Kombinierte In vivo Elektroporation und kurzfristige Reinnervation des kranialen Levator Auris Longus Skelettmuskel

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das in vivo Elektroporation und Denervierung des kranialen Musculus levator auris longus (LAL) kombiniert. Dieses Verfahren ermöglicht es, die mögliche Rolle von Muskelproteinen bei der Regeneration der neuromuskulären Synapse zu untersuchen.

Zusammenfassung

Die neuromuskuläre Verbindung (NMJ) ist die periphere Synapse, die die Kontraktion der Skelettmuskelfasern steuert, um die koordinierte Bewegung vieler Organismen zu ermöglichen. Am NMJ kontaktiert ein präsynaptisches motorisches Axonterminal eine postsynaptische Muskeldomäne und wird von terminalen Schwann-Zellen bedeckt. Die Integrität und Funktion des NMJ ist unter verschiedenen Bedingungen beeinträchtigt, darunter Alterung, neuromuskuläre Erkrankungen und traumatische Verletzungen. Um den potenziellen Beitrag von Muskelproteinen zur Aufrechterhaltung und Regeneration von NMJ zu analysieren, wurde eine in vivo Gentransferstrategie mit der Denervierung des kranialen Musculus levator auris longus (LAL) nach mechanischer Nervenverletzung kombiniert. Frühere Ergebnisse zeigten, dass die erzwungene Expression von fluoreszierenden Kontrollproteinen die NMJ-Organisation oder die Neurotransmission nicht verändert. Dieses Verfahren zielt darauf ab, ein detailliertes Verfahren der in vivo Elektroporation des LAL-Muskels zu beschreiben, gefolgt von einer Durchtrennung oder Zerquetschung des spezifischen Astes des Gesichtsnervs, der die Hirnmuskulatur innerviert, was zu einer NMJ-Denervation bzw. Reinnervation führt. Die Kombination dieser experimentellen Strategien im bequemen LAL-Muskel stellt eine effiziente Methode dar, um den potentiellen Beitrag der Überexpression oder Stilllegung von Muskelproteinen im Rahmen der kurzfristigen NMJ-Reinnervation zu untersuchen.

Einleitung

Die neuromuskuläre Verbindung (NMJ) ist die periphere Synapse, die die Muskelkontraktion und indirekt die koordinierte Bewegung von Organismen steuert¹. Es besteht aus einem präsynaptischen motorischen Axonterminal, einer postsynaptischen Muskeldomäne, die mit Acetylcholinrezeptoren (AChRs) angereichert ist, und nicht-myelinterminalen Schwann-Zellen, die das Axonterminal ^2,3,4 abdecken. Bei NMJ-Denervation aufgrund einer traumatischen peripheren Nervenverletzung, einer Erkrankung oder eines pharmakologischen Eingriffs geht die kontraktile Muskelaktivität verloren ^5,6. Da bestimmte permissive Mikroumgebungen eine rechtzeitige und effiziente funktionelle Wiederherstellung ermöglichen, ist die Suche nach Proteinen, die den Regenerationsprozess unterstützen könnten, eine ständige Notwendigkeit. Hier wurden zwei Verfahren kombiniert, um die mögliche Rolle der Manipulation der Muskelproteinexpression bei der kurzfristigen Regeneration des NMJ nach einer Nervenverletzung spezifisch zu bewerten.

Der Musculus levator auris longus (LAL), der sich auf der dorsalen Oberfläche des Schädels befindet, ist ein dünner und flacher Muskel, der die Bewegung der Ohrmuschel steuert. Der LAL-Muskel besteht aus rostralen und kaudalen Bändern, die jeweils zwei oder drei Schichten Muskelfasern enthalten ^7,8. Der hintere aurikuläre Ast des Nervus facialis innerviert den LAL-Muskel und erzeugt ein gut beschriebenes Innervationsmuster, das aus fünf rostralen (R1-R5) und zwei kaudalen (C1-C2) Innervationsregionen besteht ^8,9,10. Der LAL ist ein oberflächlich freiliegender und leicht zugänglicher Muskel, so dass seine Verwendung minimalinvasive Eingriffe erfordert. Dies ermöglicht die Visualisierung des NMJ mittels Echtzeitmikroskopie, die Verabreichung von Medikamenten sowie die Intervention kompletter Muskelpräparate sowohl in vivo als auch ex vivo^11,12. Insgesamt machen diese Merkmale den LAL-Muskel zu einem hervorragenden Modell für die Untersuchung des Verhaltens und der Funktion von NMJ^10,13.

Die In-vivo-Elektroporation ist eine Gentransfertechnik, die den Einbau exogener DNA in das Gewebe durch die vorübergehende Permeabilisierung der Zellmembranen und die Beweglichkeit der DNA innerhalb der Zellen ermöglicht, die beide nach Induktion eines elektrischen Feldes erzeugt werden^14,15. Dieses Verfahren ist lokal und kann in jedem Stadium der Entwicklung des Tieres durchgeführt werden. Unter Berücksichtigung der einzigartigen Eigenschaften des LAL-Muskels stellt seine In-vivo-Elektroporation ein minimalinvasives, hocheffizientes und schnelles Verfahren¹⁶ dar, das es ermöglicht, eine robuste Proteinexpression zwei oder drei Tage nach der Elektroporation zu beobachten.

Das Verfahren der Gesichtsnervenquetschung wurde in der Forschung häufig eingesetzt, da es mehrere Vorteile bietet ^5,17,18. Dieses Protokoll wurde zuvor modifiziert, um speziell auf den hinteren Ohrast des Gesichtsnervs abzuzielen, der die Schädelmuskulatur, einschließlich des LAL-Muskels, innerviert, um eine Gesichtslähmung zu vermeiden. Folglich benötigen Mäuse nach der Operation keine besondere Pflege (z. B. befeuchtende Augensalbe gegen den Verlust des Blinzelreflexes). Da die NMJ-Reinnervation am LAL-Muskel zwischen 7 und 9 Tagen nach der Verletzung^{beginnt 6}, ist sie ein gutes kurzfristiges Reinnervationsmodell im Vergleich zum häufig verwendeten Nervenquetschungsmodell des Ischiasnervs zur Denervation der Hintergliedmaßenmuskulatur, bei dem die Reinnervation etwa drei Wochen nach der Nervenverletzung stattfindet¹⁸.

Die Kombination von In-vivo-Elektroporation und Gesichtsnervenverletzung am LAL-Muskel wird es den Forschern ermöglichen, das Verhalten synaptischer Komponenten gegenüber der Modulation von Muskelproteinen zu verschiedenen Zeitpunkten der NMJ-Regeneration, einschließlich kurz- und langfristiger morphologischer Effekte ^6,16, durch eine Vielzahl von Techniken, einschließlich immunhistochemischer, histologischer und funktioneller Assays, zu bewerten.

Protokoll

Alle experimentellen Verfahren sind von der Bioethikkommission der Universidad Austral de Chile, Chile (Protokoll Nr. 503/2023), genehmigt und folgen den von der Bioethikkommission der Nationalen Forschungs- und Entwicklungsagentur Chile (ANID) auferlegten Normen sowie den Richtlinien der Richtlinie des Europäischen Rates für die Pflege von Labortieren. In der vorliegenden Studie wurden adulte (3-6 Monate alte) CF-1-Mäuse beiderlei Geschlechts (30-45 g) verwendet. Die Euthanasie wurde durch eine Überdosis Inhalationsanästhetikum mit anschließender Entblutung erreicht. Die in der Studie verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. In vivo LAL-Muskelelektroporation

1. Präparat
   1. Betäuben Sie die Maus vorsichtig in einer Induktionskammer aus Acryl unter Inhalation von 2,5 % Isofluoran mit 0,8 l/min Sauerstoff (gemäß institutionell anerkannten Protokollen). Halten Sie danach die Sedierung der Maus mit einer Nasenschlauchmaske aufrecht, die mit einem Inhalationsanästhesiegerät unter einem Präparierstereomikroskop verbunden ist.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass sich die Maus im Ruhezustand befindet, bevor Sie mit dem Vorgang beginnen. Testen Sie den Berührungsreflex der Maus, indem Sie einen Fuß vorsichtig mit einer Pinzette zusammendrücken (führen Sie diesen Schritt jedes Mal nach der Einleitung der Anästhesie durch).
   2. Desinfizieren Sie den zervikalen Bereich auf Höhe der sagittalen Naht des Schädels mit dem Antiseptikum Chlorhexidingluconat 2% und injizieren Sie subkutan 20 μl 2 mg/ml Hyaluronidase in PBS mit einer Hamilton-Spritze, um den Zugang des DNA-Plasmids zur Muskeloberfläche zu erleichtern.
   3. Schalten Sie den Isofluoranfluss aus und lassen Sie die Maus 1 Minute lang reinen Sauerstoff atmen.
   4. Wiegen Sie die Maus, um die geeignete Meloxicam-Dosis zu berechnen (siehe Schritt 1.3.2.).
   5. Setzen Sie das Tier in einen leeren Käfig (ohne Einstreu), um sich von der Narkose zu erholen.
   6. Bringen Sie das Tier für 30 min in die normale Haltung^{zurück 16}.
2. Ablauf der Operation
   1. Betäuben Sie die Maus durch Inhalation von 2,5 % Isofluoran mit einem Sauerstoffgemisch von 0,8 l/min (gemäß den institutionell anerkannten Protokollen) und halten Sie sie während des gesamten chirurgischen Eingriffs mit einem Inhalationsanästhesiegerät unter einem Präparierstereomikroskop sediert.
   2. Rasieren Sie den Halsbereich mit einer zweischneidigen Rasierklinge und desinfizieren Sie 3 Mal mit Chlorhexidin und 70% Ethanol.
   3. Machen Sie einen 8-mm-Schnitt über der sagittalen Naht des Schädels und legen Sie den LAL-Muskel frei, indem Sie das Fett und das Bindegewebe, das sich direkt unter der Haut befindet, mit einer Schere/Pinzette vorsichtig entfernen.
      HINWEIS: Der LAL-Muskel ist der oberflächlichste Muskel im Schädelbereich nach dem Hautschnitt. Es ist leicht an der Ausrichtung der Muskelfasern zu erkennen, die diagonal vom mittleren Schädel zu jeder Ohrmuschel verlaufen ^8,16.
   4. Injizieren Sie mit einer Hamilton-Spritze 10 μl der kommerziell gewonnenen DNA (0,8-1 μg/μl) in PBS in die Faszie, die über den gesamten Muskel verteilt ist und eine Blase bildet.
   5. Platzieren Sie zwei Goldnadelelektroden im Abstand von 5 mm, parallel und über Muskelfasern, die die gesamte Länge des LAL-Muskels einnehmen (Abbildung 1A).
   6. Mit einem Elektroporator werden fünf Impulse von 100 V/cm mit einer Dauer von je 20 ms bei einer Frequenz von 1 Hz erzeugt.
   7. Wiederholen Sie den Vorgang im kontralateralen LAL-Muskel (Wiederholung der Schritte 1.2.4-1.2.6).
3. Naht und Genesung
   1. Naht (5/0 Stammgröße, HR15 Nadel) der Haut mit resorbierbarem Polyglykolsäurefaden.
   2. Injizieren Sie das Analgetikum Meloxicam subkutan in Dosen von 1-2 mg/kg Gewicht, um die Schmerzen nach der Operation zu reduzieren.
   3. Schalten Sie den Isofluoranfluss aus und lassen Sie die Maus 1 Minute lang reinen Sauerstoff atmen.
   4. Setzen Sie das Tier in einen leeren Käfig (ohne Einstreu), um sich von der Narkose zu erholen.
   5. Bringen Sie das Tier in seine normale Haltung zurück und überwachen Sie es 2 Tage nach der Operation oder bis zu seiner Genesung. Überwachen Sie Schmerz- oder Stresssymptome und weisen Sie jedem der verschiedenen Parameter Bewertungen unter Berücksichtigung der zuvor beschriebenen humanen Endpunktkriterien zu¹⁹.
      HINWEIS: Positionieren Sie die Maus auf einem beheizten Pad, das mit einem chirurgischen Pad bedeckt ist, um zu verhindern, dass die Körpertemperatur während der Operation absinkt. Versuchen Sie, sich nicht länger als 30 Minuten für den chirurgischen Eingriff zu nehmen, um zu verhindern, dass die Maus aufgrund einer übermäßigen Anästhesie stirbt. Wenn das exprimierte Protein niedrige Fluoreszenzwerte aufweist, wird empfohlen, mit einem Tracer (z. B. tdTomato oder GFP) im Verhältnis 1:5 zu co-elektroporieren (Tracer: DNA von Interesse).

2. Denervierung durch Quetschnervverletzung

HINWEIS: Dieses Protokoll ist eine Modifikation eines zuvor beschriebenen Protokolls¹⁷. Führen Sie diesen Vorgang mit einem Abstand von mindestens 3 Tagen nach der Elektroporation durch. Je nach Fragestellung kann dieses Verfahren vor oder nach der Elektroporation durchgeführt werden.

1. Anästhesie und Tierlagerung
   1. Führen Sie die Sedierung des Tieres in einer Induktionskammer aus Acryl unter Inhalation von 2,5 % Isofluoran mit 0,8 l/min Sauerstoff durch (gemäß den institutionell anerkannten Protokollen).
   2. Wiegen Sie die Maus, um die Meloxicam-Dosis zu berechnen (siehe Schritt 2.3.2.).
   3. Halten Sie die Sedierung der Maus mit einer Nasenschlauchmaske aufrecht, die mit einem Inhalationsanästhesiegerät unter einem Präparierstereomikroskop verbunden ist.
   4. Positionieren Sie die Maus auf der linken Seite (um den rechten LAL-Muskel zu ennervieren). Klebe das rechte Ohr in Richtung Nase, um den hinteren Bereich der Ohrmuschel freizulegen.
2. Ablauf der Operation
   1. Den hinteren Bereich der Ohrmuschel mit einer zweischneidigen Rasierklinge rasieren und 3-mal mit Chlorhexidin und 70% Ethanol desinfizieren.
   2. Lokalisieren Sie die Vena auricularis posterior und machen Sie mit einer Federschere einen Schnitt in der Haut in einem Abstand von ca. 5 mm in einem Abstand von ca. 5 mm. Vermeiden Sie das Durchtrennen von Blutgefäßen und/oder Muskelgewebe.
   3. Schneiden Sie das Fett und das Bindegewebe mit Pinzette und Schere ab. Finden Sie den Spinalnerv accessorius; Fahren Sie fort, bis Sie den Bauch des Digastricus-Muskels und den knorpeligen Gehörgang (halbtransparentes weißliches Gewebe) gefunden haben (Abbildung 2A).
   4. Lokalisieren Sie den Anfang der Verzweigung des Gesichtsnervs direkt unter dem Musculus digastricus.
   5. Folgen Sie dem hinteren Ohrast (dem dorsalen Ast des Nervus facialis) und entfernen Sie vorsichtig das ihn umgebende Bindegewebe, wobei Sie eine direkte Manipulation des Nervs sorgfältig vermeiden.
   6. Den hinteren Ohrast des Nervus facialis 30 s lang zerquetschen, dabei mit einer Pinzette mit einer um 45° abgewinkelten Spitze konstanten Druck auf den Nerv ausüben.
3. Naht und Genesung
   1. Naht (5/0 Stammgröße, HR15 Nadel) der Haut mit resorbierbarem Polyglykolsäurefaden.
   2. Injizieren Sie das Analgetikum Meloxicam subkutan in Dosen von 1-2 mg/kg Gewicht, um die Schmerzen nach der Operation zu reduzieren.
   3. Entfernen Sie das Klebeband vom Ohr, schalten Sie den Isofluoranfluss aus und lassen Sie die Maus 1 Minute lang reinen Sauerstoff atmen.
   4. Setzen Sie das Tier in einen leeren Käfig (ohne Einstreu), um sich von der Narkose zu erholen.
   5. Setzen Sie die Maus wieder in ihr normales Gehäuse ein und überwachen Sie sie 2 Tage nach der Operation oder bis zu ihrer Genesung.
   6. Untersuchen Sie die Maus nach der Genesung auf Fehler in der Bewegung des betroffenen Ohrs als Zeichen einer effizienten Denervierung.
      HINWEIS: Bei Scheinkontrolltieren machen Sie einen Schnitt in die Haut, legen Sie den Gesichtsnerv frei, ohne ihn direkt zu berühren, und nähen Sie anschließend.

Ergebnisse

Die hohe Fluoreszenzquantenausbeute des tdTomato-Proteins²⁰ macht es zu einem geeigneten Tracer für die Effizienz der Elektroporation. Daher wurde die Expression des tdTomato-Proteins in LAL-Muskeln durch in vivo Elektroporation untersucht (Abbildung 1). Die LAL-Muskeln wurden 21 Tage nach der Elektroporation präpariert. Ganzpräparationen zeigen das dünne kaudale Band (cLAL, cyanfarbenes Polygon) des LAL-Muskels mit seine...

Diskussion

Die Kombination von in vivo Muskelelektroporation und Denervierung ist ein wertvoller experimenteller Ansatz zur Untersuchung einer regenerativen Nische am NMJ⁴. Da der LAL-Muskel oberflächlich exponiert ist, können diese kombinierten Verfahren ohne weiteres durch die Verabreichung von Sonden oder Medikamenten ergänzt werden, die die Proteinexpression oder -aktivität beeinflussen könnten¹². Darüber hinaus könnte die Elektrop...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
#5/45 Dumont forceps	Fine Science Tools	11251-35	Sterilize before use
anti 2H3	DSHB		Dilute 1 : 300
anti S100 Ready to Use	Dako	IR504	Dilute 1 : 5
anti SV2	DSHB		Dilute 1 : 50
Chlorhexidine gluconate 2%	DifenPharma
Cold light dissecting stereomicroscope	Motic	Model SMZ-171
DAPI	Invitrogen	D1306	Dilute 1 : 100
Dumont #5SF Forceps	Fine Science Tools	11252-00	Sterilize before use
Dumont Mini Forceps –Style 5	Fine Science Tools	11200-14	Sterilize before use
ECM 830 electroporator	BTX Harvard Apparatus
Gold needle-type electrodes	Genetrodes, BTX	45-0114	10 mm straight
Hamilton syringe	Hamilton	80400
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H3884
Inhalation anesthesia machine	SciVerma Scientific	M3000 Table Top
Isoflurane	Baxter	218-082
Mice	Instituto de Salud Publica - Chile		Adult (3-6 months old) CF-1 mice, of both sexes (30-45 g)
Razor blades	Schick
Suture Glicosorb 5/0	TAGUM	GS0812.J	Absorbable polyglycolic acid thread
tdTomato plasmid	Addgene	54642	tdTomato plasmid under the control of the CMV promoter
Tramadol hydrochloride 5% (Triamcol)	Drag Pharma
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	91500-09	Sterilize before use
WGA Alexa Fluor 488	Invitrogen	W7024	Dilute
α-BTX Alexa Fluor 488	Invitrogen	B13422	Dilute 1 : 500