JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا يجمع بين التثقيب الكهربائي في الجسم الحي وإزالة التعصيب في عضلة الرافعة القحفية الطويلة (LAL). يتيح هذا الإجراء دراسة الدور المحتمل للبروتينات المشتقة من العضلات في تجديد المشبك العصبي العضلي.

Abstract

الوصلة العصبية العضلية (NMJ) هي المشبك المحيطي الذي يتحكم في تقلص ألياف العضلات الهيكلية للسماح بالحركة المنسقة للعديد من الكائنات الحية. في NMJ ، يتصل طرف المحور العصبي الحركي قبل المشبكي بمجال ما بعد المشبكي العضلي وتغطيه خلايا شوان الطرفية. تتعرض سلامة ووظيفة NMJ للخطر في ظل عدة ظروف ، بما في ذلك الشيخوخة والأمراض العصبية العضلية والإصابات الرضحية. لتحليل المساهمة المحتملة للبروتينات المشتقة من العضلات في الحفاظ على NMJ وتجديدها ، تم الجمع بين استراتيجية نقل الجينات في الجسم الحي مع إزالة تعصيب عضلة الرافعة القحفية الطويلة (LAL) بعد إصابة العصب الميكانيكي. أظهرت النتائج السابقة أن التعبير القسري لبروتينات الفلورسنت للتحكم لا يغير تنظيم NMJ أو النقل العصبي. يهدف هذا الإجراء إلى وصف طريقة مفصلة للتثقيب الكهربائي في الجسم الحي لعضلة LAL متبوعا بقطع أو سحق فرع معين من العصب الوجهي الذي يعصف عضلات الجمجمة ، مما يؤدي إلى إزالة التعصيب وإعادة التعصيب ، على التوالي. يشكل الجمع بين هذه الاستراتيجيات التجريبية في عضلة LAL المريحة طريقة فعالة لدراسة المساهمة المحتملة للإفراط في التعبير عن بروتين العضلات أو إسكاته في سياق إعادة تعصيب NMJ على المدى القصير.

Introduction

الوصلة العصبية العضلية (NMJ) هي المشبك المحيطي الذي يتحكم في تقلص العضلات ، وبشكل غير مباشر ، الحركة المنسقة للكائناتالحية 1. يتكون من طرف محوري حركي قبل المشبكي ، وهو مجال عضلي بعد المشبكي المخصب بمستقبلات الأستيل كولين (AChRs) ، وخلايا شوان الطرفية غير النخاعية التي تغطي محطة المحورالعصبي 2،3،4. عند إزالة التعصيب NMJ بسبب إصابة الأعصاب الطرفية الرضحية أو المرض أو التدخل الدوائي ، يفقد نشاط العضلات المقلصة5،6. نظرا لأن بعض البيئات الدقيقة المتساهلة تسمح بالتعافي الوظيفي في الوقت المناسب وبشكل فعال ، فإن البحث عن البروتينات التي يمكن أن تساعد في عملية التجديد يعد ضرورة دائمة. هنا ، تم الجمع بين إجراءين لتقييم الدور المحتمل للتلاعب بالتعبير عن بروتين العضلات على وجه التحديد في التجديد قصير المدى ل NMJ بعد إصابة الأعصاب.

العضلة الرافعة الطويلة (LAL) ، الموجودة على السطح الظهري للجمجمة ، هي عضلة رقيقة ومسطحة تتحكم في حركة الصيوان. تتكون عضلة LAL من عصابات منقارية وذيلية ، تحتوي كل منها على طبقتين أو ثلاث طبقات من ألياف العضلات7،8. يقوم الفرع الأذني الخلفي للعصب الوجهي بتعصيب عضلة LAL ، مما يولد نمط تعصيب موصوف جيدا يتكون من خمس مناطق تعصيب منقارية (R1-R5) ومنطقتين ذيليتين (C1-C2)8،9،10. LAL هي عضلة مكشوفة بشكل سطحي ويمكن الوصول إليها بسهولة ، لذلك يتطلب استخدامها إجراءات طفيفة التوغل. يسمح ذلك بتصور NMJ باستخدام الفحص المجهري في الوقت الفعلي ، وتوصيل الأدوية ، بالإضافة إلى تدخل مستحضرات العضلات الكاملة في كل من الجسم الحي وخارج الجسم الحي11،12. إجمالا ، تجعل هذه الميزات عضلة LAL نموذجا ممتازا لدراسة سلوك ووظيفة NMJ10،13.

في الجسم الحي التثقيب الكهربائي هو تقنية نقل الجينات التي تسمح بدمج الحمض النووي الخارجي في الأنسجة من خلال النفاذية العابرة لأغشية الخلايا وحركة الحمض النووي داخل الخلايا ، وكلاهما تم إنشاؤه بعد إحداث مجال كهربائي14،15. هذا الإجراء محلي ويمكن إجراؤه في أي مرحلة من مراحل نمو. بالنظر إلى السمات الفريدة لعضلة LAL ، فإن التثقيب الكهربائي في الجسم الحي يمثل إجراء طفيفا للتوغل وعالي الكفاءة وسريعا16 ، مما يجعل من الممكن مراقبة التعبير القوي للبروتين بعد يومين أو ثلاثة أيام من التثقيب الكهربائي.

تم استخدام إجراء سحق العصب الوجهي على نطاق واسع في البحث لأنه يوفر العديد من المزايا5،17،18. تم تعديل هذا البروتوكول سابقا لاستهداف الفرع الأذني الخلفي للعصب الوجهي الذي يعصب عضلات الجمجمة ، بما في ذلك عضلة LAL ، لتجنب شلل الوجه. وبالتالي ، لا تحتاج الفئران إلى عناية خاصة بعد الجراحة (على سبيل المثال ، مرهم العين المزلق لفقدان منعكس الوميض). نظرا لأن إعادة تعصيب NMJ في عضلة LAL يبدأ بين 7-9 أيام بعد الإصابة6 ، فهو نموذج جيد لإعادة التعصيب على المدى القصير مقارنة بنموذج إصابة سحق الأعصاب الشائع الاستخدام للعصب الوركي لإزالة أعصاب عضلات الأطراف الخلفية ، حيث يحدث التعصيب بعد حوالي ثلاثة أسابيع من إصابة الأعصاب18.

سيمكن الجمع بين التثقيب الكهربائي في الجسم الحي وإصابة العصب الوجهي في عضلة LAL الباحثين من تقييم سلوك المكونات المشبكية ضد تعديل البروتين المشتق من العضلات في أوقات مختلفة من تجديد NMJ ، بما في ذلك التأثيرات المورفولوجية قصيرة المدى وطويلة المدى6،16 ، من خلال مجموعة متنوعة من التقنيات بما في ذلك المقايسات الكيميائية المناعية والنسيجية والوظيفية.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات التجريبية من قبل لجنة أخلاقيات علم الأحياء في جامعة أستراليا دي تشيلي ، تشيلي (البروتوكول رقم 503/2023) ، واتبعت القواعد التي فرضتها لجنة أخلاقيات علم الأحياء التابعة للوكالة الوطنية للبحث والتطوير ، تشيلي (ANID) ، بالإضافة إلى المبادئ التوجيهية لتوجيه المجلس الأوروبي لرعاية المختبر. استخدمت الدراسة الحالية الفئران البالغة (3-6 أشهر) CF-1 من كلا الجنسين (30-45 جم). تم تحقيق القتل الرحيم عن طريق جرعة زائدة من التخدير المستنشق متبوعا بالإفراط في التخدير. الكواشف والمعدات المستخدمة في الدراسة مدرجة في جدول المواد.

1. في الجسم الحي LAL التثقيب الكهربائي للعضلات

  1. اعداد
    1. تخدير الفأر برفق في غرفة تحريض أكريليك تحت استنشاق 2.5٪ من الأيزوفلوران مع 0.8 لتر / دقيقة أكسجين (باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا). بعد ذلك ، حافظ على تخدير الفأر باستخدام قناع أنبوب الأنف المتصل بجهاز تخدير الاستنشاق تحت مجهر مجسم تشريح.
      ملاحظة: تأكد من أن الماوس نائما قبل بدء الإجراء ؛ اختبر منعكس اللمس للماوس عن طريق الضغط برفق على قدم واحدة باستخدام ملقط (قم بهذه الخطوة في كل مرة بعد تحفيز التخدير).
    2. تطهير منطقة عنق الرحم على مستوى خياطة السهمية للجمجمة باستخدام غلوكونات الكلورهيكسيدين المطهر 2٪ وحقن تحت الجلد 20 ميكرولتر من 2 مجم / مل هيالورونيداز في PBS باستخدام حقنة هاميلتون لتسهيل وصول بلازميد الحمض النووي إلى سطح العضلات.
    3. قم بإيقاف تشغيل تدفق الأيزوفلوران واسمح للفأر باستنشاق الأكسجين النقي لمدة 1 دقيقة.
    4. قم بوزن الماوس لحساب جرعة Meloxicam المناسبة (انظر الخطوة 1.3.2).
    5. ضع في قفص فارغ (بدون أي فراش) للتعافي من التخدير.
    6. أعد إلى السكن الطبيعي لمدة 30 دقيقة16.
  2. إجراء الجراحة
    1. أعد تخدير الفأر عن طريق استنشاق 2.5٪ من الأيزوفلوران بخليط أكسجين 0.8 لتر / دقيقة (باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا) والحفاظ عليه مخدرا طوال العملية الجراحية باستخدام جهاز التخدير الاستنشاقي ، تحت مجهر مجسيمي تشريح.
    2. احلق منطقة عنق الرحم باستخدام شفرة حلاقة ذات حدين وقم بتطهيرها بالكلورهيكسيدين و 70٪ إيثانول 3 مرات.
    3. قم بعمل شق 8 مم فوق الخيط السهمي للجمجمة وفضح عضلة LAL عن طريق إزالة الدهون والأنسجة الضامة الموجودة تحت الجلد مباشرة باستخدام المقص / الملقط.
      ملاحظة: العضلة LAL هي العضلات الأكثر سطحية في منطقة الجمجمة بعد شق الجلد. يمكن التعرف عليه بسهولة من خلال اتجاه ألياف العضلات التي تمتد قطريا من الجمجمة الوسطى باتجاه كل صيوان8،16.
    4. باستخدام حقنة هاميلتون ، قم بحقن 10 ميكرولتر من الحمض النووي الذي تم الحصول عليه تجاريا (0.8-1 ميكروغرام / ميكرولتر) في PBS في اللفافة الموزعة في جميع أنحاء العضلات ، لتشكيل فقاعة.
    5. ضع قطبين كهربائيين بإبرة ذهبية على بعد 5 مم ، متوازية ، وفوق ألياف العضلات ، وتحتل كامل طول عضلة LAL (الشكل 1 أ).
    6. باستخدام جهاز كهربائي ، قم بتوليد خمس نبضات 100 فولت / سم مدة كل منها 20 مللي ثانية ، بتردد 1 هرتز.
    7. كرر الإجراء في عضلة LAL المقابلة (تكرار الخطوات 1.2.4-1.2.6).
  3. خياطة واسترداد
    1. خياطة الجلد (حجم سلالة 5/0 ، إبرة HR15) بخيط حمض البولي جليكوليك القابل للامتصاص.
    2. حقن تحت الجلد المسكن Meloxicam بجرعات 1-2 ملغ/كغ من الوزن لتقليل آلام ما بعد الجراحة.
    3. قم بإيقاف تشغيل تدفق الأيزوفلوران واسمح للفأر باستنشاق الأكسجين النقي لمدة 1 دقيقة.
    4. ضع في قفص فارغ (بدون أي فراش) للتعافي من التخدير.
    5. أعد إلى مسكنه المعتاد وراقبه لمدة يومين بعد الجراحة أو حتى شفائه. راقب علامات الألم أو الإجهاد ، وخصص الدرجات لكل معلمة من المعلمات المختلفة مع مراعاة معايير نقطة النهاية الإنسانية الموضحة سابقا19.
      ملاحظة: ضع الماوس في وسادة ساخنة مغطاة بوسادة جراحية لمنع انخفاض درجة حرارة جسمه أثناء الجراحة. حاول ألا تأخذ أكثر من 30 دقيقة للعملية الجراحية ، وبالتالي منع الفأر من الموت بسبب التخدير الزائد. إذا كان البروتين المعبر عنه ينتج مستويات مضان منخفضة ، فمن المستحسن أن يتم التثقيف الكهربائي المشترك مع جهاز تتبع (على سبيل المثال ، tdTomato أو GFP) بنسبة 1: 5 (المتتبع: الحمض النووي المهم).

2. سحق إزالة التعصيب الناجم عن إصابة الأعصاب

ملاحظة: هذا البروتوكول هو تعديل لبروتوكول17 الموصوف سابقا. قم بتنفيذ هذا الإجراء بفارق لا يقل عن 3 أيام من التثقيب الكهربائي. اعتمادا على أسئلة البحث ، يمكن إجراء هذا الإجراء قبل أو بعد التثقيب الكهربائي.

  1. التخدير ووضع
    1. إجراء التخدير الحيواني في غرفة تحريض الأكريليك تحت استنشاق 2.5٪ من الأيزوفلوران مع 0.8 لتر / دقيقة أكسجين (باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا).
    2. قم بوزن الماوس لحساب جرعة Meloxicam (انظر الخطوة 2.3.2).
    3. حافظ على تخدير الفأر باستخدام قناع أنبوب الأنف المتصل بجهاز تخدير الاستنشاق تحت مجهر مجسم تشريح.
    4. ضع الماوس على جانبه الأيسر (لإزالة تعصيب عضلة LAL اليمنى). ألصق الأذن اليمنى باتجاه الأنف لكشف المنطقة الخلفية من الصيوان.
  2. إجراء الجراحة
    1. احلق المنطقة الخلفية من الصيوان باستخدام شفرة حلاقة ذات حدين وقم بتطهيرها بالكلورهيكسيدين و 70٪ إيثانول 3 مرات.
    2. حدد موقع الوريد الأذني الخلفي وقم بعمل شق في الجلد ، على بعد 2 مم منه ، بحوالي 5 مم باستخدام مقص زنبركي. تجنب قطع الأوعية الدموية و / أو الأنسجة العضلية.
    3. قطع الدهون والأنسجة الضامة بالملقط والمقص. العثور على العصب الملحق الشوكي; استمر حتى العثور على بطن العضلة الدوائية والقناة السمعية الغضروفية (نسيج أبيض شبه شفاف) (الشكل 2 أ).
    4. حدد موقع بداية العصب الوجهي المتفرع أسفل العضلة الدعصية مباشرة.
    5. اتبع الفرع الأذني الخلفي (الفرع الظهري للعصب الوجهي) ، وقم بإزالة النسيج الضام المحيط به برفق ، وتجنب التلاعب المباشر بالأعصاب بعناية.
    6. سحق الفرع الأذني الخلفي للعصب الوجهي لمدة 30 ثانية ، مع الضغط المستمر على العصب باستخدام ملقط بطرف بزاوية 45 درجة.
  3. خياطة واسترداد
    1. خياطة الجلد (حجم سلالة 5/0 ، إبرة HR15) بخيط حمض البولي جليكوليك القابل للامتصاص.
    2. حقن تحت الجلد المسكن Meloxicam بجرعات 1-2 ملغ/كغ من الوزن لتقليل آلام ما بعد الجراحة.
    3. قم بإزالة الشريط من الأذن ، وقم بإيقاف تشغيل تدفق الأيزوفلوران ، واسمح للفأر باستنشاق الأكسجين النقي لمدة 1 دقيقة.
    4. ضع في قفص فارغ (بدون أي فراش) للتعافي من التخدير.
    5. أعد الماوس إلى مسكنه العادي وراقبه لمدة يومين بعد الجراحة أو حتى شفائه.
    6. بعد الشفاء ، افحص الفأر بحثا عن فشل في حركة الأذن المصابة كعلامة على إزالة التعصيب بكفاءة.
      ملاحظة: في مكافحة الشام ، قم بعمل شق في الجلد ، وفضح العصب الوجهي دون لمسه مباشرة ، ثم خياطة لاحقا.

النتائج

إن العائد الكمي الفلوري العالي ل tdTomatoprotein 20 يجعله متتبعا مناسبا لكفاءة التثقيب الكهربائي. لذلك ، تم تقييم التعبير عن tdTomato في عضلات LAL عن طريق التثقيب الكهربائي في الجسم الحي (الشكل 1). تم تشريح عضلات LAL بعد 21 يوما من التثقيب الكهربائي. تظهر ...

Discussion

يعد الجمع بين التثقيب الكهربائي للعضلات في الجسم الحي وإزالة التعصيب نهجا تجريبيا قيما للتحقيق في مكانة متجددة في NMJ4. نظرا لأن عضلة LAL مكشوفة بشكل سطحي ، يمكن استكمال هذه الإجراءات المشتركة بسهولة بتوصيل مجسات أو أدوية يمكن أن تؤثر على تعبير البروتين أ?...

Disclosures

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

نشكر البيئة التعاونية والمحفزة للغاية لأعضاء NeSt Lab على المناقشة والتعليقات المفيدة على هذا العمل. يتم تمويل العمل في مختبر NeSt حاليا من قبل FONDECYT 1221213. تم إنشاء المخطط الوارد في الشكل 1 أ باستخدام BioRender.com.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
#5/45 Dumont forceps Fine Science Tools 11251-35Sterilize before use
anti 2H3DSHBDilute 1 : 300
anti S100 Ready to UseDakoIR504Dilute 1 : 5
anti SV2DSHBDilute 1 : 50
Chlorhexidine gluconate 2%DifenPharma
Cold light dissecting stereomicroscopeMoticModel SMZ-171
DAPIInvitrogenD1306Dilute 1 : 100
Dumont #5SF ForcepsFine Science Tools 11252-00Sterilize before use
Dumont Mini Forceps –Style 5Fine Science Tools 11200-14Sterilize before use
ECM 830 electroporatorBTX Harvard Apparatus
Gold needle-type electrodes Genetrodes, BTX45-011410 mm straight
Hamilton syringe Hamilton80400
HyaluronidaseSigma-AldrichH3884
Inhalation anesthesia machineSciVerma ScientificM3000 Table Top
IsofluraneBaxter218-082
MiceInstituto de Salud Publica - ChileAdult (3-6 months old) CF-1 mice, of both sexes (30-45 g) 
Razor bladesSchick
Suture Glicosorb 5/0TAGUMGS0812.JAbsorbable polyglycolic acid thread 
tdTomato plasmidAddgene54642tdTomato plasmid under the control of the CMV promoter
Tramadol hydrochloride 5% (Triamcol)Drag Pharma
Vannas Spring ScissorsFine Science Tools 91500-09Sterilize before use
WGA Alexa Fluor 488InvitrogenW7024Dilute
α-BTX Alexa Fluor 488 InvitrogenB13422Dilute 1 : 500

References

  1. Slater, C. R. The functional organization of motor nerve terminals. Prog Neurobiol. 134, 55-103 (2015).
  2. Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Development of the vertebrate neuromuscular junction. Annu Rev Neurosci. 22, 389-442 (1999).
  3. Darabid, H., Perez-Gonzalez, A. P., Robitaille, R. Neuromuscular synaptogenesis: Coordinating partners with multiple functions. Nat Rev Neurosci. 15 (11), 703-718 (2014).
  4. Zelada, D., Bermedo-Garcia, F., Collao, N., Henriquez, J. P. Motor function recovery: Deciphering a regenerative niche at the neuromuscular synapse. Biol Rev Camb Philos Soc. 96 (2), 752-766 (2021).
  5. Kobayashi, J., et al. The effect of duration of muscle denervation on functional recovery in the rat model. Muscle Nerve. 20 (7), 858-866 (1997).
  6. Bermedo-Garcia, F., Zelada, D., Martinez, E., Tabares, L., Henriquez, J. P. Functional regeneration of the murine neuromuscular synapse relies on long-lasting morphological adaptations. BMC Biol. 20 (1), 158 (2022).
  7. Erzen, I., Cvetko, E., Obreza, S., Angaut-Petit, D. Fiber types in the mouse levator auris longus muscle: A convenient preparation to study muscle and nerve plasticity. J Neurosci Res. 59 (5), 692-697 (2000).
  8. Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo. Neuromuscul Disord. 20 (11), 740-743 (2010).
  9. Murray, L. M., Talbot, K., Gillingwater, T. H. Review: Neuromuscular synaptic vulnerability in motor neurone disease: Amyotrophic lateral sclerosis and spinal muscular atrophy. Neuropathol Appl Neurobiol. 36 (2), 133-156 (2010).
  10. Murray, L. M., et al. Selective vulnerability of motor neurons and dissociation of pre-and postsynaptic pathology at the neuromuscular junction in mouse models of spinal muscular atrophy. Hum Mol Genet. 17 (7), 949-962 (2008).
  11. Wright, M., Kim, A., Son, Y. J. Subcutaneous administration of muscarinic antagonists and triple-immunostaining of the levator auris longus muscle in mice. J Vis Exp. (55), e3124 (2011).
  12. Zelada, D., Barrantes, F. J., Henríquez, J. P. Lithium causes differential effects on postsynaptic stability in normal and denervated neuromuscular synapses. Sci Rep. 11 (1), 17285 (2021).
  13. Klooster, R., et al. Muscle-specific kinase myasthenia gravis IgG4 autoantibodies cause severe neuromuscular junction dysfunction in mice. Brain. 135, 1081-1101 (2012).
  14. Mcmahon, J. M., Signori, E., Wells, K. E., Fazio, V. M., Wells, D. J. Optimisation of electrotransfer of plasmid into skeletal muscle by pretreatment with hyaluronidase: Increased expression with reduced muscle damage. Gene Ther. 8 (16), 1264-1270 (2001).
  15. Difranco, M., Quinonez, M., Capote, J., Vergara, J. DNA transfection of mammalian skeletal muscles using in vivo electroporation. J Vis Exp. (32), e1520 (2009).
  16. Ojeda, J., et al. The mouse levator auris longus muscle: An amenable model system to study the role of postsynaptic proteins to the maintenance and regeneration of the neuromuscular synapse. Front Cell Neurosci. 14, 225 (2020).
  17. Olmstead, D. N., et al. Facial nerve axotomy in mice: A model to study motoneuron response to injury. J Vis Exp. (96), e52382 (2015).
  18. Magill, C. K., et al. Reinnervation of the tibialis anterior following sciatic nerve crush injury: A confocal microscopic study in transgenic mice. Exp Neurol. 207 (1), 64-74 (2007).
  19. Lloyd, M., Wolfensohn, S. Practical use of distress scoring systems in the application of humane endpoints. Humane Endpoints in Animal Experiments for Biomedical Research. , 48-53 (1999).
  20. Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. Red fluorescent protein. Nat Biotechnol. 22 (12), 1567-1572 (2004).
  21. Perez, V., et al. The p75(ntr) neurotrophin receptor is required to organize the mature neuromuscular synapse by regulating synaptic vesicle availability. Acta Neuropathol Commun. 7 (1), 147 (2019).
  22. Boehm, I., et al. Comparative anatomy of the mammalian neuromuscular junction. J Anat. 237 (5), 827-836 (2020).
  23. Jones, R. A., et al. Cellular and molecular anatomy of the human neuromuscular junction. Cell Rep. 21 (9), 2348-2356 (2017).
  24. Jones, R. A., et al. NMJ-morph reveals principal components of synaptic morphology influencing structure-function relationships at the neuromuscular junction. Open Biol. 6 (12), 160240 (2016).
  25. Ma, C. H., et al. Accelerating axonal growth promotes motor recovery after peripheral nerve injury in mice. J Clin Invest. 121 (11), 4332-4347 (2011).
  26. Sakuma, M., et al. Lack of motor recovery after prolonged denervation of the neuromuscular junction is not due to regenerative failure. Eur J Neurosci. 43 (3), 451-462 (2016).
  27. Mir, L. M., et al. High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (8), 4262-4267 (1999).
  28. Kleeman, B., et al. A guide to choosing fluorescent protein combinations for flow cytometric analysis based on spectral overlap. Cytometry A. 93 (5), 556-562 (2018).
  29. Morris, L. M., Klanke, C. A., Lang, S. A., Lim, F. Y., Crombleholme, T. M. Tdtomato and EGFP identification in histological sections: Insight and alternatives. Biotech Histochem. 85 (6), 379-387 (2010).
  30. Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. The levator auris longus muscle of the mouse: A convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins. Neurosci Lett. 82 (1), 83-88 (1987).
  31. Sokołowska, E., Błachnio-Zabielska, A. U. A critical review of electroporation as a plasmid delivery system in mouse skeletal muscle. Int J Mol Sci. 20 (11), 2776 (2019).
  32. Pérez-García, M. J., Burden, S. J. Increasing musk activity delays denervation and improves motor function in ALS mice. Cell Rep. 2 (3), 497-502 (2012).
  33. Valdez, G., et al. Attenuation of age-related changes in mouse neuromuscular synapses by caloric restriction and exercise. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (33), 14863-14868 (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Auris Longus NMJ NMJ

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved