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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo che combina l'elettroporazione e la denervazione in vivo del muscolo elevatore cranico auris longus (LAL). Questa procedura consente lo studio del potenziale ruolo delle proteine di derivazione muscolare nella rigenerazione della sinapsi neuromuscolare.

Abstract

La giunzione neuromuscolare (NMJ) è la sinapsi periferica che controlla la contrazione delle fibre muscolari scheletriche per consentire il movimento coordinato di molti organismi. Al NMJ, un terminale dell'assone motorio presinaptico entra in contatto con un dominio postsinaptico muscolare ed è coperto da cellule di Schwann terminali. L'integrità e la funzione dell'NMJ sono compromesse in diverse condizioni, tra cui l'invecchiamento, le malattie neuromuscolari e le lesioni traumatiche. Per analizzare il potenziale contributo delle proteine di derivazione muscolare al mantenimento e alla rigenerazione della NMJ, è stata combinata una strategia di trasferimento genico in vivo con la denervazione del muscolo elevatore cranico auris longus (LAL) dopo una lesione meccanica del nervo. Risultati precedenti hanno dimostrato che l'espressione forzata delle proteine fluorescenti di controllo non altera l'organizzazione o la neurotrasmissione dell'NMJ. Questa procedura ha lo scopo di descrivere un metodo dettagliato di elettroporazione in vivo del muscolo LAL seguita da transezione o schiacciamento del ramo specifico del nervo facciale che innerva i muscoli cranici, portando rispettivamente alla denervazione e alla reinnervazione NMJ. La combinazione di queste strategie sperimentali nel muscolo LAL conveniente costituisce un metodo efficiente per studiare il potenziale contributo della sovraespressione o del silenziamento delle proteine muscolari nel contesto della reinnervazione NMJ a breve termine.

Introduzione

La giunzione neuromuscolare (NMJ) è la sinapsi periferica che controlla la contrazione muscolare e, indirettamente, il movimento coordinato degli organismi1. È formato da un terminale dell'assone motorio presinaptico, un dominio postsinaptico muscolare arricchito in recettori dell'acetilcolina (AChR) e cellule di Schwann terminali non mieliniche che coprono il terminale dell'assone 2,3,4. Dopo denervazione NMJ dovuta a lesione traumatica del nervo periferico, malattia o intervento farmacologico, l'attività muscolare contrattile viene persa 5,6. Poiché alcuni microambienti permissivi consentono un recupero funzionale tempestivo ed efficiente, la ricerca di proteine che potrebbero aiutare il processo di rigenerazione è una necessità permanente. Qui, due procedure sono state combinate per valutare in modo specifico il potenziale ruolo della manipolazione dell'espressione proteica muscolare nella rigenerazione a breve termine della NMJ dopo una lesione nervosa.

Il muscolo elevatore auris longus (LAL), situato sulla superficie dorsale del cranio, è un muscolo sottile e piatto che controlla il movimento del padiglione aurico. Il muscolo LAL è costituito da bande rostrali e caudali, ciascuna contenente due o tre strati di fibre muscolari 7,8. Il ramo auricolare posteriore del nervo facciale innerva il muscolo LAL, generando un modello di innervazione ben descritto costituito da cinque regioni di innervazione rostrale (R1-R5) e due caudali (C1-C2) 8,9,10. Il LAL è un muscolo esposto superficialmente e facilmente accessibile, quindi il suo utilizzo richiede procedure minimamente invasive. Ciò consente la visualizzazione dell'NMJ utilizzando la microscopia in tempo reale, la somministrazione di farmaci e l'intervento di preparazioni muscolari complete sia in vivo che ex vivo11,12. Complessivamente, queste caratteristiche rendono il muscolo LAL un modello eccellente per studiare il comportamento e la funzione NMJ 10,13.

L'elettroporazione in vivo è una tecnica di trasferimento genico che consente l'incorporazione di DNA esogeno nel tessuto attraverso la permeabilizzazione transitoria delle membrane cellulari e la mobilità del DNA all'interno delle cellule, entrambe generate dopo aver indotto un campo elettrico14,15. Questa procedura è locale e può essere eseguita in qualsiasi fase dello sviluppo dell'animale. Considerando le caratteristiche uniche del muscolo LAL, la sua elettroporazione in vivo rappresenta una procedura minimamente invasiva, altamente efficiente e rapida16, che consente di osservare una robusta espressione proteica due o tre giorni dopo l'elettroporazione.

La procedura di schiacciamento del nervo facciale è stata ampiamente impiegata nella ricerca in quanto offre numerosi vantaggi 5,17,18. Questo protocollo è stato precedentemente modificato per colpire specificamente il ramo auricolare posteriore del nervo facciale che innerva i muscoli cranici, incluso il muscolo LAL, per evitare la paralisi facciale; Di conseguenza, i topi non richiedono cure particolari dopo l'intervento chirurgico (ad esempio, unguento lubrificante per gli occhi per la perdita del riflesso dell'ammiccamento). Poiché la reinnervazione NMJ al muscolo LAL inizia tra 7-9 giorni dopo la lesione6, è un buon modello di reinnervazione a breve termine rispetto al modello di lesione da schiacciamento nervoso comunemente usato del nervo sciatico per denervare i muscoli degli arti posteriori, dove la reinnervazione si verifica circa tre settimane dopo la lesione nervosa18.

La combinazione di elettroporazione in vivo e lesione del nervo facciale al muscolo LAL consentirà ai ricercatori di valutare il comportamento dei componenti sinaptici contro la modulazione proteica di derivazione muscolare in diversi momenti della rigenerazione NMJ, compresi gli effetti morfologici a breve e lungo termine 6,16, attraverso un'ampia varietà di tecniche tra cui saggi immunoistochimici, istologici e funzionali.

Protocollo

Tutte le procedure sperimentali sono approvate dal Comitato di Bioetica dell'Universidad Austral de Chile, Cile (protocollo n. 503/2023), e hanno seguito le norme imposte dal Comitato di Bioetica dell'Agenzia Nazionale di Ricerca e Sviluppo del Cile (ANID), nonché le linee guida della Direttiva del Consiglio Europeo per la Cura degli Animali da Laboratorio. Il presente studio ha utilizzato topi adulti (3-6 mesi) CF-1 di entrambi i sessi (30-45 g). L'eutanasia è stata realizzata con un'overdose di anestetico inalante seguita da dissanguamento. I reagenti e le attrezzature utilizzate nello studio sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Elettroporazione muscolare LAL in vivo

  1. Preparazione
    1. Sedare delicatamente il topo in una camera di induzione acrilica sotto inalazione di isofluorano al 2,5% con 0,8 L/min di ossigeno (seguendo i protocolli istituzionalmente approvati). Successivamente, mantenere la sedazione del topo utilizzando una maschera per tubi nasali collegata a una macchina per anestesia per inalazione sotto uno stereomicroscopio da dissezione.
      NOTA: Assicurarsi che il mouse sia in modalità di sospensione prima di iniziare la procedura; Testare il riflesso tattile del mouse stringendo delicatamente un piede con una pinza (eseguire questo passaggio ogni volta dopo aver indotto l'anestesia).
    2. Disinfettare l'area cervicale a livello della sutura sagittale del cranio con l'antisettico clorexidina gluconato 2% e iniettare per via sottocutanea 20 μL di 2 mg/mL di ialuronidasi in PBS utilizzando una siringa di Hamilton per facilitare l'accesso del plasmide del DNA alla superficie muscolare.
    3. Spegnere il flusso di isofluorano e lasciare che il topo respiri ossigeno puro per 1 minuto.
    4. Pesare il mouse per calcolare la dose appropriata di Meloxicam (vedere il passaggio 1.3.2.).
    5. Metti l'animale in una gabbia vuota (senza lettiera) per riprendersi dall'anestesia.
    6. Riportare l'animale in un alloggio normale per 30 minuti16.
  2. Procedura chirurgica
    1. Anestetizzare nuovamente il topo mediante inalazione di isofluorano al 2,5% con una miscela di ossigeno da 0,8 L/min (seguendo i protocolli istituzionalmente approvati) e mantenerlo sedato durante la procedura chirurgica utilizzando una macchina per anestesia per inalazione, sotto uno stereomicroscopio da dissezione.
    2. Radere la zona cervicale utilizzando una lametta a doppio taglio e disinfettare con clorexidina ed etanolo al 70% 3 volte.
    3. Praticare un'incisione di 8 mm sulla sutura sagittale del cranio ed esporre il muscolo LAL rimuovendo delicatamente il grasso e il tessuto connettivo situati appena sotto la pelle usando forbici/pinze.
      NOTA: Il muscolo LAL è il muscolo più superficiale nella regione cranica dopo l'incisione cutanea. È facilmente riconoscibile dall'orientamento delle fibre muscolari che corrono diagonalmente dal cranio centrale verso ciascun padiglioneauricolare 8,16.
    4. Utilizzando una siringa di Hamilton, iniettare 10 μL del DNA ottenuto commercialmente (0,8-1 μg/μL) in PBS nella fascia che si distribuisce in tutto il muscolo, formando una bolla.
    5. Posizionare due elettrodi ad ago d'oro a 5 mm di distanza, paralleli e sopra le fibre muscolari, occupando l'intera lunghezza del muscolo LAL (Figura 1A).
    6. Utilizzando un elettroporatore, generare cinque impulsi di 100 V/cm della durata di 20 ms ciascuno, alla frequenza di 1 Hz.
    7. Ripetere la procedura nel muscolo LAL controlaterale (ripetendo i passaggi 1.2.4-1.2.6).
  3. Sutura e recupero
    1. Sutura (ceppo 5/0, ago HR15) la pelle con filo di acido poliglicolico riassorbibile.
    2. Iniettare per via sottocutanea l'analgesico Meloxicam in dosi di 1-2 mg/kg di peso per ridurre il dolore post-operatorio.
    3. Spegnere il flusso di isofluorano e lasciare che il topo respiri ossigeno puro per 1 minuto.
    4. Metti l'animale in una gabbia vuota (senza lettiera) per riprendersi dall'anestesia.
    5. Riporta l'animale nel suo stabulario abituale e monitoralo per 2 giorni dopo l'intervento chirurgico o fino alla sua guarigione. Monitorare i segni di dolore o stress, assegnando punteggi per ciascuno dei diversi parametri considerando i criteri del punto finale umano precedentemente descritti19.
      NOTA: Posizionare il mouse in un tappetino riscaldato coperto da un cuscinetto chirurgico per evitare che la temperatura corporea scenda durante l'intervento chirurgico. Cerca di non impiegare più di 30 minuti per la procedura chirurgica, evitando così che il topo muoia a causa dell'eccessiva anestesia. Se la proteina espressa produce bassi livelli di fluorescenza, si raccomanda di co-elettroporare con un tracciante (ad esempio, tdTomato o GFP) in un rapporto 1:5 (tracciante: DNA di interesse).

2. Denervazione indotta da lesione nervosa da schiacciamento

NOTA: Questo protocollo è una modifica di un protocollo17 descritto in precedenza. Eseguire questa procedura con una differenza di almeno 3 giorni dall'elettroporazione. A seconda delle domande della ricerca, questa procedura può essere eseguita prima o dopo l'elettroporazione.

  1. Anestesia e posizionamento degli animali
    1. Eseguire la sedazione animale in una camera di induzione acrilica sotto inalazione di isofluorano al 2,5% con 0,8 L/min di ossigeno (seguendo protocolli istituzionalmente approvati).
    2. Pesare il mouse per calcolare la dose di Meloxicam (vedere il passaggio 2.3.2.).
    3. Mantenere la sedazione del topo con una maschera per tubi nasali collegata a una macchina per anestesia per inalazione sotto uno stereomicroscopio da dissezione.
    4. Posiziona il mouse sul lato sinistro (per denervare il muscolo LAL destro). Fissare l'orecchio destro verso il naso per esporre l'area posteriore del padiglione auricolare.
  2. Procedura chirurgica
    1. Radere la zona posteriore del padiglione auricolare con una lama di rasoio a doppio taglio e disinfettare con clorexidina ed etanolo al 70% 3 volte.
    2. Localizzare la vena auricolare posteriore e praticare un'incisione nella pelle, a 2 mm di distanza caudalmente da essa, di circa 5 mm con le forbici a molla. Evitare di tagliare i vasi sanguigni e/o il tessuto muscolare.
    3. Taglia il grasso e i tessuti connettivi con pinze e forbici. Trova il nervo accessorio spinale; proseguire fino a trovare il ventre del muscolo digastrico e il canale uditivo cartilagineo (tessuto biancastro semitrasparente) (Figura 2A).
    4. Individua l'inizio della ramificazione del nervo facciale appena sotto il muscolo digastrico.
    5. Segui il ramo auricolare posteriore (il ramo più dorsale del nervo facciale) e rimuovi delicatamente il tessuto connettivo che lo circonda, evitando accuratamente la manipolazione diretta del nervo.
    6. Schiacciare il ramo auricolare posteriore del nervo facciale per 30 s, esercitando una pressione costante sul nervo con una pinza con punta angolata di 45°.
  3. Sutura e recupero
    1. Sutura (ceppo 5/0, ago HR15) la pelle con filo di acido poliglicolico riassorbibile.
    2. Iniettare per via sottocutanea l'analgesico Meloxicam in dosi di 1-2 mg/kg di peso per ridurre il dolore post-operatorio.
    3. Rimuovere il nastro dall'orecchio, spegnere il flusso di isofluorano e lasciare che il topo respiri ossigeno puro per 1 minuto.
    4. Metti l'animale in una gabbia vuota (senza lettiera) per riprendersi dall'anestesia.
    5. Rimetti il mouse nel suo alloggiamento normale e monitoralo per 2 giorni dopo l'intervento chirurgico o fino al suo recupero.
    6. Dopo il recupero, esaminare il topo per verificare la presenza di fallimenti nel movimento dell'orecchio interessato come segno di un'efficiente denervazione.
      NOTA: Negli animali di controllo Sham, praticare un'incisione nella pelle, esporre il nervo facciale senza toccarlo direttamente e successivamente suturare.

Risultati

L'elevata resa quantica in fluorescenza della proteinatdTomato 20 la rende un tracciante appropriato per l'efficienza dell'elettroporazione. Pertanto, è stata valutata l'espressione della proteina tdTomato nei muscoli LAL mediante elettroporazione in vivo (Figura 1). I muscoli LAL sono stati sezionati 21 giorni dopo l'elettroporazione. Le preparazioni a montatura intera mostrano la sottile banda caudale (cLAL, poligono ciano...

Discussione

La combinazione di elettroporazione muscolare in vivo e denervazione è un valido approccio sperimentale per studiare una nicchia rigenerativa presso l'NMJ4. Poiché il muscolo LAL è esposto superficialmente, queste procedure combinate possono essere facilmente integrate con la somministrazione di sonde o farmaci che potrebbero influenzare l'espressione o l'attività proteica12. Inoltre, l'elettroporazione dei geni reporter nel mu...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Ringraziamo l'ambiente altamente collaborativo e stimolante dei membri del NeSt Lab per le utili discussioni e commenti su questo lavoro. Il lavoro presso il NeSt Lab è attualmente finanziato da FONDECYT 1221213. Lo schema nella Figura 1A è stato creato con BioRender.com.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
#5/45 Dumont forceps Fine Science Tools 11251-35Sterilize before use
anti 2H3DSHBDilute 1 : 300
anti S100 Ready to UseDakoIR504Dilute 1 : 5
anti SV2DSHBDilute 1 : 50
Chlorhexidine gluconate 2%DifenPharma
Cold light dissecting stereomicroscopeMoticModel SMZ-171
DAPIInvitrogenD1306Dilute 1 : 100
Dumont #5SF ForcepsFine Science Tools 11252-00Sterilize before use
Dumont Mini Forceps –Style 5Fine Science Tools 11200-14Sterilize before use
ECM 830 electroporatorBTX Harvard Apparatus
Gold needle-type electrodes Genetrodes, BTX45-011410 mm straight
Hamilton syringe Hamilton80400
HyaluronidaseSigma-AldrichH3884
Inhalation anesthesia machineSciVerma ScientificM3000 Table Top
IsofluraneBaxter218-082
MiceInstituto de Salud Publica - ChileAdult (3-6 months old) CF-1 mice, of both sexes (30-45 g) 
Razor bladesSchick
Suture Glicosorb 5/0TAGUMGS0812.JAbsorbable polyglycolic acid thread 
tdTomato plasmidAddgene54642tdTomato plasmid under the control of the CMV promoter
Tramadol hydrochloride 5% (Triamcol)Drag Pharma
Vannas Spring ScissorsFine Science Tools 91500-09Sterilize before use
WGA Alexa Fluor 488InvitrogenW7024Dilute
α-BTX Alexa Fluor 488 InvitrogenB13422Dilute 1 : 500

Riferimenti

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