Diagnostics basés sur CRISPR au point d’intervention avec réactifs prémélangés et lyophilisés

Résumé

Ici, nous présentons la préparation étape par étape de l’amplification isotherme prémélangée et lyophilisée basée sur la recombinase et des réactions basées sur CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats), qui peuvent être utilisées pour la détection de biomarqueurs d’acides nucléiques d’agents pathogènes de maladies infectieuses ou d’autres marqueurs génétiques d’intérêt.

Résumé

Le diagnostic moléculaire par détection basée sur CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) a une grande précision diagnostique et des attributs qui conviennent à une utilisation sur le lieu d’intervention, tels que des délais d’exécution rapides pour les résultats, des lectures simples et pratiques et l’absence d’instruments compliqués. Cependant, les réactions peuvent être lourdes à réaliser sur le lieu d’intervention en raison de leurs nombreux composants et des étapes de manutention manuelles. Dans ce document, nous fournissons un protocole optimisé étape par étape pour la détection robuste des agents pathogènes et des marqueurs génétiques avec une amplification isotherme basée sur la recombinase et des réactifs basés sur CRISPR, qui sont prémélangés puis lyophilisés dans des formats faciles à stocker et prêts à l’emploi. Les réactifs prémélangés et lyophilisés peuvent être réhydratés pour une utilisation immédiate et conserver des efficacités d’amplification et de détection élevées. Nous fournissons également un guide de dépannage pour les problèmes couramment rencontrés lors de la préparation et de l’utilisation de réactifs prémélangés et lyophilisés pour les diagnostics basés sur CRISPR, afin de rendre la plate-forme de détection plus accessible aux communautés plus larges de diagnostic/tests génétiques.

Introduction

Le diagnostic basé sur CRISPR pour la détection de biomarqueurs d’acides nucléiques a été signalé pour la première fois en 2017 1,2,3,4, et depuis lors, il a fait ses preuves en tant que diagnostic de nouvelle génération avec des tests approuvés par la Food and Drug Administration (FDA), en particulier pour la détection de l’ARN du coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère 2 (SRAS-CoV-2), dans plusieurs pays ^5,6,7,8

Protocole

1. Préparation de réactifs prémélangés RT-RPA lyophilisés

1. Préparation de l’équipement
   1. Préparez un dewar ou un plateau d’azote liquide pour la congélation instantanée des réactions. Remplissez le dewar ou le plateau avec de l’azote liquide.
   2. Lyophilisateur
      1. Vérifiez qu’il n’y a pas d’eau condensée dans les tubes de vidange et à l’intérieur de la chambre ; Retirez l’eau si nécessaire.
      2. Nettoyez l’intérieur de la chambre et le support métallique du tube de microcentrifugation de 1,5 ml avec une solution de décontamination RNase, suivie d’éthanol à 70 %.
      3. Fermez la po....

Discussion

Il y a des étapes critiques dans ce protocole. Pour la ségrégation de zone, il est recommandé d’utiliser des espaces séparés pour l’extraction des acides nucléiques, la préparation du mastermix (zone de préamplification), l’ajout d’échantillons et la détection d’amplicons (zone de post-amplification). Chaque zone doit être réglée à l’aide d’un ensemble distinct d’outils et d’équipements. N’apportez pas d’outils d’une zone à une autre, en particuli.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material
Betaine solution	Sigma-Aldrich	B0300-1VL
DEPC-Treated water	Invitrogen	AM9915G
Dithiothreitol (DTT)	Merck	3870-25GM
EpiScript reverse transcriptase	Lucigen	ERT12925K
Gly-Gly-Gly	Sigma-Aldrich	SIA-50239-1G
LwaCas13a	Producing in-house		Strain name:Leptotrichia wadei, Abbreviation: Lwa, Protein name: LwaCas13a
Magnesium chloride solution, 1M	Sigma-Aldrich	M1028-10X1ML
NxGenT7 RNA polymerase	Lucigen	30223-2
Poly(ethylene glycol)	Sigma-Aldrich	81300-1KG
Potassium acetate solution, 5M	Sigma-Aldrich	95843-100ML-F
Riobnucleotide Solution Mix	NEB	N0466L
RNase H	NEB	M0297L
Sucrose	TCI	TCI-S0111-500G
Trehalose Dihydrate	Sigma-Aldrich	SIA-90210-50G
Trizma hydrochloride solution, 1M, pH 7.4	Sigma-Aldrich	T2194-100ML
TwistAmp Basic kit	TwistDx	TABAS03KIT
Equipment
BluPAD Dual LED Blue/White light transilluminator	Bio-Helix	BP001CU
Dry Bath Dual Block	ELITE	4-2-EL-02-220	Model: EL-02
Fluorescence microplate reader	Tecan	30050303	Model: Infinite 200 Pro
Freeze dryer	LABCONCO	794001030	FreeZone Triad Benchtop Freeze Dryer
Microplate 384-well	Greiner	GDE0784076	F-Bottom, small volume, Hibase, Med. Binding, Black
Real-time thermal cycler (CFX Connect Real-Time PCR System)	Bio-Rad	185-5201	Model: CFX Connect Optics Module
Oligonucleotide
s-gene forward RPA primer	IDT		GAAATTAATACGACTCAC TATAGGGAGGTTTCAAAC TTTACTTGCTTTACATAGA
s-gene reverse RPA primer	IDT		TCCTAGGTTGAAGA TAACCCACATAATAAG
n-gene forward RPA primer	IDT		GAAATTAATACGACTC ACTATAGGAACTTCTC CTGCTAGAATGGCTG
n-gene reverse RPA primer	IDT		CAGACATTTTGCTCTC AAGCTGGTTCAATC
LwaCas13a-crRNA for the s gene	Synthego		GAUUUAGACUACCCCAAAAAC GAAGGGGACUAAAACGCAGCA CCAGCUGUCCAACCUGAAGAAG
LwaCas13a-crRNA for the n gene	Synthego		GAUUUAGACUACCCCAAAAACG AAGGGGACUAAAACAAAGCAAG AGCAGCAUCACCGCCAUUGC
FAM-polyU-IABkFQ reporter	IDT		56-FAM/rUrUrUrUrU/3IABkFQ
O-hannah_cytb_F RPA primer	IDT		GAAATTAATACGACTCACTA TAGGGTACGGATGAACCATA CAAAACCTTCACGCAATCG
O-hannah_cytb_R RPA primer	IDT		AAGATCCATAGTAGATTC CTCGTGCGATGTGGATA
synT7crRNA13a_ O_hannah	IDT		GCGCATCCATATTCTTCAT CTGCATTTAGTTTTAGTCC CCTTCGTTTTTGGGGTA GTCTAAATCCCCTATAGT GAGTCGTATTAATTTC