Eletroporação In Vivo Combinada e Reinervação de Curto Prazo do Músculo Esquelético do Elevador do Crânio Longo do Auris

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo que combina eletroporação in vivo e desnervação do músculo levantador do auro longo do crânio (LAL). Este procedimento permite o estudo do papel potencial das proteínas derivadas do músculo na regeneração da sinapse neuromuscular.

Resumo

A junção neuromuscular (NMJ) é a sinapse periférica que controla a contração das fibras musculares esqueléticas para permitir o movimento coordenado de muitos organismos. Na JNM, um terminal do axônio motor pré-sináptico entra em contato com um domínio pós-sináptico do músculo e é coberto por células terminais de Schwann. A integridade e a função da JNM são comprometidas sob várias condições, incluindo envelhecimento, doenças neuromusculares e lesões traumáticas. Para analisar a contribuição potencial de proteínas derivadas do músculo para a manutenção e regeneração da JNM, uma estratégia de transferência de genes in vivo foi combinada com a desnervação do músculo levantador do auro longo do crânio (LAL) após lesão mecânica do nervo. Descobertas anteriores mostraram que a expressão forçada de proteínas fluorescentes de controle não altera a organização ou neurotransmissão da JNM. Este procedimento tem como objetivo descrever um método detalhado de eletroporação in vivo do músculo LAL seguido de transecção ou esmagamento do ramo específico do nervo facial que inerva os músculos cranianos, levando à denervação e reinervação da JNM, respectivamente. A combinação dessas estratégias experimentais no conveniente músculo LAL constitui um método eficiente para estudar a contribuição potencial da superexpressão ou silenciamento da proteína muscular no contexto da reinervação de NMJ de curto prazo.

Introdução

A junção neuromuscular (JNM) é a sinapse periférica que controla a contração muscular e, indiretamente, o movimento coordenado dos organismos¹. É formado por um axônio motor terminal pré-sináptico, um domínio pós-sináptico muscular enriquecido em receptores de acetilcolina (AChRs) e células de Schwann terminais não mielínicas que cobrem o axônio terminal ^2,3,4. Após a desnervação da JNM devido a lesão traumática do nervo periférico, doença ou intervenção farmacológica, a atividade muscular contrátil é perdida ^5,6. Como certos microambientes permissivos permitem uma recuperação funcional oportuna e eficiente, a busca por proteínas que possam auxiliar no processo de regeneração é uma necessidade permanente. Aqui, dois procedimentos foram combinados para avaliar especificamente o papel potencial da manipulação da expressão da proteína muscular na regeneração de curto prazo da JNM após lesão nervosa.

O músculo levantador do auro longo (LAL), localizado na superfície dorsal do crânio, é um músculo fino e plano que controla o movimento do pavilhão auricular. O músculo LAL consiste em bandas rostral e caudal, cada uma contendo duas ou três camadas de fibras musculares ^7,8. O ramo auricular posterior do nervo facial inerva o músculo LAL, gerando um padrão de inervação bem descrito, consistindo de cinco regiões de inervação rostral (R1-R5) e duas caudais (C1-C2) ^8,9,10. O LAL é um músculo superficialmente exposto e de fácil acesso, portanto, seu uso requer procedimentos minimamente invasivos. Isso permite a visualização da JNM por meio de microscopia em tempo real, liberação de fármacos, bem como a intervenção de preparações musculares completas tanto in vivo quanto ex vivo^11,12. Em conjunto, essas características tornam o músculo LAL um excelente modelo para estudar o comportamento e a função da^JNM10,13.

A eletroporação in vivo é uma técnica de transferência de genes que permite a incorporação de DNA exógeno ao tecido por meio da permeabilização transitória das membranas celulares e da mobilidade do DNA no interior das células, ambas geradas após a indução de um campo elétrico^14,15. Este procedimento é local e pode ser realizado em qualquer fase do desenvolvimento do animal. Considerando as características únicas do músculo LAL, sua eletroporação in vivo representa um procedimento minimamente invasivo, altamente eficiente e rápido¹⁶, possibilitando observar uma expressão proteica robusta dois ou três dias após a eletroporação.

O procedimento de esmagamento do nervo facial tem sido amplamente empregado em pesquisas, pois oferece várias vantagens ^5,17,18. Este protocolo foi previamente modificado para atingir especificamente o ramo auricular posterior do nervo facial que inerva os músculos cranianos, incluindo o músculo LAL, para evitar paralisia facial; Consequentemente, os camundongos não requerem cuidados especiais após a cirurgia (por exemplo, pomada lubrificante para os olhos para a perda do reflexo de piscar). Como a reinervação da JNM no músculo LAL começa entre 7-9 dias após a lesão⁶, é um bom modelo de reinervação de curto prazo em comparação com o modelo comumente usado de lesão por esmagamento nervoso do nervo ciático para desnervar os músculos dos membros posteriores, onde a reinervação ocorre cerca de três semanas após a lesão do nervo¹⁸.

A combinação de eletroporação in vivo e lesão do nervo facial no músculo LAL permitirá aos pesquisadores avaliar o comportamento dos componentes sinápticos contra a modulação de proteínas derivadas do músculo em diferentes momentos da regeneração da JNM, incluindo efeitos morfológicos de curto e longo prazo ^6,16, por meio de uma ampla variedade de técnicas, incluindo ensaios imuno-histoquímicos, histológicos e funcionais.

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais são aprovados pelo Comitê de Bioética da Universidad Austral de Chile, Chile (protocolo nº 503/2023), e seguem as normas impostas pelo Comitê de Bioética da Agência Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento, Chile (ANID), bem como as diretrizes da Diretiva do Conselho Europeu para o Cuidado de Animais de Laboratório. O presente estudo utilizou camundongos CF-1 adultos (3-6 meses de idade) de ambos os sexos (30-45 g). A eutanásia foi realizada por overdose de anestésico inalatório seguida de exsanguinação. Os reagentes e equipamentos utilizados no estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Eletroporação do músculo LAL in vivo

1. Preparação
   1. Sedar suavemente o camundongo em uma câmara de indução de acrílico sob inalação de isofluorano a 2,5% com oxigênio a 0,8 L/min (seguindo protocolos aprovados institucionalmente). Depois disso, mantenha a sedação do camundongo usando uma máscara de tubo nasal conectada a uma máquina de anestesia inalatória sob um estereomicroscópio de dissecação.
      NOTA: Certifique-se de que o mouse esteja dormindo antes de iniciar o procedimento; Teste o reflexo de toque do mouse apertando suavemente um pé com uma pinça (faça esta etapa todas as vezes após a indução da anestesia).
   2. Desinfetar a região cervical ao nível da sutura sagital do crânio com o antisséptico gluconato de clorexidina 2% e injetar por via subcutânea 20 μL de hialuronidase 2 mg/mL em PBS usando uma seringa de Hamilton para facilitar o acesso do plasmídeo de DNA à superfície muscular.
   3. Desligue o fluxo de isofluorano e deixe o mouse respirar oxigênio puro por 1 min.
   4. Pesar o ratinho para calcular a dose adequada de Meloxicam (ver passo 1.3.2.).
   5. Coloque o animal em uma gaiola vazia (sem cama) para se recuperar da anestesia.
   6. Retorne o animal ao alojamento normal por 30 min¹⁶.
2. Procedimento cirúrgico
   1. Reanestesiar o camundongo pela inalação de isofluorano a 2,5% com uma mistura de oxigênio a 0,8 L/min (seguindo protocolos aprovados institucionalmente) e mantê-lo sedado durante todo o procedimento cirúrgico usando uma máquina de anestesia inalatória, sob um estereomicroscópio de dissecação.
   2. Depile a região cervical com lâmina de barbear de dois gumes e desinfete com clorexidina e etanol 70% 3 vezes.
   3. Faça uma incisão de 8 mm sobre a sutura sagital do crânio e exponha o músculo LAL removendo suavemente a gordura e o tecido conjuntivo localizados logo abaixo da pele usando uma tesoura / fórceps.
      NOTA: O músculo LAL é o músculo mais superficial da região cranial após a incisão na pele. É facilmente reconhecido pela orientação das fibras musculares que correm diagonalmente do crânio médio em direção a cada pavilhão auricular ^8,16.
   4. Usando uma seringa de Hamilton, injete 10 μL do DNA obtido comercialmente (0,8-1 μg/μL) em PBS na fáscia que é distribuída por todo o músculo, formando uma bolha.
   5. Colocar dois eletrodos de agulha de ouro separados por 5 mm, paralelos e sobre as fibras musculares, ocupando todo o comprimento do músculo LAL (Figura 1A).
   6. Usando um eletroporador, gere cinco pulsos de 100 V/cm de 20 ms de duração cada, na frequência de 1 Hz.
   7. Repita o procedimento no músculo LAL contralateral (repetindo as etapas 1.2.4-1.2.6).
3. Sutura e recuperação
   1. Sutura (tamanho da cepa 5/0, agulha HR15) a pele com fio de ácido poliglicólico absorvível.
   2. Injetar por via subcutânea o analgésico Meloxicam em doses de 1-2 mg/kg de peso para reduzir a dor pós-cirúrgica.
   3. Desligue o fluxo de isofluorano e deixe o mouse respirar oxigênio puro por 1 min.
   4. Coloque o animal em uma gaiola vazia (sem cama) para se recuperar da anestesia.
   5. Retorne o animal ao seu alojamento normal e monitore-o por 2 dias após a cirurgia ou até sua recuperação. Monitore os sinais de dor ou estresse, alocando escores para cada um dos diferentes parâmetros, considerando os critérios de desfecho humanos descritos anteriormente¹⁹.
      NOTA: Posicione o mouse em uma almofada aquecida coberta com uma almofada cirúrgica para evitar que a temperatura corporal caia durante a cirurgia. Tente não levar mais de 30 minutos para o procedimento cirúrgico, evitando assim que o camundongo morra devido ao excesso de anestesia. Se a proteína expressa produzir baixos níveis de fluorescência, recomenda-se co-eletroporar com um marcador (por exemplo, tdTomato ou GFP) em uma proporção de 1:5 (traçador: DNA de interesse).

2. Denervação induzida por lesão nervosa por esmagamento

NOTA: Este protocolo é uma modificação de um protocolo descrito anteriormente¹⁷. Realize este procedimento com uma diferença de pelo menos 3 dias da eletroporação. Dependendo das questões de pesquisa, esse procedimento pode ser realizado antes ou depois da eletroporação.

1. Anestesia e posicionamento do animal
   1. Realizar a sedação animal em câmara de indução de acrílico sob inalação de isofluorano a 2,5% com oxigênio 0,8 L/min (seguindo protocolos aprovados institucionalmente).
   2. Pesar o ratinho para calcular a dose de Meloxicam (ver passo 2.3.2.).
   3. Mantenha a sedação do camundongo com uma máscara de tubo nasal conectada a uma máquina de anestesia inalatória sob um estereomicroscópio de dissecação.
   4. Posicione o mouse do lado esquerdo (para desnervar o músculo LAL direito). Prenda a orelha direita em direção ao nariz para expor a área posterior do pavilhão auricular.
2. Procedimento cirúrgico
   1. Raspe a área posterior do pavilhão auricular usando uma lâmina de barbear de dois gumes e desinfete com clorexidina e etanol a 70% 3 vezes.
   2. Localize a veia auricular posterior e faça uma incisão na pele, a 2 mm de distância caudal dela, de aproximadamente 5 mm com tesoura de mola. Evite cortar vasos sanguíneos e/ou tecido muscular.
   3. Corte a gordura e os tecidos conjuntivos com pinças e tesouras. Encontre o nervo acessório espinhal; continuar até encontrar o ventre do músculo digástrico e o conduto auditivo cartilaginoso (tecido esbranquiçado semitransparente) (Figura 2A).
   4. Localize o início da ramificação do nervo facial logo abaixo do músculo digástrico.
   5. Siga o ramo auricular posterior (o ramo mais dorsal do nervo facial) e remova suavemente o tecido conjuntivo ao seu redor, evitando cuidadosamente a manipulação direta do nervo.
   6. Esmague o ramo auricular posterior do nervo facial por 30 s, aplicando pressão constante sobre o nervo com uma pinça com uma ponta inclinada de 45°.
3. Sutura e recuperação
   1. Sutura (tamanho da cepa 5/0, agulha HR15) a pele com fio de ácido poliglicólico absorvível.
   2. Injetar por via subcutânea o analgésico Meloxicam em doses de 1-2 mg/kg de peso para reduzir a dor pós-cirúrgica.
   3. Remova a fita do ouvido, desligue o fluxo de isofluorano e deixe o mouse respirar oxigênio puro por 1 min.
   4. Coloque o animal em uma gaiola vazia (sem cama) para se recuperar da anestesia.
   5. Retorne o mouse ao seu alojamento normal e monitore-o por 2 dias após a cirurgia ou até sua recuperação.
   6. Após a recuperação, examine o mouse em busca de falhas no movimento da orelha afetada como sinal de desnervação eficiente.
      NOTA: Em animais de controle simulado, faça uma incisão na pele, exponha o nervo facial sem tocá-lo diretamente e, posteriormente, suture.

Resultados

O alto rendimento quântico de fluorescência da proteína^{tdTomato 20} a torna um marcador apropriado para a eficiência da eletroporação. Portanto, a expressão da proteína tdTomato nos músculos LAL por eletroporação in vivo foi avaliada (Figura 1). Os músculos LAL foram dissecados 21 dias após a eletroporação. As preparações de montagem inteira mostram a fina banda caudal (cLAL, polígono ciano) do músculo LAL c...

Discussão

A combinação de eletroporação muscular in vivo e denervação é uma abordagem experimental valiosa para investigar um nicho regenerativo na JNM⁴. Como o músculo LAL é exposto superficialmente, esses procedimentos combinados podem ser prontamente complementados com a administração de sondas ou drogas que podem afetar a expressão ou atividade da proteína¹². Além disso, a eletroporação de genes repórteres no músculo LA...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
#5/45 Dumont forceps	Fine Science Tools	11251-35	Sterilize before use
anti 2H3	DSHB		Dilute 1 : 300
anti S100 Ready to Use	Dako	IR504	Dilute 1 : 5
anti SV2	DSHB		Dilute 1 : 50
Chlorhexidine gluconate 2%	DifenPharma
Cold light dissecting stereomicroscope	Motic	Model SMZ-171
DAPI	Invitrogen	D1306	Dilute 1 : 100
Dumont #5SF Forceps	Fine Science Tools	11252-00	Sterilize before use
Dumont Mini Forceps –Style 5	Fine Science Tools	11200-14	Sterilize before use
ECM 830 electroporator	BTX Harvard Apparatus
Gold needle-type electrodes	Genetrodes, BTX	45-0114	10 mm straight
Hamilton syringe	Hamilton	80400
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H3884
Inhalation anesthesia machine	SciVerma Scientific	M3000 Table Top
Isoflurane	Baxter	218-082
Mice	Instituto de Salud Publica - Chile		Adult (3-6 months old) CF-1 mice, of both sexes (30-45 g)
Razor blades	Schick
Suture Glicosorb 5/0	TAGUM	GS0812.J	Absorbable polyglycolic acid thread
tdTomato plasmid	Addgene	54642	tdTomato plasmid under the control of the CMV promoter
Tramadol hydrochloride 5% (Triamcol)	Drag Pharma
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	91500-09	Sterilize before use
WGA Alexa Fluor 488	Invitrogen	W7024	Dilute
α-BTX Alexa Fluor 488	Invitrogen	B13422	Dilute 1 : 500