13-crRNA capables de déclencher une activité RNase collatérale lors de la liaison à la cible. Le clivage des rapporteurs de fluorescence éteints produit des signaux de fluorescence qui peuvent être surveillés à l’aide d’un lecteur de microplaques, visualisés par un transilluminateur LED ou utilisés avec un thermocycleur en temps réel. Abréviations : CRISPR = répétitions palindromiques courtes groupées et régulièrement espacées ; RT = transcription inverse ; RPA = amplification par polymérase recombinase ; Cas = protéine associée à CRISPR ; LED = diode électroluminescente. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les principales caractéristiques des protocoles présentés ici sont les formulations de prémélange pour la lyophilisation. Le prémélange simplifie l’utilisation de la réaction et améliore la reproductibilité, mais de nombreux composants de la détection basée sur la RPA et Cas, en particulier la transcription inverse et certains cofacteurs labiles tels que l’ATP, ne sont pas stables en solution. Par conséquent, nous formulons les solutions prémélangées de manière à ce qu’elles puissent être lyophilisées pour un stockage à long terme et un transport et un déploiement faciles ^1,9,20. Des réactifs prémélangés et lyophilisés contribuent également à améliorer la sensibilité de détection, car un volume d’échantillon plus élevé (et donc un apport d’ADN/ARN plus élevé) peut être ajouté pour reconstituer la réaction¹⁰. Dans nos formulations, nous utilisons principalement le tréhalose²¹ comme cryoprotecteur dans les réactions de détection lyophilisées basées sur la RPA et le cas⁷. En plus de la préservation des réactifs, le tréhalose favorise également les réactions en augmentant la stabilisation enzymatique 16,22,23,24 et en diminuant les températures de fusion de l’ADNdb 23. L’exploration d’autres stabilisants 5,7,21,25,26 au-delà du tréhalose pourrait produire des formulations encore plus optimales pour différents scénarios d’utilisation.

Protocole

1. Préparation de réactifs prémélangés RT-RPA lyophilisés

1. Préparation de l’équipement
   1. Préparez un dewar ou un plateau d’azote liquide pour la congélation instantanée des réactions. Remplissez le dewar ou le plateau avec de l’azote liquide.
   2. Lyophilisateur
      1. Vérifiez qu’il n’y a pas d’eau condensée dans les tubes de vidange et à l’intérieur de la chambre ; Retirez l’eau si nécessaire.
      2. Nettoyez l’intérieur de la chambre et le support métallique du tube de microcentrifugation de 1,5 ml avec une solution de décontamination RNase, suivie d’éthanol à 70 %.
      3. Fermez la porte de la chambre et la soupape de décharge de vide.
      4. Allumez le lyophilisateur.
      5. Réglez manuellement la température de l’étagère sur -30 °C.
   3. Equipement de biologie moléculaire
      1. Nettoyez les éléments suivants avec une solution de décontamination RNase : des pipettes, des supports de pointes de pipettes, un mélangeur vortex, une minicentrifugeuse à visser et un marqueur permanent.
      2. Nettoyez les éléments suivants avec de l’eau du robinet, puis essuyez avec du papier chiffon de nettoyage : des supports en plastique pour les tubes de microcentrifugation et une boîte en mousse pour la glace.
      3. Préparez un bloc chauffant (utilisé pour dissoudre/resolbiliser la solution de triglycine) en le nettoyant avec une solution de décontamination RNase et de l’éthanol à 70 %. Ensuite, allumez-le et réglez la température à 60 °C.
2. Préparation de réactions RPA prémélangées
   REMARQUE : Cette formulation est pour 10 réactions (en utilisant trois pastilles de RPA).
   1. Vérifiez s’il y a du précipité dans la solution de triglycine avant utilisation. S’il y a des précipités, dissolvez-les en les incubant à 60 °C et en mélangeant soigneusement avant utilisation. Refroidissez la solution de triglycine avant d’ajouter d’autres réactifs sensibles à la chaleur.
      REMARQUE : Les précipités peuvent se former facilement si le tube est laissé à température ambiante pendant une période prolongée.
   2. Retirer trois tubes de bandes de granulés RPA du congélateur ; Tapotez les tubes de bande en les frappant doucement contre la paillasse du laboratoire pour déloger les pastilles blanches.
   3. Transférez les trois pastilles dans un tube de microcentrifugation A de 1,5 ml.
   4. Pipeter 25 μL d’eau sans nucléase pour rincer toute poudre RPA restante dans les tubes à bandelettes et transférer la solution de rinçage dans un nouveau tube de microcentrifugation B de 1,5 mL.
   5. Ajouter 10 μL de la solution de triglycine 0,57 M et 10 μL de mélange d’amorce (10 μM chacun) dans le tube mastermix B.
   6. Vortex-mix tube B; Ensuite, tournez vers le bas et placez le tube sur de la glace.
   7. Ajoutez 28,4 μL du tampon RPA 5x (préparé à partir de 500 μL de 50 % (p/v) PEG20000, 250 μL de 1 M Tris pH 7,4 et 100 μL de 100 mM de dithiothréitol (DTT)) dans le tube mastermix B et mélangez soigneusement en tapotant fortement ou en secouant plusieurs fois.
      REMARQUE : Nous fabriquons la solution de cette manière pour aider à diluer/diminuer la viscosité du PEG dans le tube mastermix, avant d’ajouter tout pour solubiliser les granulés de RPA.
   8. Transférez les granulés collectés dans le tube A de l’étape 1.2.3 dans le tube mastermix B, puis retournez le tube mastermix plusieurs fois pour mélanger. Observez si la solution semble homogène et monophasique (elle aura également l’air légèrement opaque), puis placez le tube sur de la glace.
      REMARQUE : Si le mélange n’est pas complet, le PEG peut provoquer la séparation de phase de la solution/suspension.
   9. Ajoutez 0,71 μL de RT 200 unités/μL et 2,84 μL de RNase H 5 unités/μL dans le tube mastermix. Tapotez doucement ou retournez le tube mastermix de haut en bas à plusieurs reprises. Tournez et placez le tube sur de la glace.
      REMARQUE : Nous ajoutons ces enzymes après un mélange lourd des étapes précédentes, car la RT et la RNase H sont sensibles au cisaillement dû au mélange ; plus de vortex après l’ajout de RT/RNase H.
   10. Aliquote 8,4 μL de la solution mastermix dans 10 tubes prérefroidis de 1,5 mL et placer les tubes sur de la glace. Pour ce faire, plongez la pointe de la pipette dans la solution mastermix et aspirez la solution mastermix dans la pointe lentement et régulièrement pour éviter la formation de bulles d’air et pour assurer une mesure précise du volume. Versez la solution mastermix dans un tube pré-refroidi de 1,5 ml.
       REMARQUE : Avec 8,4 μL aliquoteé, d’après notre expérience, il restera ~1-2 μL de suspension dans le tube mastermix. L’expérimentateur peut ajuster légèrement le volume d’aliquotage vers le bas pour garantir suffisamment de réactifs pour les 10 réactions. Utilisez des techniques de pipetage appropriées lorsque vous manipulez des solutions visqueuses.
   11. Une fois l’aliquotage terminé, placez les tubes dans un support métallique immergé dans de l’azote liquide pour les préparer à la lyophilisation. Laissez les tubes être immergés dans de l’azote liquide pendant 5 min.
       REMARQUE : Comme la lyophilisation élimine l’excès de solution, elle nous permet d’ajouter plus d’entrée d’ADN / ARN, ce qui aide à augmenter la sensibilité. Les réactions RPA prémélangées lyophilisées peuvent être conservées à -20 °C pendant 8 mois. La lyophilisation aide à la reproductibilité si une expérience donnée est réalisée à l’aide de mastermixes RPA préparés dans le même lot, donc la fabrication d’un lot plus important est également utile.
3. Lyophilisation
   1. Au lyophilisateur, vérifiez la température du collecteur et de l’étagère. Si nécessaire, attendez que la température du collecteur atteigne -75 ± 5 °C et que la température de l’étagère atteigne -30 ± 1 °C.
   2. Couvrez les tubes ouverts dans le support métallique avec une feuille de papier lingette de nettoyage, placez le support métallique avec les tubes ouverts dans l’étagère de la lyophilisatrice et fermez la porte de l’étagère.
   3. Sélectionnez le programme indiqué dans le Tableau 1 et appuyez sur Démarrer. Après 30 min de l’étape de séchage secondaire (20 °C, <0,1 mbar ; la température est maintenue en continu en réglant le temps de l’étape sur « infini  »), appuyez sur arrêter le programme.
      REMARQUE : Nous laissons les tubes se réchauffer dans le lyophilisateur pour éviter la condensation de l’eau.
   4. Relâchez la pression en ouvrant la soupape de décharge du vide, puis retirez le rack de l’étagère. Boucher immédiatement les tubes et stocker les réactions lyophilisées à -20 °C.
      REMARQUE : Les réactions prémélangées RPA lyophilisées et CRISPR-Cas13a peuvent être stockées à -20 °C pendant 8 mois.

2. Préparation de réactifs de détection prémélangés CRISPR-Cas13a lyophilisés

REMARQUE : Suivez l’étape 1.1 pour la préparation de l’équipement.

1. Préparation de réaction prémélangée CRISPR-Cas13a (10 réactions)
   1. Retirez les articles suivants de l’entreposage et placez-les sur de la glace : 10 μL de LwaCas13a (produit en interne^{7, 8, 14}) (2 mg/mL), tampon de stockage Cas, 10 ng/μL (225 nM) d’ARNcr, 25 mM de rNTP, 50 unités/μL d’ARN polymérase T7, 2 μM de rapporteur de fluorescence FAM.
   2. Préparez une solution de travail de LwaCas13a à 126 μg/mL (900 nM) en ajoutant 148,8 μL de tampon de stockage Cas (50 mM de Tris-HCl pH 7,4, 0,6 M de NaCl, 5 % de glycérol, 2 mM de DTT) à 10 μL de 2 mg/mL de LwaCas13a.
   3. Préparez la réaction du mastermix CRISPR-Cas13a comme suit : 71 μL d’eau exempte de RNase, 20 μL de 400 mM de Tris pH 7,4, 20 μL de tréhalose à 60 % (p/v), 10 μL d’ARNcr de 10 ng/μL (225 nM) (ici, ciblant les gènes s et n du SARS-CoV-2), 8 μL de mélange rNTP de 100 mM (25 mM chacun), 6 μL d’ARN polymérase T7 de 50 unités/μL, 25 μL de rapporteur de fluorescence FAM de 2 μM et 10 μL de LwaCas13a de 126 μg/mL (900 nM). Bien mélanger en inversant le tube mastermix ; Ensuite, tournez-vous.
   4. Aliquote 17 μL du mastermix dans 10 tubes de 1,5 mL placés sur de la glace. Placez les tubes dans un support immergé dans de l’azote liquide et laissez les tubes être immergés dans de l’azote liquide pendant 5 min.
2. Lyophilisation
   1. Au lyophilisateur, vérifiez la température du collecteur et de l’étagère et attendez que la température du collecteur atteigne -75 ± 5 °C et que la température de l’étagère atteigne -30 ± 1 °C.
   2. Placez les tubes dans le lyophilisateur. Sélectionnez le programme indiqué dans le Tableau 1 et appuyez sur Démarrer. Après 30 min de l’étape de séchage secondaire (25 °C, <0,1 mbar ; la température est maintenue en continu en réglant le temps de l’étape sur « infini »), arrêtez le programme.
   3. Relâchez la pression en ouvrant la soupape de décharge du vide et retirez le rack de l’étagère. Boucher immédiatement les tubes et stocker les réactions lyophilisées à -20 °C.
      REMARQUE : Les réactifs prémélangés RPA et CRISPR-Cas13a lyophilisés peuvent être conservés à -20 °C pendant 8 mois.

3. Amplification des acides nucléiques RT-RPA

REMARQUE : Pour éviter la contamination croisée, les zones de travail et les pipettes doivent être séparées pour la préamplification, l’ajout d’échantillons et la post-amplification. Nous vous recommandons d’utiliser des pointes de pipette filtrées.

1. Préchauffez un incubateur à agitation thermique à 42 °C.
2. Ajouter 1 μL de mélange de solution d’acétate de magnésium (Mg(OAc)₂) et d’acétate de potassium (KOAc) (composé de 196 mM de Mg(OAc)₂ et de 1,5 M de KOAc) sur le côté du tube contenant la pastille de RT-RPA lyophilisée et prémélangée (voir la section 1).
   REMARQUE : Une astuce pour ajouter le mélange Mg(OAc)₂ et KOAc : la goutte doit être placée autour de la marque de volume de 1 mL du tube. Ici, la chute sera clairement visible et ne risque pas d’être perdue lors de la fermeture du tube ou d’autres actions. L’amplification commencera après avoir tourné vers le bas pour collecter la goutte au fond du tube. Lors du traitement de plus d’une réaction à la fois, l’amplification peut être initiée simultanément.
3. Remettez en suspension la pastille de RT-RPA en ajoutant 12,4 μL de l’échantillon d’ARN (ou des échantillons de contrôle).
   REMARQUE : La séquence d’addition est échantillon négatif/contrôle négatif, ARN/ADN à tester, échantillon positif/contrôle positif.
4. Pour initier la réaction RT-RPA, faites tourner brièvement la solution ajoutée des étapes 3.2 et 3.3 à l’aide d’une minicentrifugeuse à température ambiante pendant 3 s.
5. Mélangez en tapotant soigneusement le tube, puis faites un autre bref essorage pendant 3 s.
6. Incuber la réaction à 42 °C pendant 60 min en la plaçant dans un bloc chauffant préchauffé ou un incubateur à agitation thermique.
7. Après la fin de la réaction, sortez les tubes de réaction et placez-les sur de la glace avant de passer à l’étape de détection CRISPR-Cas (section 4).
   REMARQUE : Le produit amplifié par RPA peut être utilisé immédiatement dans la réaction de détection ou peut être stocké à 4 °C pendant plusieurs jours ou à -20 °C pendant plusieurs mois.

4. Détection des acides nucléiques CRISPR-Cas13

1. Allumez un lecteur de microplaques à fluorescence, réglez et préchauffez la température de chauffage à 37 °C et sélectionnez le programme indiqué dans le tableau 2.
2. Placez une assiette de 384 puits sur de la glace.
3. Remettre en suspension la réaction de détection prémélangée CRISPR-Cas lyophilisée (section 2) en ajoutant 17 μL de solution de chlorure de magnésium à 8 mM. Mélangez en tapotant soigneusement le tube ; Ensuite, tournez brièvement pendant 3 s et placez le tube sur de la glace.
4. Transférez 18 μL du mélange réactionnel remis en suspension dans chaque puits de la plaque prérefroidie à 384 puits sur de la glace.
5. Ajouter 2 μL du produit RPA préparé à la section 3 dans chaque puits de réaction.
6. Retirez la plaque de la glace, placez-la rapidement dans un lecteur de microplaques à fluorescence préchauffé et appuyez sur Démarrer.
   REMARQUE : Une plaque de 384 puits a été placée sur de la glace pour permettre la synchronisation de l’initiation de la réaction lorsque la plaque de 384 puits est transférée dans un lecteur de microplaques à fluorescence préchauffé.

Résultats

Nous mettons en évidence la cinétique de la génération du signal de fluorescence FAM à partir de la détection combinée des gènes s et n du SRAS-CoV-2, et comment l’information a été utilisée pour déterminer les conditions optimales pour les formulations de réaction lyophilisées et prémélangées. Dans tous les cas, nous avons inclus des échantillons avec des valeurs de C_t bien en deçà de la limite de détection déterminée (C_t ...

Discussion

Il y a des étapes critiques dans ce protocole. Pour la ségrégation de zone, il est recommandé d’utiliser des espaces séparés pour l’extraction des acides nucléiques, la préparation du mastermix (zone de préamplification), l’ajout d’échantillons et la détection d’amplicons (zone de post-amplification). Chaque zone doit être réglée à l’aide d’un ensemble distinct d’outils et d’équipements. N’apportez pas d’outils d’une zone à une autre, en particuli...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material
Betaine solution	Sigma-Aldrich	B0300-1VL
DEPC-Treated water	Invitrogen	AM9915G
Dithiothreitol (DTT)	Merck	3870-25GM
EpiScript reverse transcriptase	Lucigen	ERT12925K
Gly-Gly-Gly	Sigma-Aldrich	SIA-50239-1G
LwaCas13a	Producing in-house		Strain name:Leptotrichia wadei, Abbreviation: Lwa, Protein name: LwaCas13a
Magnesium chloride solution, 1M	Sigma-Aldrich	M1028-10X1ML
NxGenT7 RNA polymerase	Lucigen	30223-2
Poly(ethylene glycol)	Sigma-Aldrich	81300-1KG
Potassium acetate solution, 5M	Sigma-Aldrich	95843-100ML-F
Riobnucleotide Solution Mix	NEB	N0466L
RNase H	NEB	M0297L
Sucrose	TCI	TCI-S0111-500G
Trehalose Dihydrate	Sigma-Aldrich	SIA-90210-50G
Trizma hydrochloride solution, 1M, pH 7.4	Sigma-Aldrich	T2194-100ML
TwistAmp Basic kit	TwistDx	TABAS03KIT
Equipment
BluPAD Dual LED Blue/White light transilluminator	Bio-Helix	BP001CU
Dry Bath Dual Block	ELITE	4-2-EL-02-220	Model: EL-02
Fluorescence microplate reader	Tecan	30050303	Model: Infinite 200 Pro
Freeze dryer	LABCONCO	794001030	FreeZone Triad Benchtop Freeze Dryer
Microplate 384-well	Greiner	GDE0784076	F-Bottom, small volume, Hibase, Med. Binding, Black
Real-time thermal cycler (CFX Connect Real-Time PCR System)	Bio-Rad	185-5201	Model: CFX Connect Optics Module
Oligonucleotide
s-gene forward RPA primer	IDT		GAAATTAATACGACTCAC TATAGGGAGGTTTCAAAC TTTACTTGCTTTACATAGA
s-gene reverse RPA primer	IDT		TCCTAGGTTGAAGA TAACCCACATAATAAG
n-gene forward RPA primer	IDT		GAAATTAATACGACTC ACTATAGGAACTTCTC CTGCTAGAATGGCTG
n-gene reverse RPA primer	IDT		CAGACATTTTGCTCTC AAGCTGGTTCAATC
LwaCas13a-crRNA for the s gene	Synthego		GAUUUAGACUACCCCAAAAAC GAAGGGGACUAAAACGCAGCA CCAGCUGUCCAACCUGAAGAAG
LwaCas13a-crRNA for the n gene	Synthego		GAUUUAGACUACCCCAAAAACG AAGGGGACUAAAACAAAGCAAG AGCAGCAUCACCGCCAUUGC
FAM-polyU-IABkFQ reporter	IDT		56-FAM/rUrUrUrUrU/3IABkFQ
O-hannah_cytb_F RPA primer	IDT		GAAATTAATACGACTCACTA TAGGGTACGGATGAACCATA CAAAACCTTCACGCAATCG
O-hannah_cytb_R RPA primer	IDT		AAGATCCATAGTAGATTC CTCGTGCGATGTGGATA
synT7crRNA13a_ O_hannah	IDT		GCGCATCCATATTCTTCAT CTGCATTTAGTTTTAGTCC CCTTCGTTTTTGGGGTA GTCTAAATCCCCTATAGT GAGTCGTATTAATTTC