Electroporación in vivo combinada y reinervación a corto plazo del músculo esquelético elevador del auris largo craneal

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo que combina la electroporación in vivo y la denervación del músculo elevador del auris largo craneal (LAL). Este procedimiento permite estudiar el papel potencial de las proteínas derivadas del músculo en la regeneración de la sinapsis neuromuscular.

Resumen

La unión neuromuscular (NMJ) es la sinapsis periférica que controla la contracción de las fibras del músculo esquelético para permitir el movimiento coordinado de muchos organismos. En la NMJ, un terminal axónico motor presináptico contacta con un dominio postsináptico muscular y está cubierto por células de Schwann terminales. La integridad y la función de la NMJ se ven comprometidas en varias condiciones, como el envejecimiento, las enfermedades neuromusculares y las lesiones traumáticas. Para analizar la posible contribución de las proteínas derivadas del músculo al mantenimiento y la regeneración de la NMJ, se ha combinado una estrategia de transferencia génica in vivo con la denervación del músculo elevador del auris largo craneal (LAL) tras una lesión nerviosa mecánica. Los hallazgos previos mostraron que la expresión forzada de proteínas fluorescentes de control no altera la organización de NMJ ni la neurotransmisión. Este procedimiento tiene como objetivo describir un método detallado de electroporación in vivo del músculo LAL seguido de la transección o aplastamiento de la rama específica del nervio facial que inerva los músculos craneales, lo que conduce a la denervación y reinervación de NMJ, respectivamente. La combinación de estas estrategias experimentales en el conveniente músculo LAL constituye un método eficiente para estudiar la contribución potencial de la sobreexpresión o silenciamiento de proteínas musculares en el contexto de la reinervación de NMJ a corto plazo.

Introducción

La unión neuromuscular (NMJ) es la sinapsis periférica que controla la contracción muscular e, indirectamente, el movimiento coordinado de los organismos¹. Está formado por un axón terminal motor presináptico, un dominio postsináptico muscular enriquecido en receptores de acetilcolina (AChRs) y células de Schwann terminales no mielínicas que cubren el terminal del axón ^2,3,4. Tras la denervación de la NMJ debido a una lesión traumática de un nervio periférico, una enfermedad o una intervención farmacológica, se pierde la actividad del músculo contráctil ^5,6. Dado que ciertos microambientes permisivos permiten una recuperación funcional oportuna y eficiente, la búsqueda de proteínas que puedan ayudar al proceso de regeneración es una necesidad permanente. Aquí, se han combinado dos procedimientos para evaluar específicamente el papel potencial de la manipulación de la expresión de proteínas musculares en la regeneración a corto plazo de la NMJ después de una lesión nerviosa.

El músculo elevador del auris largo (LAL), ubicado en la superficie dorsal del cráneo, es un músculo delgado y plano que controla el movimiento del pabellón auricular. El músculo LAL consta de bandas rostral y caudal, cada una de las cuales contiene dos o tres capas de fibras musculares ^7,8. La rama auricular posterior del nervio facial inerva el músculo LAL, generando un patrón de inervación bien descrito que consta de cinco regiones de inervación rostral (R1-R5) y dos caudales (C1-C2) ^8,9,10. El LAL es un músculo expuesto superficialmente y de fácil acceso, por lo que su uso requiere procedimientos mínimamente invasivos. Esto permite la visualización de la NMJ utilizando microscopía en tiempo real, la administración de fármacos, así como la intervención de preparaciones musculares completas tanto in vivo como ex vivo^11,12. En conjunto, estas características hacen del músculo LAL un excelente modelo para estudiar el comportamiento y la función de la NMJ^10,13.

La electroporación in vivo es una técnica de transferencia génica que permite la incorporación de ADN exógeno al tejido a través de la permeabilización transitoria de las membranas celulares y la movilidad del ADN dentro de las células, ambas generadas tras inducir un campo eléctrico^14,15. Este procedimiento es local y se puede realizar en cualquier etapa del desarrollo del animal. Considerando las características únicas del músculo LAL, su electroporación in vivo representa un procedimiento mínimamente invasivo, altamente eficiente y rápido¹⁶, permitiendo observar una expresión robusta de la proteína dos o tres días después de la electroporación.

El procedimiento de aplastamiento del nervio facial ha sido ampliamente empleado en la investigación, ya que ofrece varias ventajas ^5,17,18. Este protocolo ha sido modificado previamente para dirigirse específicamente a la rama auricular posterior del nervio facial que inerva los músculos craneales, incluido el músculo LAL, para evitar la parálisis facial; En consecuencia, los ratones no requieren cuidados especiales después de la cirugía (por ejemplo, ungüento lubricante para los ojos para la pérdida del reflejo de parpadeo). Dado que la reinervación de la NMJ en el músculo LAL comienza entre 7 y 9 días después de la lesión⁶, es un buen modelo de reinervación a corto plazo en comparación con el modelo de lesión por aplastamiento del nervio ciático comúnmente utilizado para denervar los músculos de las extremidades posteriores, donde la reinervación ocurre alrededor de tres semanas después de la lesión nerviosa¹⁸.

La combinación de la electroporación in vivo y la lesión del nervio facial en el músculo LAL permitirá a los investigadores evaluar el comportamiento de los componentes sinápticos frente a la modulación de proteínas derivadas del músculo en diferentes momentos de la regeneración de NMJ, incluidos los efectos morfológicos a corto y largo plazo ^6,16, a través de una amplia variedad de técnicas que incluyen ensayos inmunohistoquímicos, histológicos y funcionales.

Protocolo

Todos los procedimientos experimentales son aprobados por el Comité de Bioética de la Universidad Austral de Chile, Chile (protocolo Nº 503/2023), y siguen las normas impuestas por el Comité de Bioética de la Agencia Nacional de Investigación y Desarrollo de Chile (ANID), así como los lineamientos de la Directiva del Consejo Europeo para el Cuidado de los Animales de Laboratorio. En el presente estudio se utilizaron ratones CF-1 adultos (3-6 meses de edad) de ambos sexos (30-45 g). La eutanasia se llevó a cabo mediante sobredosis de anestésico inhalante seguida de exanguinación. Los reactivos y equipos utilizados en el estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Electroporación muscular LAL in vivo

1. Preparación
   1. Sedar suavemente al ratón en una cámara de inducción acrílica bajo inhalación de isofluorano al 2,5% con 0,8 L/min de oxígeno (siguiendo los protocolos aprobados institucionalmente). Después de eso, mantenga la sedación del ratón usando una máscara de tubo nasal conectada a una máquina de anestesia inhalatoria bajo un microscopio estereoscópico de disección.
      NOTA: Asegúrese de que el mouse esté dormido antes de comenzar el procedimiento; Pruebe el reflejo táctil del ratón apretando suavemente un pie con una pinza (realice este paso cada vez después de inducir la anestesia).
   2. Desinfectar la zona cervical a nivel de la sutura sagital del cráneo con el antiséptico gluconato de clorhexidina al 2% e inyectar por vía subcutánea 20 μL de 2 mg/mL de hialuronidasa en PBS utilizando una jeringa Hamilton para facilitar el acceso del plásmido de ADN a la superficie muscular.
   3. Apague el flujo de isofluorano y permita que el ratón respire oxígeno puro durante 1 minuto.
   4. Pesar el ratón para calcular la dosis adecuada de Meloxicam (ver paso 1.3.2.).
   5. Coloque al animal en una jaula vacía (sin ropa de cama) para recuperarse de la anestesia.
   6. Regrese al animal a su alojamiento normal durante 30 min¹⁶.
2. Procedimiento quirúrgico
   1. Reanestesiar al ratón mediante la inhalación de isofluorano al 2,5% con una mezcla de oxígeno de 0,8 L/min (siguiendo los protocolos aprobados institucionalmente) y mantenerlo sedado durante todo el procedimiento quirúrgico utilizando una máquina de anestesia inhalatoria, bajo un estereomicroscopio de disección.
   2. Afeitar la zona cervical con una cuchilla de afeitar de doble filo y desinfectar con clorhexidina y etanol al 70% 3 veces.
   3. Realice una incisión de 8 mm sobre la sutura sagital del cráneo y exponga el músculo LAL retirando suavemente la grasa y el tejido conectivo ubicado justo debajo de la piel con tijeras/pinzas.
      NOTA: El músculo LAL es el músculo más superficial de la región craneal después de la incisión en la piel. Es fácilmente reconocible por la orientación de las fibras musculares que corren en diagonal desde el cráneo medio hacia cada pabellón auricular ^8,16.
   4. Con una jeringa Hamilton, inyecte 10 μL del ADN obtenido comercialmente (0,8-1 μg/μL) en PBS en la fascia que se distribuye por todo el músculo, formando una burbuja.
   5. Coloque dos electrodos de aguja de oro a 5 mm de distancia, paralelos y sobre las fibras musculares, ocupando toda la longitud del músculo LAL (Figura 1A).
   6. Utilizando un electroporador, genere cinco pulsos de 100 V/cm de 20 ms de duración cada uno, a una frecuencia de 1 Hz.
   7. Repita el procedimiento en el músculo LAL contralateral (repitiendo los pasos 1.2.4-1.2.6).
3. Sutura y recuperación
   1. Sutura (tamaño de deformación 5/0, aguja HR15) la piel con hilo de ácido poliglicólico reabsorbible.
   2. Inyectar por vía subcutánea el analgésico Meloxicam en dosis de 1-2 mg/kg de peso para reducir el dolor postoperatorio.
   3. Apague el flujo de isofluorano y permita que el ratón respire oxígeno puro durante 1 minuto.
   4. Coloque al animal en una jaula vacía (sin ropa de cama) para recuperarse de la anestesia.
   5. Devolver al animal a su alojamiento habitual y vigilarlo durante 2 días después de la cirugía o hasta su recuperación. Monitorizar los signos de dolor o estrés, asignando puntuaciones para cada uno de los diferentes parámetros considerando los criterios de valoración humana descritos anteriormente¹⁹.
      NOTA: Coloque el mouse en una almohadilla térmica cubierta con una almohadilla quirúrgica para evitar que su temperatura corporal baje durante la cirugía. Trate de no tomar más de 30 minutos para el procedimiento quirúrgico, evitando así que el ratón muera debido al exceso de anestesia. Si la proteína expresada produce bajos niveles de fluorescencia, se recomienda coelectroporar con un trazador (por ejemplo, tdTomato o GFP) en una proporción de 1:5 (trazador: ADN de interés).

2. Denervación inducida por lesión nerviosa por aplastamiento

NOTA: Este protocolo es una modificación de un protocolo¹⁷ descrito anteriormente. Realizar este procedimiento con una diferencia de al menos 3 días desde la electroporación. Dependiendo de las preguntas de investigación, este procedimiento se puede realizar antes o después de la electroporación.

1. Anestesia y posicionamiento de los animales
   1. Realizar la sedación animal en una cámara de inducción acrílica bajo inhalación de isofluorano al 2,5% con 0,8 L/min de oxígeno (siguiendo protocolos aprobados institucionalmente).
   2. Pesar el ratón para calcular la dosis de Meloxicam (ver paso 2.3.2.).
   3. Mantenga la sedación del ratón con una máscara de tubo nasal conectada a una máquina de anestesia inhalatoria bajo un microscopio estereoscópico de disección.
   4. Coloque el ratón en su lado izquierdo (para denervar el músculo LAL derecho). Pega la oreja derecha con cinta adhesiva hacia la nariz para exponer el área posterior del pabellón auricular.
2. Procedimiento quirúrgico
   1. Afeitar la zona posterior del pabellón auricular con una cuchilla de afeitar de doble filo y desinfectar con clorhexidina y etanol al 70% 3 veces.
   2. Localice la vena auricular posterior y haga una incisión en la piel, a 2 mm de distancia caudal de la misma, de aproximadamente 5 mm con unas tijeras de resorte. Evite cortar los vasos sanguíneos y/o el tejido muscular.
   3. Corta la grasa y los tejidos conectivos con pinzas y tijeras. Encontrar el nervio accesorio espinal; continuar hasta encontrar el vientre del músculo digástrico y el conducto auditivo cartilaginoso (tejido blanquecino semitransparente) (Figura 2A).
   4. Localiza el comienzo del nervio facial que se ramifica justo debajo del músculo digástrico.
   5. Siga la rama auricular posterior (la rama más dorsal del nervio facial) y retire suavemente el tejido conectivo que la rodea, evitando cuidadosamente la manipulación directa del nervio.
   6. Triturar la rama auricular posterior del nervio facial durante 30 s, aplicando una presión constante sobre el nervio con una pinza con una punta en ángulo de 45°.
3. Sutura y recuperación
   1. Sutura (tamaño de deformación 5/0, aguja HR15) la piel con hilo de ácido poliglicólico reabsorbible.
   2. Inyectar por vía subcutánea el analgésico Meloxicam en dosis de 1-2 mg/kg de peso para reducir el dolor postoperatorio.
   3. Retire la cinta de la oreja, cierre el flujo de isofluorano y permita que el ratón respire oxígeno puro durante 1 minuto.
   4. Coloque al animal en una jaula vacía (sin ropa de cama) para recuperarse de la anestesia.
   5. Regrese el ratón a su alojamiento habitual y manténgalo durante 2 días después de la cirugía o hasta su recuperación.
   6. Después de la recuperación, examine el ratón en busca de fallas en el movimiento de la oreja afectada como signo de denervación eficiente.
      NOTA: En los animales de control simulados, se realiza una incisión en la piel, se expone el nervio facial sin tocarlo directamente, y posteriormente se sutura.

Resultados

El alto rendimiento cuántico de fluorescencia de la proteína tdTomato²⁰ la convierte en un trazador apropiado para la eficiencia de la electroporación. Por lo tanto, se evaluó la expresión de la proteína tdTomato en músculos LAL por electroporación in vivo (Figura 1). Los músculos LAL se diseccionaron 21 días después de la electroporación. Las preparaciones de montaje completo muestran la banda caudal delgada (cLA...

Discusión

La combinación de electroporación y denervación muscular in vivo es un enfoque experimental valioso para investigar un nicho regenerativo en el NMJ⁴. Dado que el músculo LAL está expuesto superficialmente, estos procedimientos combinados pueden complementarse fácilmente con la administración de sondas o fármacos que podrían afectar la expresión o la actividad de las proteínas¹². Además, la electroporación de genes repo...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
#5/45 Dumont forceps	Fine Science Tools	11251-35	Sterilize before use
anti 2H3	DSHB		Dilute 1 : 300
anti S100 Ready to Use	Dako	IR504	Dilute 1 : 5
anti SV2	DSHB		Dilute 1 : 50
Chlorhexidine gluconate 2%	DifenPharma
Cold light dissecting stereomicroscope	Motic	Model SMZ-171
DAPI	Invitrogen	D1306	Dilute 1 : 100
Dumont #5SF Forceps	Fine Science Tools	11252-00	Sterilize before use
Dumont Mini Forceps –Style 5	Fine Science Tools	11200-14	Sterilize before use
ECM 830 electroporator	BTX Harvard Apparatus
Gold needle-type electrodes	Genetrodes, BTX	45-0114	10 mm straight
Hamilton syringe	Hamilton	80400
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H3884
Inhalation anesthesia machine	SciVerma Scientific	M3000 Table Top
Isoflurane	Baxter	218-082
Mice	Instituto de Salud Publica - Chile		Adult (3-6 months old) CF-1 mice, of both sexes (30-45 g)
Razor blades	Schick
Suture Glicosorb 5/0	TAGUM	GS0812.J	Absorbable polyglycolic acid thread
tdTomato plasmid	Addgene	54642	tdTomato plasmid under the control of the CMV promoter
Tramadol hydrochloride 5% (Triamcol)	Drag Pharma
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	91500-09	Sterilize before use
WGA Alexa Fluor 488	Invitrogen	W7024	Dilute
α-BTX Alexa Fluor 488	Invitrogen	B13422	Dilute 1 : 500