JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем протокол, который сочетает в себе электропорацию in vivo и денервацию мышцы, поднимающей длинный краниальный клапан (LAL). Эта процедура позволяет изучить потенциальную роль мышечных белков в регенерации нервно-мышечного синапса.

Аннотация

Нервно-мышечное соединение (NMJ) — это периферический синапс, контролирующий сокращение скелетных мышечных волокон, чтобы обеспечить скоординированное движение многих организмов. В NMJ окончание пресинаптического моторного аксона контактирует с мышечным постсинаптическим доменом и покрыто концевыми шванновскими клетками. Целостность и функция NMJ нарушаются при нескольких состояниях, включая старение, нервно-мышечные заболевания и травматические повреждения. Для анализа потенциального вклада мышечных белков в поддержание и регенерацию NMJ стратегия переноса генов in vivo была объединена с денервацией мышцы, поднимающей краниальный леватор длинного цвета (LAL) после механической травмы нерва. Предыдущие результаты показали, что принудительная экспрессия контрольных флуоресцентных белков не изменяет организацию NMJ или нейротрансмиссию. Эта процедура направлена на подробное описание метода электропорации мышцы LAL in vivo с последующей транссекцией или сдавливанием специфической ветви лицевого нерва, иннервирующей черепные мышцы, что приводит к денервации и реиннервации NMJ соответственно. Комбинация этих экспериментальных стратегий в удобной мышце LAL представляет собой эффективный метод изучения потенциального вклада гиперэкспрессии или сайленсинга мышечных белков в контексте краткосрочной реиннервации NMJ.

Введение

Нервно-мышечное соединение (NMJ) — это периферический синапс, который контролирует сокращение мышц и, косвенно, скоординированное движение организмов1. Он образован пресинаптическим моторным окончанием аксона, мышечным постсинаптическим доменом, обогащенным ацетилхолиновыми рецепторами (AChR), и немиелиновыми концевыми шванновскими клетками, покрывающими окончание аксона 2,3,4. При денервации NMJ вследствие травматического повреждения периферических нервов, заболевания или фармакологического вмешательства сократительная мышечная активность теряется 5,6. Поскольку некоторые разрешающие микросреды обеспечивают своевременное и эффективное функциональное восстановление, поиск белков, которые могли бы помочь процессу регенерации, является постоянной необходимостью. Здесь были объединены две процедуры для конкретной оценки потенциальной роли манипулирования экспрессией мышечных белков в краткосрочной регенерации NMJ после повреждения нерва.

Мышца, поднимающая длинный ореол (LAL), расположенная на дорсальной поверхности черепа, представляет собой тонкую и плоскую мышцу, которая контролирует движение ушной раковины. Мышца LAL состоит из ростральной и каудальной полос, каждая из которых содержит два или три слоя мышечных волокон 7,8. Задняя аурикулярная ветвь лицевого нерва иннервирует мышцу LAL, создавая хорошо описанный паттерн иннервации, состоящий из пяти ростральных (R1-R5) и двух каудальных (C1-C2) иннервационных областей 8,9,10. LAL представляет собой поверхностно обнаженную и легкодоступную мышцу, поэтому ее использование требует минимально инвазивных процедур. Это позволяет визуализировать NMJ с помощью микроскопии в реальном времени, доставки лекарств, а также вмешательства полных мышечных препаратов как in vivo, так и ex vivo11,12. В целом, эти особенности делают мышцу LAL отличной моделью для изучения поведения и функции NMJ10,13.

Электропорация in vivo — это метод переноса генов, который позволяет встраивать экзогенную ДНК в ткань посредством транзиторной проникновения клеточных мембран и подвижности ДНК внутри клеток, которые генерируются после индуцирования электрического поля14,15. Эта процедура является локальной и может проводиться на любой стадии развития животного. Учитывая уникальные особенности мышцы LAL, ее электропорация in vivo представляет собой минимально инвазивную, высокоэффективную и быструю процедуру16, позволяющую наблюдать устойчивую экспрессию белка через два или три дня после электропорации.

Процедура сдавливания лицевого нерва широко используется в исследованиях, поскольку она предлагает ряд преимуществ 5,17,18. Этот протокол был ранее модифицирован для целенаправленного воздействия на заднюю аурикулярную ветвь лицевого нерва, которая иннервирует черепные мышцы, включая мышцу LAL, чтобы избежать паралича лицевого нерва; Следовательно, мыши не требуют специального ухода после операции (например, смазывающей глазной мази при потере рефлекса моргания). Поскольку реиннервация NMJ в мышце LAL начинается через 7-9 дней после травмы6, это хорошая краткосрочная модель реиннервации по сравнению с обычно используемой моделью повреждения нерва седалищного нерва для денервации мышц задней конечности, где реиннервация происходит примерно через три недели после повреждения нерва18.

Комбинация электропорации in vivo и повреждения лицевого нерва в мышце LAL позволит исследователям оценить поведение синаптических компонентов против модуляции мышечного белка в различные периоды регенерации NMJ, включая краткосрочные и долгосрочные морфологические эффекты 6,16, с помощью широкого спектра методов, включая иммуногистохимические, гистологические и функциональные анализы.

протокол

Все экспериментальные процедуры одобрены Комитетом по биоэтике Южного университета Чили, Чили (протокол No 503/2023), и соответствуют нормам, установленным Комитетом по биоэтике Национального агентства по исследованиям и разработкам Чили (ANID), а также руководящим принципам Директивы Европейского совета по уходу за лабораторными животными. В настоящем исследовании использовались взрослые (3-6 месяцев) мыши CF-1 обоего пола (30-45 г). Эвтаназия осуществлялась путем передозировки ингаляционного анестетика с последующей обескровливанием. Реагенты и оборудование, использованные в исследовании, перечислены в Таблице материалов.

1. Электропорация мышц in vivo LAL

  1. Подготовка
    1. Осторожно успокойте мышь в акриловой индукционной камере под вдыханием 2,5% изофторана с 0,8 л/мин кислорода (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами). После этого поддерживайте седацию у мышей с помощью маски с носовой трубкой, подключенной к аппарату для ингаляционной анестезии под препарирующим стереомикроскопом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом процедуры убедитесь, что мышь спит; Проверьте сенсорный рефлекс мыши, осторожно сдавливая одну ногу щипцами (проделывайте этот шаг каждый раз после введения анестезии).
    2. Дезинфицируйте шейный отдел на уровне сагиттального шва черепа антисептиком хлоргексидина глюконат 2% и введите подкожно 20 мкл гиалуронидазы 20 мкл 2 мг/мл гиалуронидазы в PBS с помощью шприца Гамильтона для облегчения доступа ДНК-плазмиды к мышечной поверхности.
    3. Выключите поток изофторана и дайте мыши дышать чистым кислородом в течение 1 минуты.
    4. Взвесьте мышь, чтобы рассчитать подходящую дозу мелоксикама (см. шаг 1.3.2.).
    5. Поместите животное в пустую клетку (без подстилки) для восстановления после анестезии.
    6. Верните животное в обычное жилье на 30 мин16.
  2. Процедура операции
    1. Повторно обезболите мышь путем ингаляции 2,5% изофторана с кислородной смесью 0,8 л/мин (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами) и держите ее в седации на протяжении всей хирургической процедуры с помощью аппарата для ингаляционной анестезии под препарирующим стереомикроскопом.
    2. Побрейте шейную область с помощью обоюдоострого бритвенного лезвия и продезинфицируйте хлоргексидином и 70% этанолом 3 раза.
    3. Сделайте разрез 8 мм над сагиттальным швом черепа и обнажите мышцу LAL, аккуратно удалив жир и соединительную ткань, расположенные прямо под кожей, с помощью ножниц/щипцов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мышца LAL является самой поверхностной мышцей в области черепа после разреза кожи. Его легко узнать по ориентации мышечных волокон, которые проходят по диагонали от среднего черепа к каждой ушной раковине 8,16.
    4. С помощью шприца Гамильтона введите 10 мкл коммерчески полученной ДНК (0,8-1 мкг/мкл) в PBS в фасцию, которая распределяется по всей мышце, образуя пузырь.
    5. Поместите два золотых игольчатых электрода на расстоянии 5 мм друг от друга, параллельно и над мышечными волокнами, занимая всю длину мышцы LAL (рисунок 1A).
    6. С помощью электропоратора сгенерировать пять импульсов по 100 В/см длительностью 20 мс каждый с частотой 1 Гц.
    7. Повторите процедуру в контралатеральной мышце LAL (повторяя шаги 1.2.4-1.2.6).
  3. Наложение швов и восстановление
    1. Шов (размер деформации 5/0, игла HR15) на кожу рассасывающейся нитью полигликолевой кислоты.
    2. Подкожно вводите анальгетик Мелоксикам в дозе 1-2 мг/кг веса для уменьшения послеоперационной боли.
    3. Выключите поток изофторана и дайте мыши дышать чистым кислородом в течение 1 минуты.
    4. Поместите животное в пустую клетку (без подстилки) для восстановления после анестезии.
    5. Верните животное в обычное жилье и наблюдайте за ним в течение 2 дней после операции или до выздоровления. Отслеживайте признаки боли или стресса, присваивая баллы по каждому из различных параметров, учитывая ранее описанные критерии гуманной конечной точки19.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите мышь на нагревательную подушку, накрытую хирургической прокладкой, чтобы предотвратить падение температуры ее тела во время операции. Старайтесь не тратить на хирургическую процедуру более 30 минут, тем самым предотвратив гибель мыши из-за избыточной анестезии. Если экспрессированный белок дает низкие уровни флуоресценции, рекомендуется провести совместное электропорирование с индикатором (например, tdTomato или GFP) в соотношении 1:5 (интересующий индикатор: ДНК).

2. Денервация, вызванная раздавливанием нерва

ПРИМЕЧАНИЕ: Данный протокол является модификацией ранее описанного протокола17. Выполняют эту процедуру с разницей не менее 3 дней с момента проведения электропорации. В зависимости от вопросов исследования, данная процедура может быть выполнена до или после электропорации.

  1. Анестезия и позиционирование животного
    1. Проводите седацию животного в акриловой индукционной камере при вдыхании 2,5% изофторана с концентрацией кислорода 0,8 л/мин (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами).
    2. Утяжелите мышь, чтобы рассчитать дозу мелоксикама (см. шаг 2.3.2.).
    3. Поддерживайте седативный эффект у мышей с помощью маски с носовой трубкой, подключенной к аппарату для ингаляционной анестезии под препарирующим стереомикроскопом.
    4. Расположите мышь на левой стороне (чтобы денервировать правую мышцу LAL). Прикрепите правое ухо к носу, чтобы обнажить заднюю область ушной раковины.
  2. Процедура операции
    1. Выбрейте заднюю часть ушной раковины с помощью обоюдоострого лезвия бритвы и продезинфицируйте хлоргексидином и 70% этанолом 3 раза.
    2. Найдите заднюю ушную вену и сделайте разрез на коже на расстоянии 2 мм каудально от нее примерно 5 мм пружинными ножницами. Избегайте разрезания кровеносных сосудов и/или мышечной ткани.
    3. Разрежьте жировые и соединительные ткани с помощью щипцов и ножниц. Найдите спинномозговой добавочный нерв; продолжайте до тех пор, пока не обнаружите брюхо двужелудочной мышцы и хрящевой слуховой проход (полупрозрачную беловатую ткань) (рисунок 2А).
    4. Найдите начало ответвления лицевого нерва чуть ниже двужелудочной мышцы.
    5. Проследите за задней аурикулярной ветвью (самой дорсальной ветвью лицевого нерва) и аккуратно удалите окружающую ее соединительную ткань, тщательно избегая прямых манипуляций с нервом.
    6. Раздавите заднюю ушную ветвь лицевого нерва в течение 30 с, оказывая постоянное давление на нерв щипцами с наклоненным под углом 45° кончиком.
  3. Наложение швов и восстановление
    1. Шов (размер деформации 5/0, игла HR15) на кожу рассасывающейся нитью полигликолевой кислоты.
    2. Подкожно вводите анальгетик Мелоксикам в дозе 1-2 мг/кг веса для уменьшения послеоперационной боли.
    3. Снимите ленту с уха, выключите поток изофторана и дайте мыши дышать чистым кислородом в течение 1 минуты.
    4. Поместите животное в пустую клетку (без подстилки) для восстановления после анестезии.
    5. Верните мышь в обычное жилье и наблюдайте за ней в течение 2 дней после операции или до выздоровления.
    6. После выздоровления осмотрите мышь на предмет сбоев в движении пораженного уха как признака эффективной денервации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: У контрольных животных Шама сделайте разрез на коже, обнажите лицевой нерв, не касаясь его напрямую, а затем наложите шов.

Результаты

Высокий квантовый выход флуоресценции белка tdTomato20 делает его подходящим индикатором для эффективности электропорации. Таким образом, была оценена экспрессия белка tdTomato в мышцах LAL с помощью электропорации in vivo (рис. 1). Мышцы LAL были р?...

Обсуждение

Комбинация электропорации мышц in vivo и денервации является ценным экспериментальным подходом к исследованию регенеративной ниши в NMJ4. Поскольку мышца LAL подвергается поверхностному воздействию, эти комбинированные процедуры могут быть легко допол?...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим участников NeSt Lab за плодотворное сотрудничество и стимулирующую атмосферу за полезную дискуссию и комментарии по этой работе. Работа в NeSt Lab в настоящее время финансируется FONDECYT 1221213. Схема на рисунке 1А была создана с помощью BioRender.com.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
#5/45 Dumont forceps Fine Science Tools 11251-35Sterilize before use
anti 2H3DSHBDilute 1 : 300
anti S100 Ready to UseDakoIR504Dilute 1 : 5
anti SV2DSHBDilute 1 : 50
Chlorhexidine gluconate 2%DifenPharma
Cold light dissecting stereomicroscopeMoticModel SMZ-171
DAPIInvitrogenD1306Dilute 1 : 100
Dumont #5SF ForcepsFine Science Tools 11252-00Sterilize before use
Dumont Mini Forceps –Style 5Fine Science Tools 11200-14Sterilize before use
ECM 830 electroporatorBTX Harvard Apparatus
Gold needle-type electrodes Genetrodes, BTX45-011410 mm straight
Hamilton syringe Hamilton80400
HyaluronidaseSigma-AldrichH3884
Inhalation anesthesia machineSciVerma ScientificM3000 Table Top
IsofluraneBaxter218-082
MiceInstituto de Salud Publica - ChileAdult (3-6 months old) CF-1 mice, of both sexes (30-45 g) 
Razor bladesSchick
Suture Glicosorb 5/0TAGUMGS0812.JAbsorbable polyglycolic acid thread 
tdTomato plasmidAddgene54642tdTomato plasmid under the control of the CMV promoter
Tramadol hydrochloride 5% (Triamcol)Drag Pharma
Vannas Spring ScissorsFine Science Tools 91500-09Sterilize before use
WGA Alexa Fluor 488InvitrogenW7024Dilute
α-BTX Alexa Fluor 488 InvitrogenB13422Dilute 1 : 500

Ссылки

  1. Slater, C. R. The functional organization of motor nerve terminals. Prog Neurobiol. 134, 55-103 (2015).
  2. Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Development of the vertebrate neuromuscular junction. Annu Rev Neurosci. 22, 389-442 (1999).
  3. Darabid, H., Perez-Gonzalez, A. P., Robitaille, R. Neuromuscular synaptogenesis: Coordinating partners with multiple functions. Nat Rev Neurosci. 15 (11), 703-718 (2014).
  4. Zelada, D., Bermedo-Garcia, F., Collao, N., Henriquez, J. P. Motor function recovery: Deciphering a regenerative niche at the neuromuscular synapse. Biol Rev Camb Philos Soc. 96 (2), 752-766 (2021).
  5. Kobayashi, J., et al. The effect of duration of muscle denervation on functional recovery in the rat model. Muscle Nerve. 20 (7), 858-866 (1997).
  6. Bermedo-Garcia, F., Zelada, D., Martinez, E., Tabares, L., Henriquez, J. P. Functional regeneration of the murine neuromuscular synapse relies on long-lasting morphological adaptations. BMC Biol. 20 (1), 158 (2022).
  7. Erzen, I., Cvetko, E., Obreza, S., Angaut-Petit, D. Fiber types in the mouse levator auris longus muscle: A convenient preparation to study muscle and nerve plasticity. J Neurosci Res. 59 (5), 692-697 (2000).
  8. Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo. Neuromuscul Disord. 20 (11), 740-743 (2010).
  9. Murray, L. M., Talbot, K., Gillingwater, T. H. Review: Neuromuscular synaptic vulnerability in motor neurone disease: Amyotrophic lateral sclerosis and spinal muscular atrophy. Neuropathol Appl Neurobiol. 36 (2), 133-156 (2010).
  10. Murray, L. M., et al. Selective vulnerability of motor neurons and dissociation of pre-and postsynaptic pathology at the neuromuscular junction in mouse models of spinal muscular atrophy. Hum Mol Genet. 17 (7), 949-962 (2008).
  11. Wright, M., Kim, A., Son, Y. J. Subcutaneous administration of muscarinic antagonists and triple-immunostaining of the levator auris longus muscle in mice. J Vis Exp. (55), e3124 (2011).
  12. Zelada, D., Barrantes, F. J., Henríquez, J. P. Lithium causes differential effects on postsynaptic stability in normal and denervated neuromuscular synapses. Sci Rep. 11 (1), 17285 (2021).
  13. Klooster, R., et al. Muscle-specific kinase myasthenia gravis IgG4 autoantibodies cause severe neuromuscular junction dysfunction in mice. Brain. 135, 1081-1101 (2012).
  14. Mcmahon, J. M., Signori, E., Wells, K. E., Fazio, V. M., Wells, D. J. Optimisation of electrotransfer of plasmid into skeletal muscle by pretreatment with hyaluronidase: Increased expression with reduced muscle damage. Gene Ther. 8 (16), 1264-1270 (2001).
  15. Difranco, M., Quinonez, M., Capote, J., Vergara, J. DNA transfection of mammalian skeletal muscles using in vivo electroporation. J Vis Exp. (32), e1520 (2009).
  16. Ojeda, J., et al. The mouse levator auris longus muscle: An amenable model system to study the role of postsynaptic proteins to the maintenance and regeneration of the neuromuscular synapse. Front Cell Neurosci. 14, 225 (2020).
  17. Olmstead, D. N., et al. Facial nerve axotomy in mice: A model to study motoneuron response to injury. J Vis Exp. (96), e52382 (2015).
  18. Magill, C. K., et al. Reinnervation of the tibialis anterior following sciatic nerve crush injury: A confocal microscopic study in transgenic mice. Exp Neurol. 207 (1), 64-74 (2007).
  19. Lloyd, M., Wolfensohn, S. Practical use of distress scoring systems in the application of humane endpoints. Humane Endpoints in Animal Experiments for Biomedical Research. , 48-53 (1999).
  20. Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. Red fluorescent protein. Nat Biotechnol. 22 (12), 1567-1572 (2004).
  21. Perez, V., et al. The p75(ntr) neurotrophin receptor is required to organize the mature neuromuscular synapse by regulating synaptic vesicle availability. Acta Neuropathol Commun. 7 (1), 147 (2019).
  22. Boehm, I., et al. Comparative anatomy of the mammalian neuromuscular junction. J Anat. 237 (5), 827-836 (2020).
  23. Jones, R. A., et al. Cellular and molecular anatomy of the human neuromuscular junction. Cell Rep. 21 (9), 2348-2356 (2017).
  24. Jones, R. A., et al. NMJ-morph reveals principal components of synaptic morphology influencing structure-function relationships at the neuromuscular junction. Open Biol. 6 (12), 160240 (2016).
  25. Ma, C. H., et al. Accelerating axonal growth promotes motor recovery after peripheral nerve injury in mice. J Clin Invest. 121 (11), 4332-4347 (2011).
  26. Sakuma, M., et al. Lack of motor recovery after prolonged denervation of the neuromuscular junction is not due to regenerative failure. Eur J Neurosci. 43 (3), 451-462 (2016).
  27. Mir, L. M., et al. High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (8), 4262-4267 (1999).
  28. Kleeman, B., et al. A guide to choosing fluorescent protein combinations for flow cytometric analysis based on spectral overlap. Cytometry A. 93 (5), 556-562 (2018).
  29. Morris, L. M., Klanke, C. A., Lang, S. A., Lim, F. Y., Crombleholme, T. M. Tdtomato and EGFP identification in histological sections: Insight and alternatives. Biotech Histochem. 85 (6), 379-387 (2010).
  30. Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. The levator auris longus muscle of the mouse: A convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins. Neurosci Lett. 82 (1), 83-88 (1987).
  31. Sokołowska, E., Błachnio-Zabielska, A. U. A critical review of electroporation as a plasmid delivery system in mouse skeletal muscle. Int J Mol Sci. 20 (11), 2776 (2019).
  32. Pérez-García, M. J., Burden, S. J. Increasing musk activity delays denervation and improves motor function in ALS mice. Cell Rep. 2 (3), 497-502 (2012).
  33. Valdez, G., et al. Attenuation of age-related changes in mouse neuromuscular synapses by caloric restriction and exercise. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (33), 14863-14868 (2010).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

in vivoNMJNMJ

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены