頭蓋挙筋長耳骨格筋の In vivo エレクトロポレーションと短期再神経支配の組み合わせ

要約

ここでは、頭蓋長耳挙筋 (LAL) の in vivo エレクトロポレーションと除神経を組み合わせたプロトコルを紹介します。この手順により、神経筋シナプスの再生における筋由来タンパク質の潜在的な役割の研究が可能になります。

要約

神経筋接合部(NMJ)は、骨格筋線維の収縮を制御して多くの生物の協調的な動きを可能にする末梢シナプスです。NMJでは、シナプス前運動軸索終末が筋肉のシナプス後ドメインに接触し、末端シュワン細胞によって覆われています。NMJの完全性と機能は、老化、神経筋疾患、外傷など、いくつかの条件下で損なわれます。筋肉由来タンパク質のNMJの維持と再生への潜在的な寄与を分析するために、 in vivo 遺伝子導入戦略が、機械的神経損傷後の長頭蓋挙筋(LAL)の除神経と組み合わされています。これまでの知見では、対照蛍光タンパク質の強制発現はNMJの組織化や神経伝達を変化させないことが示されました。この手順は、LAL筋肉の in vivo エレクトロポレーションの詳細な方法を説明することを目的としています 続いて、顔面神経の特定の枝の切断または粉砕 脳神経を神経支配し、それぞれNMJ除神経と再神経支配につながります。便利なLAL筋肉におけるこれらの実験的戦略の組み合わせは、短期的なNMJ再神経支配の文脈における筋タンパク質の過剰発現またはサイレンシングの潜在的な寄与を研究するための効率的な方法を構成します。

概要

神経筋接合部(NMJ)は、筋肉の収縮を制御し、間接的に生物の協調運動を制御する末梢シナプスです¹。これは、シナプス前運動軸索終末、アセチルコリン受容体(AChR)が豊富な筋肉のシナプス後ドメイン、および軸索終末^2,3,4を覆う非骨髄末端シュワン細胞によって形成されます。外傷性末梢神経損傷、疾患、または薬理学的介入によるNMJ除神経により、収縮性筋活動は失われます^5,6。特定の許容性微小環境により、タイムリーで効率的な機能回復が可能になるため、再生プロセスに役立つタンパク質の探索は恒久的に必要です。ここでは、神経損傷後のNMJの短期再生における筋タンパク質発現の操作の潜在的な役割を具体的に評価するために、2つの手順が組み合わされています。

頭蓋骨の背側表面にある長耳挙筋(LAL)は、耳介の動きを制御する薄くて平らな筋肉です。LAL筋は吻側と尾側のバンドからなり、それぞれが筋線維^7,8の2層または3層を含んでいる。顔面神経の後耳介枝はLAL筋を神経支配し、5つの吻側(R1-R5)と2つの尾側(C1-C2)の神経支配領域^8,9,10からなるよく記述された神経支配パターンを生成します。LALは表面的に露出し、簡単にアクセスできる筋肉であるため、その使用には低侵襲の手順が必要です。これにより、リアルタイム顕微鏡、薬物送達、およびin vivoおよびex vivo^11,12 の両方で完全な筋肉調製物の介入を使用して NMJ を視覚化できます。全体として、これらの特徴により、LAL筋肉はNMJの行動と機能を研究するための優れたモデルになります^10,13。

インビボエレクトロポレーションは、細胞膜の一過性透過化および細胞内のDNAの移動性を通じて、組織への外因性DNAの取り込みを可能にする遺伝子導入技術であり、これらはいずれも電界を誘導した後に生成される^14,15。この手順は局所的に行われ、動物の発育のどの段階でも実行できます。LAL筋のユニークな特徴を考慮すると、そのin vivoエレクトロポレーションは、低侵襲で、高効率で、迅速な手順¹⁶を表し、エレクトロポレーションの2〜3日後に堅牢なタンパク質発現を観察することを可能にします。

顔面神経クラッシュ手順は、いくつかの利点を提供するため、研究で広く採用されています^5,17,18。このプロトコルは、顔面神経の後耳介枝を特異的に標的とするように変更されています LAL筋肉を含む脳神経を神経支配する顔面神経、顔面神経麻痺を避けるために;したがって、マウスは手術後に特別なケアを必要としません(例えば、まばたき反射の喪失のための眼軟膏の潤滑剤)。LAL筋でのNMJ再神経支配は損傷6後7〜9日で開始^{されるため、神経}損傷¹⁸の3週間後約3週間で再神経支配が起こる後肢筋を除神経するための坐骨神経の一般的に使用される神経挫傷傷モデルと比較して、優れた短期再神経支配モデルです。

in vivoエレクトロポレーションとLAL筋肉での顔面神経損傷の組み合わせにより、研究者は、免疫組織化学的、組織学的、および機能的アッセイを含むさまざまな技術を通じて、短期的および長期的な^{形態学的影響}を含む、NMJ再生のさまざまな時間における筋肉由来タンパク質調節に対するシナプス成分の挙動を評価できるようになります。

プロトコル

すべての実験手順は、チリのUniversidad Austral de Chileの生命倫理委員会(プロトコル番号503/2023)によって承認され、チリ国立研究開発庁(ANID)の生命倫理委員会によって課せられた規範、および欧州理事会の実験動物のケアに関する指令のガイドラインに従っています。本研究では、成体(生後3-6ヶ月齢)の雌雄CF-1マウス(30-45g)を用いた。安楽死は、吸入麻酔薬の過剰摂取とそれに続く放血によって達成されました。この試験で使用された試薬および機器は、 材料表に記載されています。

1. In vivo LAL筋エレクトロポレーション

1. 準備
   1. 2.5%イソフルオランと0.8 L / minの酸素を吸入して、アクリル誘導チャンバーでマウスを穏やかに鎮静させます(施設で承認されたプロトコルに従います)。その後、解剖実体顕微鏡下で吸入麻酔器に接続されたノーズチューブマスクを使用してマウスの鎮静を維持します。
      メモ: 手順を開始する前に、マウスがスリープ状態であることを確認してください。鉗子で片方の足を優しく握って、マウスのタッチ反射をテストします(麻酔を誘発した後は毎回この手順を行います)。
   2. 頭蓋骨の矢状縫合糸のレベルで頸部を消毒します 消毒剤クロルヘキシジングルコン酸2%を使用し、ハミルトンシリンジを使用してPBSに20μLの2 mg / mLヒアルロニダーゼを皮下注射して、DNAプラスミドの筋肉表面へのアクセスを促進します。.
   3. イソフルオランの流れを止め、マウスが純粋な酸素を1分間呼吸するのを待ちます。
   4. マウスの体重を量り、適切なメロキシカム用量を計算します(ステップ1.3.2を参照)。
   5. 麻酔から回復するために、動物を空のケージ(寝具なし)に入れます。
   6. 動物を通常の飼育箱に30分間戻します¹⁶。
2. 手術の手順
   1. 2.5% イソフルオランを 0.8 L/min の酸素混合物 (施設で承認されたプロトコルに従う) で吸入してマウスに再麻酔をかけ、吸入麻酔器を使用して外科手術中ずっと鎮静剤を投与し、解剖実体顕微鏡下でマウスに麻酔をかけます。
   2. 両刃のカミソリの刃を使用して頸部を剃り、クロルヘキシジンと70%エタノールで3回消毒します。
   3. 頭蓋骨の矢状縫合糸に8mmの切開を行い、はさみ/鉗子を使用して皮膚のすぐ下にある脂肪と結合組織を優しく取り除いてLAL筋を露出させます。
      注:LAL筋は、皮膚切開後の頭蓋領域で最も表面的な筋肉です。これは、中央の頭蓋骨から各耳介に向かって斜めに走る筋線維の向きによって容易に認識されます^8,16。
   4. ハミルトンシリンジを使用して、市販のDNA(0.8-1μg/μL)のPBSに10μLを注入し、筋肉全体に分布している筋膜に注入し、気泡を形成します。
   5. 2つの金針電極を5 mm間隔で平行に、筋繊維の上に配置して、LAL筋の全長を占めます(図1A)。
   6. エレクトロポレーターを使用して、1Hzの周波数で、それぞれ20msの持続時間で100V/cmのパルスを5つ生成します。
   7. 反対側のLAL筋肉で手順を繰り返します(手順1.2.4〜1.2.6を繰り返します)。
3. 縫合と回復
   1. 吸収性ポリグリコール酸糸で皮膚を縫合(5/0ひずみサイズ、HR15針)。
   2. 鎮痛剤メロキシカムを1〜2 mg / kgの用量で皮下に注射して、手術後の痛みを軽減します。.
   3. イソフルオランの流れを止め、マウスが純粋な酸素を1分間呼吸するのを待ちます。
   4. 麻酔から回復するために、動物を空のケージ(寝具なし)に入れます。
   5. 動物を通常の住居に戻し、手術後2日間または回復するまで監視します。痛みやストレスの兆候を監視し、前に説明した人道的なエンドポイント基準を考慮して、さまざまなパラメーターのそれぞれにスコアを割り当てます¹⁹。
      注意: 手術中に体温が下がるのを防ぐために、手術用パッドで覆われた加熱パッドにマウスを置きます。外科的処置に30分以上かからないようにして、過剰な麻酔によるマウスの死を防ぎます。発現したタンパク質の蛍光レベルが低い場合は、トレーサー(tdTomatoやGFPなど)と1:5の比率で共エレクトロポレートすることをお勧めします(トレーサー:目的のDNA)。

2.潰れ神経損傷誘発性除神経

注:このプロトコルは、前述のプロトコル¹⁷の修正版です。この手順は、エレクトロポレーションから少なくとも3日の差をつけて行ってください。研究課題に応じて、この手順はエレクトロポレーションの前または後に行うことができます。

1. 麻酔と動物のポジショニング
   1. アクリル誘導チャンバーで、2.5% イソフルオランと 0.8 L/min の酸素を吸入して動物鎮静を行います (施設で承認されたプロトコルに従います)。
   2. マウスの体重を量ってメロキシカムの投与量を計算します(ステップ2.3.2を参照)。
   3. 解剖実体顕微鏡の下で吸入麻酔器に接続されたノーズチューブマスクを使用して、マウスの鎮静を維持します。
   4. マウスを左側に置きます(右のLAL筋肉を除神経するため)。右耳を鼻に向けてテープで固定し、耳介の後部を露出させます。
2. 手術の手順
   1. 両刃のカミソリの刃を使用して耳介の後部を剃り、クロルヘキシジンと70%エタノールで3回消毒します。
   2. 後耳介静脈の位置を特定し、そこから尾側に2 mm、スプリングハサミで約5 mmの切開を皮膚に行います。血管や筋肉組織を切断することは避けてください。
   3. 脂肪と結合組織を鉗子とハサミで切ります。脊髄副神経を見つけます。二腹筋の腹と軟骨性耳道(半透明の白っぽい組織)を見つけるまで続けます(図2A)。
   4. 顎錐筋のすぐ下にある顔面神経の分岐の始まりを見つけます。
   5. 後耳介枝(顔面神経の最も背側の枝)をたどり、それを取り巻く結合組織をそっと取り除き、直接神経操作を避けます。
   6. 顔面神経の後耳介枝を30秒間押しつぶし、先端が45°の角度が付いた鉗子で神経に一定の圧力をかけます。
3. 縫合と回復
   1. 吸収性ポリグリコール酸糸で皮膚を縫合(5/0ひずみサイズ、HR15針)。
   2. 鎮痛剤メロキシカムを1〜2 mg / kgの用量で皮下に注射して、手術後の痛みを軽減します。.
   3. 耳からテープをはがし、イソフルオランの流れをオフにし、マウスが純粋な酸素を1分間呼吸するのを待ちます。
   4. 麻酔から回復するために、動物を空のケージ(寝具なし)に入れます。
   5. マウスを通常のハウジングに戻し、手術後2日間または回復するまでマウスを監視します。
   6. 回復後、マウスに罹患した耳の動きの失敗がないか調べます。
      注:偽の対照動物では、皮膚を切開し、直接触れずに顔面神経を露出させ、その後縫合します。

結果

tdTomato protein²⁰は蛍光量子収率が高いため、エレクトロポレーション効率に適したトレーサーです。そこで、in vivoエレクトロポレーションによるLAL筋におけるtdTomatoタンパク質の発現を評価しました(図1)。LAL筋は、エレクトロポレーションの21日後に解剖されました。ホールマウント調製は、2つの神経支配領域を持つLAL筋...

ディスカッション

in vivo 筋肉エレクトロポレーションと除神経の組み合わせは、NMJ⁴ の再生ニッチを調査するための貴重な実験的アプローチです。LAL筋は表面的に露出しているため、これらの組み合わせた手順は、タンパク質の発現または活性に影響を与える可能性のあるプローブまたは薬物の送達によって容易に補完することができる¹²。さ...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
#5/45 Dumont forceps	Fine Science Tools	11251-35	Sterilize before use
anti 2H3	DSHB		Dilute 1 : 300
anti S100 Ready to Use	Dako	IR504	Dilute 1 : 5
anti SV2	DSHB		Dilute 1 : 50
Chlorhexidine gluconate 2%	DifenPharma
Cold light dissecting stereomicroscope	Motic	Model SMZ-171
DAPI	Invitrogen	D1306	Dilute 1 : 100
Dumont #5SF Forceps	Fine Science Tools	11252-00	Sterilize before use
Dumont Mini Forceps –Style 5	Fine Science Tools	11200-14	Sterilize before use
ECM 830 electroporator	BTX Harvard Apparatus
Gold needle-type electrodes	Genetrodes, BTX	45-0114	10 mm straight
Hamilton syringe	Hamilton	80400
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H3884
Inhalation anesthesia machine	SciVerma Scientific	M3000 Table Top
Isoflurane	Baxter	218-082
Mice	Instituto de Salud Publica - Chile		Adult (3-6 months old) CF-1 mice, of both sexes (30-45 g)
Razor blades	Schick
Suture Glicosorb 5/0	TAGUM	GS0812.J	Absorbable polyglycolic acid thread
tdTomato plasmid	Addgene	54642	tdTomato plasmid under the control of the CMV promoter
Tramadol hydrochloride 5% (Triamcol)	Drag Pharma
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	91500-09	Sterilize before use
WGA Alexa Fluor 488	Invitrogen	W7024	Dilute
α-BTX Alexa Fluor 488	Invitrogen	B13422	Dilute 1 : 500