In Vivo Electroporation과 Cranial Levator Auris Longus Skeletal Muscle의 단기 신경 재생이 결합되었습니다.

요약

여기에서는 두개골 거근 장뇨근(LAL)의 생체 내 전기천공법(in vivo electroporation)과 탈질법(denervation)을 결합한 프로토콜을 제시합니다. 이 절차를 통해 신경근 시냅스의 재생에서 근육 유래 단백질의 잠재적 역할을 연구할 수 있습니다.

초록

신경근 접합부(NMJ)는 골격근 섬유의 수축을 제어하여 많은 유기체의 조정된 움직임을 허용하는 말초 시냅스입니다. NMJ에서 시냅스전 운동 축삭돌기 말단은 근육 시냅스 후 도메인과 접촉하고 말단 Schwann 세포로 덮여 있습니다. NMJ의 무결성과 기능은 노화, 신경근 질환 및 외상성 부상을 포함한 여러 조건에서 손상됩니다. NMJ 유지 및 재생에 대한 근육 유래 단백질의 잠재적 기여도를 분석하기 위해 기계적 신경 손상 후 두개골 거근 장(LAL) 근육의 탈관화와 생체 내 유전자 전달 전략이 결합되었습니다. 이전의 연구 결과는 대조군 형광 단백질의 강제 발현이 NMJ 조직이나 신경 전달을 변화시키지 않는다는 것을 보여주었습니다. 이 절차는 LAL 근육의 생체 내 전기천공법 후 두개근육을 자극하는 안면 신경의 특정 가지를 절개 또는 분쇄하여 각각 NMJ 탈뇌 및 재신경 분포를 유도하는 자세한 방법을 설명하는 것을 목표로 합니다. 편리한 LAL 근육에서 이러한 실험 전략의 조합은 단기 NMJ 재신경 분포의 맥락에서 근육 단백질 과발현 또는 침묵의 잠재적 기여를 연구하는 효율적인 방법을 구성합니다.

서문

신경근 접합부(neuromuscular junction, NMJ)는 근육 수축을 조절하고 간접적으로 유기체의 조정된 움직임을 조절하는 말초 시냅스입니다¹. 그것은 시냅스전 운동 축삭 말단, 아세틸콜린 수용체(AChRs)가 풍부한 근육 시냅스 후 도메인 및 축삭 말단 ^2,3,4를 덮고 있는 비수초 말단 Schwann 세포에 의해 형성됩니다. 외상성 말초 신경 손상, 질병 또는 약물 중재로 인한 NMJ 탈관되면 수축 근육 활동이 손실됩니다 ^5,6. 특정 허용 미세환경이 시기적절하고 효율적인 기능 회복을 가능하게 하기 때문에 재생 과정에 도움이 될 수 있는 단백질을 찾는 것은 영구적인 필요성입니다. 여기에서는 신경 손상 후 NMJ의 단기 재생에서 근육 단백질 발현 조작의 잠재적 역할을 구체적으로 평가하기 위해 두 가지 절차가 결합되었습니다.

두개골의 등쪽 표면에 위치한 LAL(levator auris longus) 근육은 귓바퀴의 움직임을 제어하는 얇고 편평한 근육입니다. LAL 근육은 로스트랄 밴드와 꼬리 밴드로 구성되며, 각 밴드는 2개 또는 3개의 근육 섬유를 포함하고^{있습니다 7,8}. 안면 신경의 후이(posterior auricular branch)는 LAL 근육을 자극하여 5개의 꼬리(rostral, R1-R5) 및 2개의 꼬리(c1-C2) 신경 분포 영역(^8,9,10)으로 구성된 잘 설명된 신경 분포 패턴을 생성합니다. LAL은 표면적으로 노출되어 쉽게 접근할 수 있는 근육이므로 이를 사용하려면 최소 침습적 절차가 필요합니다. 이를 통해 실시간 현미경, 약물 전달, in vivo 및 ex vivo^11,12 모두에서 완전한 근육 제제의 개입을 사용하여 NMJ를 시각화할 수 있습니다. 이러한 특징들은 모두 볼 때, LAL 근육을 NMJ 행동과 기능을 연구하기 위한 훌륭한 모델로 만든다^10,13.

생체 내 전기천공법은 세포막의 일시적인 투과화와 세포 내 DNA의 이동성을 통해 외인성 DNA를 조직에 통합할 수 있도록 하는 유전자 전달 기술이며, 둘 다 전기장^14,15을 유도한 후 생성됩니다. 이 절차는 지역적이며 동물 발달의 모든 단계에서 수행 할 수 있습니다. LAL 근육의 독특한 특징을 고려할 때, 생체 내 전기천공법은 최소 침습적이고 매우 효율적이며 빠른 절차⁽¹⁶)를 나타내며, 전기천공법 2-3일 후에 강력한 단백질 발현을 관찰할 수 있다.

안면 신경 파쇄 절차는 몇 가지 이점을 제공하기 때문에 연구에 널리 사용되어 왔습니다 ^5,17,18. 이 프로토콜은 안면 마비를 피하기 위해 LAL 근육을 포함한 두개골 근육을 자극하는 안면 신경의 후귀 가지를 특이적으로 표적으로 삼도록 이전에 수정되었습니다. 결과적으로, 마우스는 수술 후 특별한 관리가 필요하지 않습니다(예: 눈 깜박임 반사 상실을 위한 눈 연고 윤활). LAL 근육에서의 NMJ 재신경 자극은 부상 후 7-9일 후에 시작되므^로6, 신경 손상 후 약 3주 후에 재신경 자극이 발생하는 뒷다리 근육을 변질시키기 위해 일반적으로 사용되는 좌골 신경의 신경 파쇄 손상 모델에 비해 우수한 단기 신경 재신경 자극 모델이다¹⁸.

LAL 근육에서의 생체 내 전기천공법과 안면 신경 손상의 조합을 통해 연구자들은 면역조직화학적, 조직학적 및 기능적 분석을 포함한 다양한 기술을 통해 단기 및 장기 형태학적 효과 ^6,16를 포함하여 NMJ 재생의 다양한 시기에 근육 유래 단백질 조절에 대한 시냅스 구성 요소의 거동을 평가할 수 있습니다.

프로토콜

모든 실험 절차는 칠레 오스트랄 대학교(Universidad Austral de Chile)의 생명윤리위원회(프로토콜 Nr. 503/2023)의 승인을 받았으며, 칠레 국립연구개발청(ANID)의 생명윤리위원회(Bioethics Committee)에서 부과한 규범과 실험동물 관리에 대한 유럽이사회 지침(European Council Directive for the Care of Laboratory Animals)의 지침을 따랐습니다. 본 연구는 남녀 모두(30-45g)의 성인(3-6개월령) CF-1 마우스를 사용했습니다. 안락사는 흡입제, 마취제, 과다 투여 후 출혈에 의해 이루어졌다. 연구에 사용된 시약 및 장비는 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 생체 내 LAL 근육 전기천공법

1. 준비
   1. 0.8L/min 산소와 함께 2.5% 이소플루오란을 흡입한 상태에서 아크릴 유도 챔버에서 마우스를 부드럽게 진정시킵니다(기관에서 승인한 프로토콜에 따름). 그 후, 해부 실체 현미경 아래에서 흡입 마취 기계에 연결된 코 튜브 마스크를 사용하여 마우스 진정을 유지합니다.
      알림: 절차를 시작하기 전에 마우스가 절전 상태인지 확인하십시오. 집게로 한쪽 발을 부드럽게 눌러 마우스의 터치 반사를 테스트합니다(마취를 유도한 후 매번 이 단계를 수행).
   2. 소독제인 클로르헥시딘 글루코네이트 2%로 두개골의 시상 봉합사 수준에서 자궁 경부를 소독하고 Hamilton 주사기를 사용하여 PBS에 2mg/mL 히알루로니다아제 20μL를 피하로 주입하여 근육 표면에 대한 DNA 플라스미드 접근을 용이하게 합니다.
   3. 이소플루오란 흐름을 끄고 마우스가 1분 동안 순수한 산소를 호흡하도록 합니다.
   4. 적절한 Meloxicam 복용량을 계산하기 위해 마우스의 무게를 잰다(1.3.2단계 참조).
   5. 동물을 빈 우리(침구 없이)에 넣어 마취에서 회복합니다.
   6. 동물을 30분 동안 일반 사육장으로 돌려보냅니다¹⁶.
2. 수술 절차
   1. 0.8L/min 산소 혼합물이 포함된 2.5% 이소플루오란을 흡입하여 마우스를 다시 마취하고 (기관에서 승인된 프로토콜에 따름) 해부 실체현미경 아래에서 흡입 마취 기계를 사용하여 수술 절차 전반에 걸쳐 진정 상태를 유지합니다.
   2. 양날 면도날을 사용하여 자궁 경부 부위를 면도하고 클로르헥시딘과 70 % 에탄올로 3 회 소독합니다.
   3. 두개골의 시상 봉합사 위를 8mm 절개하고 가위/겸자를 사용하여 피부 바로 아래에 위치한 지방과 결합 조직을 부드럽게 제거하여 LAL 근육을 노출시킵니다.
      참고: LAL 근육은 피부 절개 후 두개골 영역에서 가장 표재적인 근육입니다. 그것은 중간 두개골에서 각 귓바퀴 ^8,16쪽으로 대각선으로 달리는 근육 섬유의 방향에 의해 쉽게 인식됩니다.
   4. Hamilton 주사기를 사용하여 PBS에서 상업적으로 얻은 DNA(0.8-1μg/μL) 10μL를 근육 전체에 분포된 근막에 주입하여 기포를 형성합니다.
   5. LAL 근육의 전체 길이를 차지하는 두 개의 금 바늘 전극을 5mm 간격으로 평행하게 근육 섬유 위에 배치합니다(그림 1A).
   6. electroporator를 사용하여 1Hz 주파수에서 각각 20ms 기간의 100V/cm의 펄스 5개를 생성합니다.
   7. 반대쪽 LAL 근육에서 절차를 반복합니다(1.2.4-1.2.6단계 반복).
3. 봉합 및 회복
   1. 흡수성 폴리글리콜산 실로 피부를 봉합(5/0 변형 크기, HR15 바늘)합니다.
   2. 수술 후 통증을 줄이기 위해 진통제인 Meloxicam을 1-2mg/kg의 용량으로 피하 주사합니다.
   3. 이소플루오란 흐름을 끄고 마우스가 1분 동안 순수한 산소를 호흡하도록 합니다.
   4. 동물을 빈 우리(침구 없이)에 넣어 마취에서 회복합니다.
   5. 동물을 원래 사육장으로 돌려보내고 수술 후 2일 동안 또는 회복될 때까지 관찰하십시오. 통증 또는 스트레스 징후를 모니터링하고 이전에 설명한 인도적 종점 기준을 고려하여 서로 다른 매개변수 각각에 대한 점수를 할당합니다¹⁹.
      알림: 수술 중 체온이 떨어지는 것을 방지하기 위해 수술 패드로 덮인 가열된 패드에 마우스를 놓습니다. 수술 과정에 30분 이상 걸리지 않도록 하여 과도한 마취로 인해 쥐가 죽는 것을 방지하십시오. 발현된 단백질의 형광 수준이 낮으면 추적자(예: tdTomato 또는 GFP)와 1:5 비율(추적자: 관심 DNA)로 동시 전기화하는 것이 좋습니다.

2. 분쇄 신경 손상으로 인한 탈핵화

참고: 이 프로토콜은 이전에 설명한 프로토콜¹⁷의 수정 사항입니다. electroporation에서 적어도 3 일의 차이로 이 절차를 따르십시오. 연구 질문에 따라 이 절차는 전기천공법 전후에 수행할 수 있습니다.

1. 마취 및 동물 위치 지정
   1. 2.5L / min 산소와 0.8 L / min 산소를 흡입 한 아크릴 유도 챔버에서 동물 진정을 수행합니다 (기관에서 승인 한 프로토콜에 따름).
   2. Meloxicam 투여량을 계산하기 위해 마우스의 무게를 잰다(2.3.2단계 참조).
   3. 해부 실체 현미경 아래에서 흡입 마취 기계에 연결된 코 튜브 마스크로 마우스 진정을 유지합니다.
   4. 마우스를 왼쪽에 놓습니다(오른쪽 LAL 근육을 제거하기 위해). 오른쪽 귀를 코 쪽으로 테이프로 붙여서 귓바퀴의 뒤쪽 부분을 노출시킵니다.
2. 수술 절차
   1. 양날 면도날을 사용하여 귓바퀴의 뒤쪽을 면도하고 클로르헥시딘과 70% 에탄올로 3회 소독합니다.
   2. 후방 귓바퀴 정맥을 찾아 봄 가위로 꼬리 방향으로 2mm 떨어진 피부를 약 5mm 절개합니다. 혈관 및/또는 근육 조직을 절단하지 마십시오.
   3. 집게와 가위로 지방과 결합 조직을 자릅니다. 척추 부속 신경을 찾으십시오. 이위근의 배와 연골 이도(반투명하고 희끄무레한 조직)를 찾을 때까지 계속합니다(그림 2A).
   4. 이위근 바로 아래에서 분기되는 안면 신경의 시작 부분을 찾습니다.
   5. 후방 귓바퀴 가지(안면 신경의 가장 등쪽 가지)를 따라가면서 이를 둘러싼 결합 조직을 부드럽게 제거하고 직접적인 신경 조작을 피하십시오.
   6. 안면 신경의 후이치 가지를 30초 동안 부수고 팁이 45° 각도로 된 집게로 신경에 일정한 압력을 가합니다.
3. 봉합 및 회복
   1. 흡수성 폴리글리콜산 실로 피부를 봉합(5/0 변형 크기, HR15 바늘)합니다.
   2. 수술 후 통증을 줄이기 위해 진통제인 Meloxicam을 1-2mg/kg의 용량으로 피하 주사합니다.
   3. 귀에서 테이프를 제거하고 이소플루오란 흐름을 끈 다음 마우스가 1분 동안 순수한 산소를 호흡하도록 합니다.
   4. 동물을 빈 우리(침구 없이)에 넣어 마취에서 회복합니다.
   5. 마우스를 원래 있던 곳으로 되돌려 놓고 수술 후 2일 동안 또는 회복될 때까지 관찰합니다.
   6. 회복 후, 효율적인 탈뇌의 신호로 영향을 받은 귀의 움직임에 실패가 있는지 마우스를 검사합니다.
      참고: 가짜 대조군 동물의 경우 피부를 절개하고 안면 신경을 직접 만지지 않고 노출시킨 후 봉합합니다.

결과

tdTomato 단백질²⁰의 높은 형광 양자 수율은 전기천공법 효율에 적합한 추적자입니다. 따라서, in vivo electroporation에 의한 LAL 근육에서의 tdTomato 단백질의 발현을 평가하였다(그림 1). LAL 근육은 전기천공법 21일 후에 절개하였다. 전체 마운트 준비는 두 개의 신경 분포 영역이 있는 LAL 근육의 얇은 꼬리 밴드(cLAL, 청록색 다각형)와 ...

토론

in vivo muscle electroporation과 denervation의 조합은 NMJ⁴에서 재생 틈새를 조사하는 데 유용한 실험적 접근 방식입니다. LAL 근육은 표면적으로 노출되어 있기 때문에, 이러한 결합된 절차는 단백질 발현 또는 활성에 영향을 미칠 수 있는 프로브 또는 약물의 전달로 쉽게 보완될 수 있다¹². 또한, 리포터 유전자를 LAL 근육에 전기천공하는 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
#5/45 Dumont forceps	Fine Science Tools	11251-35	Sterilize before use
anti 2H3	DSHB		Dilute 1 : 300
anti S100 Ready to Use	Dako	IR504	Dilute 1 : 5
anti SV2	DSHB		Dilute 1 : 50
Chlorhexidine gluconate 2%	DifenPharma
Cold light dissecting stereomicroscope	Motic	Model SMZ-171
DAPI	Invitrogen	D1306	Dilute 1 : 100
Dumont #5SF Forceps	Fine Science Tools	11252-00	Sterilize before use
Dumont Mini Forceps –Style 5	Fine Science Tools	11200-14	Sterilize before use
ECM 830 electroporator	BTX Harvard Apparatus
Gold needle-type electrodes	Genetrodes, BTX	45-0114	10 mm straight
Hamilton syringe	Hamilton	80400
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H3884
Inhalation anesthesia machine	SciVerma Scientific	M3000 Table Top
Isoflurane	Baxter	218-082
Mice	Instituto de Salud Publica - Chile		Adult (3-6 months old) CF-1 mice, of both sexes (30-45 g)
Razor blades	Schick
Suture Glicosorb 5/0	TAGUM	GS0812.J	Absorbable polyglycolic acid thread
tdTomato plasmid	Addgene	54642	tdTomato plasmid under the control of the CMV promoter
Tramadol hydrochloride 5% (Triamcol)	Drag Pharma
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	91500-09	Sterilize before use
WGA Alexa Fluor 488	Invitrogen	W7024	Dilute
α-BTX Alexa Fluor 488	Invitrogen	B13422	Dilute 1 : 500