In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف البروتوكول المقدم هنا الخطوات التفصيلية لإجراء دراسات فعالية الدواء في نموذج التوهج الحيوي لعدوى المثقبية الكروزية ، مع التركيز على الحصول على البيانات وتحليلها وتفسيرها. كما يتم توفير إجراءات استكشاف الأخطاء وإصلاحها ومراقبة الجودة لتقليل المشكلات الفنية.

Abstract

ومن أجل مكافحة وخفض تأثير الأمراض الأولية البشرية على الصحة العامة مثل داء شاغاس وداء الليشمانيات وداء المثقبيات الأفريقي البشري، من الضروري التعجيل بتطوير عقاقير ولقاحات جديدة. ومع ذلك، فإن هذه العملية مليئة بصعوبات مثل بيولوجيا الطفيليات المعقدة للغاية والتسبب في الأمراض، وكما هو الحال بالنسبة لأمراض المناطق المدارية المهملة، فإن التمويل المحدود نسبيا للبحث والتطوير. وبالتالي ، فإن نماذج الدراسة في المختبر وفي الجسم الحي التي يمكنها إعادة إنتاج السمات الرئيسية للعدوى والمرض بشكل كاف مع توفير الاستخدام الرشيد للموارد ضرورية لتقدم البحث عن هذه الحالات. ومن الأمثلة على ذلك نموذج الفأر لتصوير التلألؤ الحيوي في الجسم الحي (BLI) لمرض شاغاس، الذي يوفر كشفا شديد الحساسية للضوء طويل الطول الموجي الناتج عن طفيليات المثقبية الكروزية التي تعبر عن لوسيفيراز. على الرغم من أن هذه التقنية أصبحت النهج القياسي لفعالية الأدوية في دراسات الجسم الحي ، إلا أن مجموعات البحث قد لا تزال تكافح من أجل تنفيذها بسبب نقص التدريب العملي المناسب على التعامل مع المعدات وتطبيق إجراءات مراقبة الجودة ، حتى عندما تكون معدات BLI المناسبة متاحة بسهولة. بالنظر إلى هذا السيناريو ، يهدف هذا البروتوكول إلى التوجيه من تخطيط التجارب إلى الحصول على البيانات وتحليلها ، مع التفاصيل التي تسهل تنفيذ البروتوكولات في مجموعات البحث ذات الخبرة القليلة أو المعدومة مع BLI ، إما لمرض شاغاس أو لنماذج الفئران الأخرى للأمراض المعدية.

Introduction

مرض شاغاس متوطن في أمريكا اللاتينية ويصيب ما يقرب من سبعة ملايين شخص في جميع أنحاء العالم1. سنويا ، أكثر من 50000 حالة وفاة وخسائر اقتصادية تبلغ حوالي 7 مليارات دولار ناتجة عن الطبيعة المعوقة لهذا المرض2. يحدث مرض شاغاس بسبب المثقبية الكروزية الأولية ، وهو طفيلي هيموفلاجيلات غير متجانس قادر على إصابة الثدييات (البرية والمنزلية) ونواقل الترياتومين (Hemiptera ، Reduviidae)3 في الأمريكتين ، حيث يتم تأسيس انتقال النواقل. تشمل طرق العدوى المهمة الأخرى نقل الدم وزرع الأعضاء والفم (عن طريق تناول طعام ملوث بالترياتومين المصاب)4 والانتقال الخلقي. وقد أسهمت طرق الانتقال غير الناقلة في انتشار داء شاغاس إلى المناطق غير الموبوءة 3,5.

يتجلى مرض شاغاس في مرحلتين سريريتين. المرحلة الحادة ، في معظم الحالات ، بدون أعراض. عادة ما ترتبط العدوى المصحوبة بأعراض بعلامات غير محددة مثل الحمى والتعب والألم العضلي واعتلال العقد اللمفية وتضخم الطحال وتضخم الكبد. غالبا ما ترتبط المرحلة الحادة أيضا بطفيليات براءات الاختراع والدورة الدموية الجهازية للطفيليات. قد تحدث الوفاة في ما يصل إلى 10٪ من الحالات التي تم تشخيصها ، خاصة في حالات العدوى الفموية6. غالبا ما تتميز المرحلة المزمنة بفترة طويلة من عدم وجود أي أعراض. مع مرور الوقت ، يظهر ما يقرب من ثلث المرضى المصابين قبل عقود مظاهر قلبية ، وعادة ما تكون مصحوبة بالتليف والتهاب عضلة القلب ، و / أو اضطرابات الجهاز الهضمي المرتبطة في الغالب بتطور تضخم المريء و / أو متلازمات تضخم القولون3،5،6.

يتكون العلاج المسبب لمرض شاغاس من عقارين فقط: بنزنيدازول ونيفورتيموكس. هذه العوامل المضادة للطفيليات متاحة منذ أكثر من 50 عاما ولها سمية كبيرة وفعالية محدودة5،7،8. وبالتالي، هناك حاجة ملحة لتطوير علاجات جديدة وآمنة وأكثر فعالية لمرضى داء شاغاس.

تقنيات أكثر تطورا ودقة تجعل من الممكن الآن الحصول على إجابات للأسئلة القديمة التي تسمح بالتقدم في البحث عن علاجات جديدة لمرض شاغاس. بهذا المعنى ، يستفيد المجتمع العلمي بشكل كبير من الطفيليات المعدلة وراثيا للدراسات في الجسم الحي حول مسار العدوى وتقييم فعالية الدواء9،10،11،12. يسمح الفحص الطولي القائم على نظام التصوير الحيوي (BLI) بتقييم الفعالية أثناء وبعد نظام العلاج ، مما يؤدي إلى تحديد المركبات ذات نشاط المثقبيات10,13. توفر طريقة BLI قياسا مباشرا لحمل الطفيليات ، سواء في الدورة الدموية أو في الأنسجة والأعضاء ، من خلال تحديد كمية الضوء الناتج عن T. cruzi CL Brener Luc المعدل وراثيا :: سلالةالنيون 11 ، والتي تعبر بشكل أساسي عن اليراع الأحمر luciferase12.

ومع ذلك ، بعد ما يقرب من 10 سنوات من إنشاء النموذج الحيواني لمرض شاغاس BLI ودراسات فعالية الأدوية ، لا تهيمن على هذه التقنية سوى عدد قليل من المجموعات البحثية. هذه الحقيقة لا ترجع فقط إلى انخفاض الوصول إلى معدات التصوير المناسبة ولكن أيضا إلى نقص التدريب وتوافر بروتوكولات منظمة ومفصلة. تقدم هذه الطريقة العديد من المزايا مقارنة بالأساليب الأخرى ، والتي تعتمد على تقييم الطفيليات عن طريق الفحص المجهري أو الأمصال أو تقييم عدوى الأعضاء / الأنسجة بواسطة qPCR للكشف عن الحمض النووي للطفيلي ، لأنها تسمح بتحسين رفاهية الفئران وتقليل استخدام من خلال إمكانية توليد بيانات أكثر قوة وتكاملا في الجسم الحي. علاوة على ذلك ، يمكن القول إن هذه الطريقة أكثر حساسية ، لأنها تتيح الكشف السهل عن بؤر الطفيليات في الأعضاء الحشوية بعد العلاج بالعقاقير10,12. لذلك ، يهدف هذا البروتوكول إلى توجيه مجموعات البحث في علم الطفيليات والأمراض المعدية الأخرى لإنشاء هذه المنهجية في مختبراتها من خلال تفصيل الإجراءات الفنية. وهنا، نتشاطر الخبرة المكتسبة من خلال تنفيذ نموذج BLI لمرض شاغاس في البرازيل، وهو الأول من نوعه في أمريكا اللاتينية، كجزء من جهود اكتشاف الأدوية التي تنسقها مبادرة أدوية الأمراض المهملة (DNDi).

Protocol

تم تقديم جميع الإجراءات الموضحة في هذا البروتوكول والموافقة عليها وتنفيذها وفقا للمبادئ التوجيهية14 التي وضعتها لجنة أخلاقيات التابعة لمعهد العلوم الطبية الحيوية في جامعة ساو باولو: بروتوكول CEUA ICB / USP no 5787250522.

1. الحلول

ملاحظة: ضع في اعتبارك الحجم المعطى مسبقا البالغ 10 مل / كجم (200 ميكرولتر لوزن الفأر 20 جم) 15,16. على سبيل المثال ، قم بإعداد محلول عمل 15 مجم / مل للوصول إلى 150 مجم / كجم من جرعات.

  1. مركبة تعليق هيدروكسي بروبيل ميثيل سلولوز (HPMC-SV)
    ملاحظة: الكواشف المطلوبة هي 0.5٪ (وزن / حجم) هيدروكسي بروبيل ميثيل سلولوز (HPMC) ، 0.4٪ (v / v) توين 80 ، و 0.5٪ (v / v) كحول البنزيل.
    1. للحصول على 200 مل من محلول السيارة ، قم بوزن 1 جم من HPMC وقم بإذابة 64 مل من الماء الساخن عالي النقاء. يقلب لمدة 2 دقيقة.
    2. أضف 120 مل من الماء المثلج عالي النقاء وحركه لمدة 1 ساعة. أضف 1 مل من كحول البنزيل.
    3. ثم أضف 0.8 مل من Tween 80 باستخدام تقنية السحب العكسي واستمر في التقليب حتى يصبح المحلول شفافا.
    4. اضبط الحل للحجم النهائي البالغ 200 مل. قم بتخزين HPMC-SV في الثلاجة (4 درجات مئوية) لمدة أقصاها 3 أشهر.
  2. بنزنيدازول
    1. احسب الكمية اللازمة من المحلول المركب ، على النحو التالي:
      حجم المحلول المركب = (عدد الجرعات في كل يوم × عدد الأيام × عدد الفئران المراد علاجها × الحجم المعطى في كل فأر) + 30٪ إضافية.
    2. وزن الكمية اللازمة من البنزنيدازول (BZ) ، مع الأخذ في الاعتبار الجرعة المطلوبة. للعلاج العلاجي ، جرعة فموية من 100 ملغ / كغ مرة واحدة يوميا لمدة 10 أيام تحقق الشفاء بنسبة 100 ٪ في نموذج CD المزمن17.
    3. بالنظر إلى الحجم النهائي المطلوب ، احسب الكمية المناسبة للوصول إلى تركيز 5٪ (v / v) DMSO وقم بإذابة BZ تماما في DMSO أنيق.
    4. أضف الحجم المناسب للمركبة إلى أنبوب زجاجي للوصول إلى تركيز 95٪ (v / v) HPMC-SV. انقل BZ المذاب في DMSO إلى الأنبوب الزجاجي الذي يحتوي على HPMC-SV. تجانس التعليق بقوة وتخزينه عند 4 درجات مئوية.
      على سبيل المثال: الحجم النهائي لتركيبة BZ = 10 مل (الخطوة 1.2.1)
      كمية BZ = 100 مجم (الخطوة 1.2.2)
      5٪ DMSO = 0.5 مل (الخطوة 1.2.3) و 95٪ HPMC-SV = 9.5 مل (الخطوة 1.2.4)
    5. قبل كل إعطاء الدواء ، يتم وضع التركيبات في حمام مائي بالموجات فوق الصوتية لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية ويتم تجانسها بقوة قبل جرعات.
  3. سيكلوفوسفاميد
    1. قم بإذابة الكمية اللازمة من سيكلوفوسفاميد في ماء عالي النقاء لتحقيق محلول 12.5 مجم / مل.
    2. تعقيم المحلول عن طريق الترشيح وتخزينه على حرارة 4 درجات مئوية.
  4. جيمسا وصمة عار
    1. حل 0.6 ملغ من كاشف مسحوق Giemsa في 50 مل من الميثانول. أضف 25 مل من الجلسرين واخلطه. قم بإزالة الرواسب باستخدام ورق الترشيح والقمع. قم بتخزين محلول المخزون في درجة حرارة الغرفة (RT) ، محميا من الضوء.
    2. تحضير محلول عملي عن طريق تخفيف 10 مل من محلول Giemsa في 90 مل من محلول مزيج الفوسفات (20.5 m Na2HPO4 ، 65.4 M KH2PO4 عند الرقم الهيدروجيني 7.2).

2. ثقافة المثقبية الكروزية

  1. العمل في خزانة السلامة البيولوجية (BSC) ، قم بزراعة 4 × 106 epimastigotes / mL من T. cruzi CL Brener Luc::Neon11 في وسائط LIT (68.44 mM NaCl ، 5.36 mM KCl ، 112.7 mMNa 2HPO4 ، 5 جم / لتر تريبتون ، 5 جم / لتر مرق تسريب الكبد ، 0.03 M hemin ، 4.16 mM glucose) ، مكمل ب 10٪ (v / v) مصل الجنين البقري (FBS) ، 100 ميكروغرام / مل من البنسلين ، 100 وحدة / مل من الستربتومايسين و 150 ميكروغرام / مل من الهيغروميسين كدواء انتقائي عند 28 درجة مئوية. تحقق الطفيليات عادة مرحلة ثابتة في 3-4 أيام.
  2. تحفيز تكوين metacyclogenesis للحصول على الطفيليات المعدية عن طريق احتضان 3 × 108 epimastigotes في 10 مل من وسط حشرة Grace's مع 10٪ (v / v) FBS في أنابيب مخروطية سعة 15 مل عند 28 درجة مئوية لمدة 7-10 أيام.
  3. تقييم معدل التمايز عن طريق مسحات تلطيخ جيمسا. لذلك ، انشر 20 ميكرولتر من الطفيليات المتمايزة في شريحة زجاجية واتركها تجف لمدة 10 دقائق.
  4. في غطاء الدخان ، تابع تثبيت العينة عن طريق تغطية الشريحة الزجاجية بالميثانول الأنيق واتركها تجف تماما (1-2 دقيقة). قم بتغطية الشريحة الزجاجية بمحلول عمل Giemsa لمدة 20 دقيقة.
  5. اغسل الشريحة الزجاجية برفق بالماء المقطر. في المجهر ، احسب النسبة المئوية للمثقبيات الحلقية. إذا تم تحقيق معدل تمايز لا يقل عن 10 بالمائة ، فانتقل إلى الخطوة التالية.
  6. أجهزة الطرد المركزي الطفيليات (120 × غرام لمدة 10 دقائق) وإعادة تعليق بيليه مع 10 مل من DPBS. أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى وإعادة تعليق الطفيليات في 5 مل من DMEM تستكمل مع 10 ٪ (v / v) من FBS ، 100 ميكروغرام / مل البنسلين ، و 100 وحدة / مل الستربتومايسين.
  7. في دورق مزرعة 25 سم2 ، قم بإجراء عدوى 1.66 × 105 خلايا LLC-MK2 (الخلايا الظهارية الكلوية من Macaca mulatta) عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO2 ، في حاضنة مرطبة18.
  8. يتم إطلاق المثقبيات المزروعة بالأنسجة (TCTs) في الوسط بعد 8-9 أيام. تصيب الخلايا أحادية الطبقة LLC-MK2 الجديدة ب TCTs عند تعدد العدوى (MOI) من 1:40.

3. تحليل تجانس مجموعة المثقبية الكروزية بواسطة مقياس التدفق الخلوي

  1. اجمع TCTs من سلالات CL Brener Luc::Neon و CL Brener من النوع البري ، وأجهزة الطرد المركزي عند 120 × g لمدة 10 دقائق ، وأعد تعليق TCTs في DPBS. اضبط كثافة الطفيليات لتحقيق 1 × 106 / مل.
  2. تابع تحليل السكان بواسطة مقياس التدفق الخلوي بناء على مضان mNeonGreen (على سبيل المثال 506 / em. 517 نانومتر) 19 ، والحصول على ما لا يقل عن 20000 حدث لكل عينة.
    ملاحظة: يتم الحصول على النسبة المئوية لأعداد الفلورسنت من خلال مقارنة النوع البري بالطفيلي المنقول. للمضي قدما في عدوى الفئران ، يجب تحقيق ما لا يقل عن 95٪ من سكان الطفيليات الفلورية من سلالة CL Brener Luc::Neon (الشكل التكميلي 1).

4. عدوى الفئران التجريبية

ملاحظة: لزيادة كمية الطفيليات ، يتم الحصول على المثقبيات في مجرى الدم (BT) بشكل متكرر من الفئران التي تعاني من نقص المناعة10،13. هنا ، يتم استخدام كبت المناعة الكيميائية للفئران BALB / C للحصول على BT. لذلك ، يتم تحقيق كبت مناعي خفيف بأربع حقن داخل الصفاق من سيكلوفوسفاميد (CTX) عند 62.5 مجم / كجم مع فترات 96 ساعة ، والتي يتم إجراؤها بالتزامن مع عدوى T. cruzi .

  1. يتم تطبيق 62.5 ملغ/ كغ من سيكلوفوسفاميد المعقم عن طريق الحقن داخل الصفاق (i.p.) قبل 1 يوم من عدوى المكورة الكروزي .
  2. تصيب كل فأرة ب 1 × 104 TCTs في 0.2 مل من DPBS من خلال الطريق داخل الصفاق. الانتباه إلى المخاطر العالية للحوادث عند التعامل مع مسببات الأمراض والإبر. أداء العدوى في BSC ، وارتداء القفازات ودرع الوجه خلال الإجراء بأكمله.
  3. مراقبة الطفيليات يوميا عن طريق الملاحظة المباشرة ل BT في الدم (طريقة Pizzi-Brener)20. في ذروة الطفيليات ، حوالي 13-17 يوما بعد الإصابة (dpi) ، قم بجمع الدم. لذلك ، تخدير الفئران ب 100 مجم / كجم من الكيتامين و 10 مجم / كجم من الزيلازين.
  4. عندما يتم تخدير الفئران تماما21 ، تابع ثقب القلب باستخدام حقنة 1 مل متصلة بإبرة 24 G X3 / 4 تحتوي على 50 ميكرولتر من 3.8٪ (وزن / حجم) سترات الصوديوم. افصل الإبرة وضع الدم برفق في أنبوب طرد مركزي.
  5. في BSC ، قم بإجراء تخفيف لقسامة الدم في محلول تحلل كلوريد الأمونيوم والبوتاسيوم (ACK) وعد الطفيليات في غرفة نيوباور. كرر هذا الإجراء مرتين على الأقل ، حيث تؤثر جلطات الدم الصغيرة على عدد الطفيليات.
    ملاحظة: لمنع أخطاء العد ، اضبط عامل التخفيف لتجنب العد أقل من 30 وأعلى من 300 تريبوماستيغوت في غرفة نيوباور.
  6. اضبط كثافة الطفيلي على 5 × 103 BT / مل عن طريق خلط الكمية اللازمة من الدم النقي في DPBS.
  7. تصيب الفئران غير المثبطة للمناعة BALB / c ب 1 × 103 BT في 0.2 مل من DPBS لكل فأر (5 × 103 BT / mL) عن طريق الطريق داخل الصفاق باستخدام إبرة 26 G (الإبر الأضيق تؤدي إلى تحلل الطفيليات)22. بعد حقن الحجم داخل الصفاق ، أمسك الإبرة داخل الماوس لمدة 5 ثوان لتجنب التدفق العكسي.
  8. ضع الفئران المصابة مؤقتا في صندوق به منشفة ورقية لتحديد التسرب أو النزيف المحتمل ثم أعد الفئران إلى أقفاصها.

5. التصوير في الجسم الحي

ملاحظة: فيما يلي مسرد المصطلحات المستخدمة هنا:

جلسة تصوير: يتم إجراء اكتساب التلألؤ البيولوجي في جميع مجموعات تجربة معينة في يوم معين. يوضح الشكل 1 أ نظرة عامة على الإجراء.

جولة التصوير: يتم إجراء العملية في مجموعات فرعية من ثلاثة فئران ، من حقن D-luciferin إلى التعافي من التخدير. يوصى بأن تحتوي كل مجموعة تجريبية على 6 فئران ، بسبب التباين الجوهري للفئران في حمل الطفيليات والعوامل الأخرى التي تؤثر على القياس الكمي ل BLI الموصوف أدناه.

اقتناء التصوير: التصوير الضوئي الذي تقوم به معدات التصوير لتحديد التلألؤ البيولوجي ، مما ينتج عنه تراكب صورة للصورة والتلألؤ البيولوجي الكمي الموضح كمقياس ألوان زائف.

إجراء التصوير: جميع الخطوات التي تمت مناقشتها في هذه الجلسة من البروتوكول.

figure-protocol-9157
الشكل 1: الحصول على بيانات BLI. (أ) رسم تخطيطي لسير عمل الاقتناء المطبق على دراسات الأمراض المعدية ، باستخدام نموذج الفأر المضيء بيولوجيا لمرض شاغاس كمثال. يتم تحليل الفئران المصابة ب T. cruzi المعدلة وراثيا عن طريق التصوير في الجسم الحي على النقاط الزمنية المحددة. في كل جولة تصوير ، يتم حقن مجموعات تصل إلى ثلاثة فئران ب 150 مجم / كجم من الركيزة الإنزيمية (D-luciferin). بعد 5 دقائق ، يتم إعطاء التخدير بنسبة 2.5٪ (v / v) إيزوفلوران في الأكسجين. عندما تكون بلا حراك تماما ، يتم وضع الفئران في نظام تصوير ، ويبدأ الاستحواذ باتباع الإعدادات المحددة. بعد التصوير ، تتعافى الفئران من التخدير وتعود إلى الأقفاص. يتم تمييز الأسئلة والقضايا المتكررة التي قد يواجهها الباحثون ويواجهونها أثناء الاستحواذ باللون الأحمر. تم تعديل هذا المخطط من Lewis et al. (2014) 12 (تم إنشاؤه باستخدام BioRender.com: UD26KWEVS2). (ب) حركية في الجسم الحي ل D-luciferin / luciferase اليراع الأحمر (PpyRE9h). تم تخدير الفئران في ذروة الطفيليات T. cruzi (ن = 3) وحقنها ب 150 مغ/كغ د-لوسيفيرين. تم الحصول على الصور لمدة 1 ساعة (وقت التعرض: 2 دقيقة ؛ binning: 4). أعلى: القياس الكمي للتدفق الكلي البطني (p / s) (المحور Y الأيسر ، باللون الأحمر) وكنسبة مئوية من أعلى متوسط قياس (المحور Y الأيمن ، باللون الأزرق). يتم عرض البيانات كمتوسط (منحنيات) وانحراف معياري (منطقة مظللة). أسفل: الصور التي تم الحصول عليها لأول نقطة زمنية (4 دقائق) وأعلى إشارة BLI (30 دقيقة) وآخر (62 دقيقة). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. تحقق من الشريط الأخضر في نافذة الاستحواذ للتحقق مما إذا كانت كاميرا الجهاز المقترن بالشحن (CCD) باردة (-90 درجة مئوية). انقر على الشريط (أخضر أو أحمر) لتصور درجة الحرارة.
    ملاحظة: وفقا لدليل معدات التصوير ، يجب تشغيل معدات وبرامج التصوير طوال الوقت للحفاظ على برودة CCD.
  2. تحقق مما إذا كان قد تم إجراء الضبط التلقائي للخلفية. للقيام بذلك ، انقر فوق الاستحواذ > الخلفية > عرض الشحن الداكن المتاح. ستظهر قائمة بها عدة مجموعات إعدادات.
    ملاحظة: يقلل هذا الإجراء من ضوضاء التلألؤ. إذا نتج عن التكوين المختار قيمة أعلى من 1000 ، بناء على الصيغة "وقت التعرض x (binning²)" ، فلا ينبغي تجاهل الشحن الداكن. اعتمادا على تكوينات البرامج ، يمكن عرض binning كرقم (عامل binning) أو نطاق من "صغير" إلى "كبير". يمكن العثور على المراسلات بين النطاق وعامل التجميع في دليل الجهاز.
  3. إذا لم تظهر نافذة النشاط (المنطقة البيضاء أسفل البرنامج) ، فقم بتمكينها في عرض القائمة > نافذة النشاط.
  4. اضبط منطقة التصوير بالنقر فوق نافذة الاستحواذ > مجال الرؤية. يكتسب الخيار (ج ) (١٣٫٢ سم) ٣ فئران، ويكتسب الخيار (د ) (٢٢ سم) ٥ فئران.
  5. حدد خيار الحفظ التلقائي بالنقر فوق اكتساب > حفظ تلقائي وتحديد أو إنشاء مجلد جديد لكل نقطة زمنية.
  6. ضع ورقة سوداء غير لامعة على منطقة التصوير وضع شرائح التقسيم بشكل عمودي بين المداخل. إذا لم توفر الشركة المصنعة الشرائح ، فاستخدم قطعا (3 سم × 15 سم) من الورق الأسود غير اللامع.
  7. اضبط المنطقة الداخلية لغرفة التصوير لاستيعاب مخاريط الأنف الزجاجية في مداخل التخدير. استخدم قطعا صغيرة من الشريط الكهربائي الأسود لتوصيل نظام التخدير بالمنصة (خارج منطقة الصورة).
    ملاحظة: في بعض إصدارات أجهزة التصوير، يحدد الليزر منطقة التصوير. إذا كانت هذه الأداة غير متوفرة ، فاحصل على الصور من خلال البرنامج للتحقق من شرائح التقسيم داخل منطقة التصوير.
  8. اضبط مبخر الأيزوفلوران على 2.5٪ (v / v) في الأكسجين لغرف التصوير والحث. تحقق من مقياس الضغط إذا كان الغاز يتدفق عبر النظام21.
    ملاحظة: إذا لم يكن جهاز التصوير يحتوي على نظام تخدير استنشاقي متصل به ، فإن خيارات التخدير الأخرى ممكنة ، مثل الزيلازين القابل للحقن والكيتامين23. في هذه الحالة ، يكون تعافي الفئران بطيئا ، وخطر الوفاة مرتفع24.
  9. املأ المحاقن (31 جم إبر) ب D-luciferin (يتم توفير بروتوكول شامل لإعداد D-luciferin من قبل موردين مختلفين)25,26 ، وحمايتها من الضوء المباشر ، وإعداد عدد قليل من الحاويات البلاستيكية أو الأقفاص الإضافية من خلال تغطية الداخل بمنشفة ورقية.
  10. احتفظ بساعة / ساعة في مكان قريب لتتبع الوقت بسهولة ودفتر ملاحظات معمل لتسجيل مجموعات الفئران ووقت حقن لوسيفيرين وأي معلومات أخرى أثناء الإجراء.
  11. وزن جميع الفئران وتسجيل وزنهم. ضع علامة على كل ماوس بعلامة قلم أو وشم على الذيل. حافظ على عرض التعرف على الفئران جيدا أثناء التجربة بأكملها. يمكن أيضا تنفيذ هذه الخطوة في اليوم السابق للاستحواذ.
    ملاحظة: يجب ألا تشغل العلامة مساحة كبيرة من الجسم لأن الحبر قد يتداخل مع إشارة التوهج الحيوي. يمكن أن تساعد العلامات الدائمة ذات الألوان المختلفة أيضا في التمييز بين المجموعات.
  12. لبدء جلسة التصوير ، قم بتسجيل صورة مضيئة في الخلفية (الإعدادات: وقت التعرض: 5 دقائق ؛ Binning: "كبير" أو "16" ، f / stop: 1) لغرفة التصوير بدون فئران. يساعد هذا الإجراء في تحديد مصادر ضوء الإنارة التلقائية أو المشكلات غير المرغوب فيها على الجهاز.
    ملاحظة: نظرا لأن BLI يعتمد على التفاعل الأنزيمي ، فإن الوقت هو سمة أساسية للتجربة. تحقق من جميع العناصر المذكورة أعلاه وإعدادات المعدات قبل البدء في التعامل مع.
  13. حقن 150 ملغم/كغ (i.p.) من د-لوسيفيرين في أول 3 فئران دون الوصول إلى الأعضاء الداخلية. ضع الفئران في صندوق الحاوية لتقييم ما إذا كان D-luciferin يتسرب (محلول أصفر ساطع). قم بتدوين الملاحظات إذا حدث هذا وسجل مجموعة الفئران ووقت حقن D-luciferin.
  14. انتظر 5 دقائق ثم انقل الفئران إلى غرفة تحريض التخدير. قم بتشغيل النظام. يستغرق الأمر حوالي 3 دقائق حتى يتم تخدير الفئران بالكامل (عدم وجود استجابات مثل اهتزاز الساقين والذيل وما إلى ذلك) 21.
  15. افتح باب جهاز التصوير ، وقم بتشغيل تدفق التخدير إلى غرفة التصوير ، وفي نفس الوقت ، قم بإيقاف تشغيل غرفة الحث.
  16. ضع كل ماوس في وضع مخاريط الأنف: من الماوس 1-3 ، من اليسار إلى الجانب الأيمن. قم باستيعاب الفئران برفق مع الجانب البطني لأعلى داخل منطقة التصوير الموضحة بالليزر. أثناء الإقامة ، تحقق من هوية الفئران وموقعها. لا تجبر دخول الفئران مخدر جزئيا في مخاريط الأنف.
  17. ضع شرائح التقسيم بين الفئران وأغلق باب جهاز التصوير.
  18. اضبط إعدادات الاكتساب في نافذة اقتناء البرنامج، كما يلي:
    1. بالنسبة للفئران غير المصابة ، وقت التعرض = 5 دقائق / Binning = "كبير" أو "16"
      (مجموعة التكوينات الأكثر حساسية رياضيا لتعيين قيم العتبة).
    2. بالنسبة للفئران المصابة في النموذج الحاد: وقت التعرض = 2 دقيقة / Binning = "متوسط" أو "4".
    3. بالنسبة للفئران المصابة في النموذج المزمن: وقت التعرض = 5 دقائق / Binning = "كبير" أو "16".
  19. تحقق مما إذا كان وقت حقن D-luciferin قد تم إجراؤه قبل 10 دقائق على الأقل من بدء الاستحواذ. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فانتظر الفترة اللازمة للحصول على الصور أثناء ذروة إشارة luciferase (الشكل 1B) ؛ خلاف ذلك ، انقر فوق اكتساب لبدء الحصول على التصوير.
  20. ستظهر نافذة تسميات الصور بعد بدء التصوير. املأ المربعات بالمعلومات المناسبة حول كل مجموعة ، بما في ذلك وقت حقن لوسيفرين ، والتجربة ، وتحديد الفئران ، والنقطة الزمنية ، وأي معلومات أخرى مطلوبة يمكن أن تساعد في الاحتفاظ بالسجل. سيتم تضمين هذه المعلومات في ملف جدول القياسات.
  21. تحقق مما إذا كانت علامة التحذير صورة مشبعة تظهر في نهاية الحصول على التصوير. الصور المشبعة غير مقبولة. إذا حدث هذا ، فقم بتقليل binning والحصول على صورة جديدة. تدوين الملاحظات للنظر فيها في التحليل.
  22. بمجرد الحصول على الصورة ، افتح باب آلة التصوير وأدر الفئران إلى المنظر الظهري (الجانب الخلفي لأعلى). قم بإجراء عملية الاستحواذ مرة أخرى وقم بتسميتها بشكل مناسب.
  23. في نهاية عملية الاستحواذ على التصوير هذه ، قم بإيقاف تشغيل تدفق التخدير. قم بإزالة الفئران برفق من غرفة التصوير وضعها في وعاء.
  24. سجل وزن جسم الفئران أثناء مراقبة تعافي التخدير. سجل أي سلوك غير طبيعي أو تشوهات في الجسم تم العثور عليها أثناء الإجراء. بمجرد عودة الفئران إلى الحركة ، ضعها في أقفاصها.
    ملاحظة: تحقق من كثافة BLI لكل صورة تم الحصول عليها. بعد انتهاء الاستحواذ ، سيتم عرض صورة الإضاءة الحيوية المسجلة والصورة على البرنامج بمقياس تلقائي لا ينبغي مراعاته. قم بتعيين المقياس المحدد في تحليل البيانات (الموضح أدناه) في نافذة لوحة الأدوات .

6. تحليل البيانات

ملاحظة: يعتمد البروتوكول أعلاه على برامج التصوير التجارية في الجسم الحي . ومع ذلك ، يمكن للإصدار الخالي من ترخيص البرنامج إجراء التحليل الأساسي. يمكن العثور على تفاصيل البرنامج في جدول المواد.

  1. افتح الملفات.
    1. افتح المجلد الذي يحتوي على البيانات التي تم الحصول عليها من نقطة زمنية معينة للتصوير عن طريق تحديد ملف القائمة > المتصفح > حدد المجلد (الشكل 2 أ - الخطوة 1).
      ملاحظة: سيتم فتح نافذة جديدة بتنسيق جدول مع حفظ جميع البيانات المكتسبة في الملف المختار. سيعرض علامة رقم النقر ، وهي معرف الصورة الذي يقدمه البرنامج تلقائيا (البيانات وأرقام الساعات) ، والمعلومات التي يقدمها الباحث في نافذة تسميات الصور أثناء الاستحواذ ، وإعدادات الاستحواذ. تساعد كل هذه البيانات في فرز الصور التي يمكن استخدامها في التحليل ، بالنظر إلى أنه يجب عدم استخدام الصور المشبعة.
    2. حدد صفوفا متعددة متعلقة بالصور المختارة، بما في ذلك عناصر التحكم غير المصابة. اكتب معرف الصورة في دفتر ملاحظات المختبر مع المعلومات المسجلة أثناء جلسة التصوير.
    3. قم بتجميع الصور المحددة بالنقر فوق تحميل كمجموعة. يقوم هذا الإجراء بإنشاء صورة تسلسل جديدة. لذلك ، من الممكن ضبط الميزات لجميع الصور في وقت واحد. احفظ صورة التسلسل الجديدة في مجلد جديد مختلف عن المجلد المستخدم في الخطوة 6.1 لتسهيل إعادة تحليل البيانات الأولية إذا لزم الأمر.
    4. في صورة التسلسل ، حدد التجميع المستخدم لكل صورة بالنقر فوق خيارات > العرض > تحديد عامل التجميع (الشكل 2 أ - الخطوة 2). سيتم عرض عامل binning المكتسب في الجزء العلوي من كل صورة في التسلسل.
    5. قم بتصحيح جميع عوامل binning إلى نفس الرقم. للقيام بذلك ، انقر نقرا مزدوجا فوق الصورة المراد ضبطها. في نافذة لوحة الأدوات > قسم ضبط الصورة ، اختر عامل التجميع المناسب (الشكل 2 أ - الخطوة 3) - راجع الخطوة 5.18 لاختيار عامل التجميع. نفذ هذا الإجراء في جميع الصور المتباينة.
      ملاحظة: يؤثر هذا الإجراء بشكل مباشر على القياس الكمي ل BLI (الجدول 1) ويتم تناوله بشكل أكبر في قسم المناقشة.
  2. تعيين مقياس.
    1. تمييز إشارة التوهج الحيوي الصالحة (أعلى من 600 عدد وفقا لدليل الجهاز) بناء على عنصر التحكم غير المصاب. لذلك ، انقر نقرا مزدوجا فوق صورة الفئران غير المصابة. ثم ، في الزاوية العلوية اليسرى من النافذة الجديدة ، حدد الخيار التهم في حقل الوحدات . ثم اضبط مقياس اللون للحد الأدنى للقيمة 600. ستكون الصورة الناتجة هي خط الأساس لتعيين الحد الأدنى لمقياس الإشراق.
    2. أثناء تنشيط نافذة التسلسل ، حدد الخيار Radiance في حقل الوحدات . اضبط مقياس اللون وجدول الألوان في لوحة الأدوات. لذلك ، قم بتعطيل المربع فردي في منطقة حدود مقياس اللون .
    3. ضع علامة على المربعات مقياس لوغاريتمي ودليل (الشكل 2 أ - الخطوة 4). قم بتعيين الحد الأدنى لأرقام المقياس وفقا لعنصر التحكم غير المصاب (كما لوحظ في الخطوة 6.8) والمنطقة ذات الإشارة الأعلى كحد أقصى (كما هو موضح في الشكل 2A بواسطة الأسهم).
      ملاحظة: في الجسم الحي 2D mesurament الضوء هو تقدير كمي نسبي. يمكن العثور على قيم مقياس مختلفة بسبب الاختلافات في إصدار كل جهاز والمعايرة. لذلك ، فإن القيم الموضحة في النتائج التمثيلية لا يمكن أن تتناسب مع التجارب الأخرى التي أجريت على أجهزة أخرى ومع ذلك تكون صالحة بنفس القدر وفقا للضوابط الداخلية (غير المصابة وغير المصابة).
    4. بعد تعيين نفس المقياس لجميع الصور ، انقر نقرا مزدوجا فوق كل صورة ، وقم بتكبير النافذة ، وقم بتصدير عرض الصورة بتنسيق صورة (.jpg ، .tiff ، إلخ) باستخدام زر تصدير الرسومات ، وتسمية الملفات حسب نقطة treatment_miceID_time. (الشكل 2 أ - الخطوة 5). قم بتنفيذ هذا الإجراء لجميع الصور.
  3. إجراء القياسات.
    1. اختر أي صورة من التسلسل وانقر نقرا مزدوجا فوقها. في نافذة لوحة الأدوات > قسم أدوات عائد الاستثمار ، انقر فوق مربع زر (الشكل 2 ب - الخطوة 1) وارسم مستطيلا يغطي الماوس بالكامل.
    2. انقر فوق حدود عائد الاستثمار الذي تم إنشاؤه وانسخ والصق نفس عائد الاستثمار لكل ماوس (مما ينتج عنه ثلاثة عائد استثمار في الصورة). احفظ عائد الاستثمار بالنقر فوق حفظ في قسم أدوات عائد الاستثمار. قم بتطبيق عائد الاستثمار المحفوظ لجميع الصور عن طريق تحديد المربع تطبيق على التسلسل ، ثم انقر فوق تحميل. سيتم استخدام عائد الاستثمار المحفوظ لجميع الفئران في التجربة بأكملها.
    3. اضبط موضع عائد الاستثمار في كل ماوس ليناسب بشكل أفضل في منطقة القياس. عندما يتم تصنيف جميع الفئران ، انقر فوق الزر "قياس عائد الاستثمار" (الشكل 2 ب - الخطوة 2). سيظهر جدول قياسات عائد الاستثمار . حدد أنواع القياس: الإشراق. سمات الصورة: جميع القيم الممكنة ؛ أبعاد عائد الاستثمار: سم. ثم ، انقر فوق الزر "تحديد الكل " ، متبوعا بالزر نسخ .
    4. الصق البيانات مباشرة في برنامج تحليل الجدول (جدول البيانات). بدلا من ذلك ، قم بتصدير ملف بتنسيق .csv أو .txt.
  4. العمل على البيانات.
    1. في برنامج تحليل الجدول ، قم بتنظيم البيانات حسب المجموعات (العلاج ، السيطرة غير المصابة ، غير المعالجة ، إلخ).
    2. يظهر حمل الطفيليات على أنه تلألؤ حيوي لكامل الجسم. لذلك ، رتب البيانات لمطابقة قيم التدفق الكلي البطني والظهري لنفس الفئران وجمعها.
    3. احسب المتوسط والانحراف المعياري للقيم المجمعة مع مراعاة كل مجموعة (على سبيل المثال: الجدول التكميلي 1). ارسم البيانات في برنامج الرسوم البيانية والإحصاءات.
    4. قم بإعداد لوحة تحتوي على صور مضيئة بيولوجيا في صورة أو برنامج عرض شرائح. ضع كل ماوس في عمود وفي كل نقطة زمنية في الصف لبناء مصفوفة فعالية الدواء لتسهيل تصور البيانات وتفسيرها.
      ملاحظة: يوجد خيار لإنشاء الصور مباشرة في برنامج التصوير دون تنفيذ الخطوة 6.2.4 (عرض > نافذة تخطيط الصورة). ومع ذلك ، فإن واجهة البرنامج والأدوات تحد من تنظيم البيانات.

figure-protocol-23744
الشكل 2: خطوات تحليل البيانات من ضبط مقاييس الصورة إلى قياس التلألؤ. (أ) عرض برنامج الصور الحية لمعالجة بيانات الصور. الخطوة 1: قم بتحميل البيانات التي تم الحصول عليها كتسلسل باستخدام أداة المتصفح. الخطوة 2: حدد التجميع المستخدم لكل عملية اكتساب (سيظهر أعلى الصور الفردية). الخطوة 3: اضبط جميع صور الفئران المصابة على نفس عامل التجميع وقم بتطبيق عامل التجميع 16 على الفئران غير المصابة. الخطوة 4: اضبط مقياس الألوان يدويا بناء على الفئران غير المصابة (السهم الأرجواني) ، والتي يجب رؤيتها على الشاشة على أنها غير مضيئة بيولوجيا ، والفئران المصابة وغير المعالجة في أعلى بؤر التوهج الحيوي (السهم الأحمر) ، والتي يجب أن ينظر إليها على أنها حمراء. الخطوة 5: للحصول على صورة خالية من أي معلومات مكتوبة ، انقر نقرا مزدوجا فوق كل صورة وقم بتصدير الصورة باستخدام ملف تصدير الرسومات زر. (ب) عرض أدوات مناطق الاهتمام (ROI). الخطوة 1: ارسم عائد استثمار يغطي الماوس بالكامل وانسخ والصق نفس عائد الاستثمار لكل. احفظ عائد الاستثمار المعدل وقم بتطبيقه على جميع الصور في التجربة. باسو 2: انقر فوق الزر "قياس عائد الاستثمار" لإنشاء الجدول المراد تصديره بتنسيق .csv أو .txt. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

7. إجراء خارج الجسم الحي

  1. حقن 150 ملغ/كغ د-لوسيفيرين i.p. في الماوس (واحد لكل جولة خارج الجسم الحي ) وانتظر لمدة 3 دقائق. تخدير الفئران باستخدام 100 ملغم/كغ من الكيتامين و10 ملغم/كغ من الزيلازين i.p.
  2. في خزانة السلامة البيولوجية ، عندما لا يستجيب الماوس تماما لقرص الكفوف ، قم بقطع جلد الماوس لفضح الصفاق (دون فتح تجويف الصفاق) وأنسجة الجانب الأيسر الإبطي. المضي قدما في الاستنزاف عن طريق قطع الشريان الإبطي والوعاء.
  3. اجمع الدم باستخدام ماصة باستور يمكن التخلص منها. ثم قم بتوزيع 10 مل من 0.3 مجم / مل من D-luciferin في محلول DPBS من خلال البطين الأيسر للقلب.
  4. ضع الأعضاء المختارة على أماكن محددة مسبقا على طبق بتري وانقعها في محلول د-لوسيفيرين 0.3 مجم / مل. يجب تنفيذ هذا الإجراء في غضون 30 دقيقة كحد أقصى.
  5. الحصول على الصورة المضيئة للأعضاء المستأصلة (القلب والرئتين والغدة الصعترية والكبد وعضلة الفخذ والمساريق والطحال والكلى والغدة الكظرية والدهون الحشوية والمريء والمعدة والأمعاء الدقيقة والأعور والقولون والدماغ والدهون تحت الجلد والرحم ودهون الغدد التناسلية والمثانة وغشاء الصفاق) باستخدام 5 دقائق من وقت التعرض و binning 16 ، اعتمادا على شدة الإشارة (الصور المشبعة غير مقبولة)22.
    ملاحظة: يجب تنفيذ نفس الإجراء في ماوس غير مصاب قبل الماوس المصاب لتعيين العتبة.

النتائج

باستخدام نموذج فأر مناسب يعتمد على الطفيليات المحورة وراثيا التي تعبر بشكل أساسي عن luciferase ، من الممكن إعادة إنتاج ميزات عدوى T. cruzi البشرية الرئيسية التي تسبب الحد الأدنى من الضرر للمضيف ، مما يسمح بتتبع الطفيليات في الوقت الفعلي بواسطة BLI كامل الجسم للمضيف بطريقة طولية (مدى الحياة) ، لمدة تصل إلى عدة أشهر12.

يوضح الشكل 3 تجربة تجريبية توضح الدورة الزمنية لعدوى CL Brener Luc::Neon من اليوم 1 بعد الإصابة حتى 150 نقطة في البوصة في الفئران BALB / c. في أول 20 نقطة في البوصة ، يزداد عبء الطفيليات المستنبطة من التلألؤ الحيوي ، وهو نموذجي لذروة الطفيليات ، يليه انخفاض حاد في حمل الطفيليات ، بسبب التحكم المناعي للفئران. وبالتالي ، تعتبر المرحلة الحادة من العدوى أول 50 نقطة في البوصة. يتم تعريف المرحلة المزمنة عندما تصل العدوى إلى معدل تلألؤ حيوي ثابت ، من 100-150 نقطة في البوصة.

figure-results-978
الشكل 3: فهم النموذج. حركية المثقبية الكروزية CL Brener Luc::عدوى النيون في الفئران BALB / c (ن = 11). اللوحة العلوية: صور مضيئة بيولوجية بطنية وظهرية من نقاط زمنية مختلفة لمدة 150 يوما بعد الإصابة (نقطة في البوصة) مع 1 × 10³ تريبوماستيغوت مجرى الدم عن طريق الحقن داخل الصفاق. مقياس خريطة الحرارة (في السجل10) لإشارة التوهج الحيوي في الإشعاع (p / s / cm2 / sr). رمز اللون: أرجواني = 5 × 103 ؛ أحمر = 1 × 107. اللوحة السفلية: القياس الكمي لإشارة التوهج الحيوي في التدفق الكلي (p / s) للفئران التي تغطي الجسم بالكامل. يتم التعبير عن البيانات كوسائل (خطوط) وانحرافات معيارية (مناطق مظللة). يتم تمييز الفترات المحددة للمراحل الحادة والمزمنة من العدوى في نموذج الماوس هذا باللون البرتقالي. تظهر قيم متوسط التلألؤ للفئران غير المصابة (n = 3) كعتبة (خط رمادي فاتح). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

يمكن أيضا التنبؤ بالنتائج العلاجية لأن المراحل الرئيسية للعدوى يتم استنساخها جيدا في نموذج الفأر. وبالتالي ، يتم تطبيق BLI الآن على العلوم الانتقالية من خلال دراسات إثبات المفهوم التي تدعم اتخاذ القرار بشأن إمكانات فعالية المركب والتقدم في خط أنابيب التطوير10,27. في نموذج الفأر الحاد ، يجب أن يبدأ العلاج عن طريق الفم عندما تصل العدوى إلى ذروة الطفيليات (حوالي 14-21 نقطة في البوصة) ، والتي تتميز بعدد كبير من المثقبيات في مجرى الدم (حوالي 1 × 105 تريبوماستيغوتيس / مل - البيانات غير معروضة) والعدوى الجهازية. في المرحلة المزمنة ، يبدأ علاج الفئران عند 100 نقطة في البوصة ، عندما يكون حمل الطفيلي أقل بكثير نسبيا ، مع تطفل الدم الفرعي المستقر.

لإثبات تطبيق البروتوكول الموصوف أعلاه في تقييم العوامل المضادة للطفيليات ، قمنا بمقارنة فعالية علاج البنزنيدازول (BZ) ، وهو الدواء القياسي المستخدم لعلاج مرض شاغاس ، وبوساكونازول (Posa) ، وهو مثبط ستيرول 14α-demethylase (CYP51) فشل في التجارب السريرية لمرض شاغاس ، وقد ثبت أيضا أنه غير فعال كعامل مضاد للطفيليات ضد T. cruzi في المختبر وفي الجسم الحي، بما في ذلك في نموذج BLI الموصوف في هذا البروتوكول13،18،28،29،30.

بالنسبة لنموذج الفئران الحادة ، عولجت مجموعات من 6 فئران لكل مجموعة عن طريق الفم عن طريق التزجيج31 لمدة 20 يوما مع Posa عند 20 مجم / كجم أو BZ عند 100 مجم / كجم ، مرة واحدة يوميا. كما عولجت الفئران ب BZ لمدة 5 أيام بمعدل 100 مجم / كجم مرة واحدة يوميا لتقييم تأثير العلاجات القصيرة. بعد التخلص من المركب (بعد 10 أيام من انتهاء العلاج) ، تم تثبيط مناعة الفئران السلبية BLI ، وهي حالة تعزز انتكاس العدوى عندما لا يتم تحقيق علاج طفيلي (الشكل 4 أ). أدى علاج Posa إلى انخفاض بنسبة 99.49٪ ± 0.27٪ (متوسط ± الانحراف المعياري) في عبء الطفيليات المستنبطة من التلألؤ الحيوي في نهاية العلاج وظل عند مستويات مماثلة من الفئران غير المصابة خلال فترة التخلص من مركب الدواء (باستثناء الماوس # 3 ، مع إشارة عابرة عند 40 نقطة في البوصة ، والماوس # 2 ، الذي أظهر بقعة BLI ضعيفة عند 44 نقطة في البوصة). بالمقارنة مع المجموعة غير المعالجة ، قلل علاج BZ لمدة 20 يوما بنسبة 100٪ ± 0.01٪ من عبء الطفيليات المستنبطة من التلألؤ الحيوي في نهاية العلاج. في المقابل ، أدى العلاج القصير مع BZ لمدة 5 أيام إلى انخفاض بنسبة 99.98٪ ± 0.03٪ عند 19 نقطة في البوصة (على غرار مستوى العتبة). ومع ذلك ، في هذه الحالة ، كان تخفيض BLI عابرا وفي عمليات الاستحواذ اللاحقة ، قدمت جميع الفئران إعادة تنشيط العدوى (الشكل 4B).

figure-results-4793
الشكل 4: تصميم تجربة إثبات المفهوم والنتائج التي تم الحصول عليها من خلال تصوير التلألؤ الحيوي في النموذج الحاد لمرض شاغاس. (أ) مخطط تخطيطي لعملية الجدول الزمني في نموذج فأر مرض شاغاس الحاد للدراسات قبل السريرية لتقييم فعالية المركب. النقاط السوداء: نقاط وقت التصوير. قارورة الدواء وشريط البرتقال: بداية العلاج ونهايته ، على التوالي. رمز حقنة: حقن سيكلوفوسفاميد. DPI: يوم ما بعد الإصابة. رمز اللون: رمادي = عدوى غير معالجة ؛ البرتقالي = فترة العلاج ؛ الأزرق = مرحلة القضاء على المركب ؛ الأصفر = فترة كبت المناعة. (ب) المسار الزمني لعلاج المثقبية الكروزي. اللوحة اليسرى: صور التلألؤ الحيوي البطني لفئران BALB / c (i) غير المعالجة أو المعالجة لمدة 20 يوما مع (ii) بوساكونازول (Posa) عند 20 مجم / كجم ، (iii) بنزنيدازول (BZ) عند 100 مجم / كجم معالج لمدة 20 يوما و (iv) BZ عند 100 مجم / كجم معالج لمدة 5 أيام باستخدام (n = 6 / مجموعة). تم إعطاء جميع العلاجات عن طريق الفم عن طريق التزويج (10 مل / كجم) مرة واحدة في اليوم. تشير خريطة الحرارة بمقياسLog 10 إلى شدة إشارة التوهج الحيوي من المستوى المنخفض (الأزرق) إلى العالي (الأحمر). الرسم البياني الأيمن: القياس الكمي لكامل الجسم لبيانات تصوير التلألؤ الحيوي. يتم التعبير عن البيانات كوسائل (خطوط) وانحرافات معيارية (مناطق مظللة). مفتاح: قارورة الطب: بدء العلاج (14 نقطة في البوصة) ؛ الشريط البرتقالي: نهاية المعالجة (18 نقطة في البوصة / 33 نقطة في البوصة) ؛ حقنة أيقونة حقن سيكلوفوسفاميد (من يوم 44-53) ؛ النقطة البرتقالية: تم تحليل الماوس بواسطة إجراء خارج الجسم الحي ؛ § البيانات المستبعدة بسبب تسرب D-luciferin في البول. (ج) إجراء خارج الجسم الحي للكشف عن بؤر T. cruzi في الأعضاء والأنسجة. يتم تقديم مفتاح توزيع اللوحة في أسفل الشكل (تم إنشاؤه باستخدام BioRender.com: ZY26LG8AOF). نفس مقياس السطوع كما هو موضح في لوحة الجسم الحي . يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

في هذا النموذج ، قد يقلل العلاج المضاد للطفيليات من حمل الطفيليات إلى ما دون حد اكتشاف BLI البالغ 1000 طفيلي. وهكذا ، تظهر الفئران على أنها BLI سالب10. لضمان تحقيق علاج طفيلي ، من الضروري تعزيز كبت المناعة للفئران باستخدام علاج سيكلوفوسفاميد29,32. الفئران التي لا يزال لديها حمولة طفيلية لا يمكن اكتشافها بعد العلاج بالعقاقير ستصبح إيجابية BLI بعد كبت المناعة. يظهر هذا التأثير على نطاق أوسع من خلال علاج Posa في النموذج الحاد ، والذي يعزز انتكاس الطفيليات. في هذه التجربة ، تم إجراء ex vivo على الفئران ذات أدنى إشارة توهج حيوي لتقييم انتحاء أنسجة الطفيليات (الشكل 4C). تظهر الفئران غير المعالجة إشارات توهج حيوي قوية ، خاصة في الجهاز الهضمي (TGI) والأنسجة المرتبطة بها مثل الدهون الحشوية والمساريق. بالإضافة إلى ذلك ، كان الجلد موقعا مرتبطا باستمرار الطفيليات. قدمت الفئران التي عولجت ب Posa بقعا مضيئة بيولوجيا منخفضة الكثافة كانت أكثر تقييدا على القولون والمساريق والدهون الحشوية. من ناحية أخرى ، في الفئران المعالجة بنظام علاج علاجي ، مثل BZ 100 mg / kg لمدة 20 يوما ، لا يتم الكشف عن أي إشارة تلألؤ حيوي حتى في ظل كبت المناعة. لذلك ، بالنظر إلى أنه بعد تعزيز ظروف إشارة التوهج الحيوي التي ترتفع فوق مستوى عتبة 1000 طفيلي10 ، وزيادة الحساسية عن طريق تعريض الأعضاء الحشوية ، يعتبر أن BZ 100 mg / kg لمدة 20 يوما يوفر علاجا معقما. تم التحقق من صحة تقييم العلاج المعقم سابقا من خلال تقنيات مختلفة10،13،17،33،34.

تم تطبيق تصميم دراسة مماثل على النموذج المزمن (الشكل 5 أ) ، حيث بدأ علاج الفئران (ن = 6 / مجموعة) في اليوم 100 بعد الإصابة. في هذه المرحلة ، تم إعطاء Posa 20 mg / kg ، BZ بمعدل 100 mg / kg ، أو 10 mg / kg مرة واحدة يوميا عن طريق الفم لمدة 20 يوما. بعد فترة التخلص من المخدرات ، تم تثبيط مناعة الفئران السلبية BLI. بالإضافة إلى ذلك ، لتقييم العلاج المعقم ، خضعت الفئران التي كانت لا تزال سلبية BLI في نهاية مرحلة كبت المناعة لتحليل خارج الجسم الحي .

في العدوى المزمنة ، أدى العلاج ب Posa عند 20 مغ / كغ إلى انخفاض بنسبة 95.03٪ ± 6.18٪ في عبء الطفيليات المستنبطة من التلألؤ البيولوجي في نهاية العلاج وظل عند مستويات مماثلة من الفئران غير المصابة خلال فترة التخلص من الدواء. بعد كبت المناعة ، أظهرت غالبية الفئران مستوى متغيرا من إشارة BLI وتوزيعها (الشكل 5B). كشف الإجراء خارج الجسم الحي أن فئرانا سلبية BLI لكامل الجسم عولجت ب Posa كان لديها بقعة مضيئة بيولوجيا في القولون يمكن اكتشافها عن طريق الفحص خارج الجسم الحي (الشكل 5C).

figure-results-9676
الشكل 5: تصميم تجربة تقييم الأدوية والنتائج المحققة في النموذج المزمن لعدوى المثقبية الكروزية عن طريق التصوير الحيوي. (أ) مخطط تخطيطي لتصميم تجربة نموذج فأر مرض شاغاس المزمن. النقاط السوداء: نقاط وقت التصوير. قارورة الدواء وشريط البرتقال: بداية العلاج ونهايته ، على التوالي. رمز حقنة: حقن سيكلوفوسفاميد. نقطة في البوصة: يوم ما بعد الإصابة. رمز اللون: رمادي = عدوى غير معالجة. البرتقالي = فترة العلاج ؛ الأزرق = مرحلة القضاء على المركب ؛ الأصفر = كبت المناعة. أرجواني = الانتكاس. (ب) التقييم الطولي لفعالية العلاج في نموذج مرض شاغاس المزمن. اللوحة اليسرى: BLI البطني للفئران BALB / c (i) غير المعالجة أو المعالجة لمدة 20 يوما مع (ii) بوساكونازول (Posa) عند 20 مجم / كجم ؛ '3' البنزنيدازول عند 100 مغ/كغ، و'4' بى زيد عند 10 مغ/كغ (ن = 6/مجموعة). تم إعطاء جميع العلاجات عن طريق الفم عن طريق التزويج مرة واحدة في اليوم. الرسم البياني الأيمن: مجموع البيانات الأولية للتدفق الكلي البطني والظهري. مفتاح: قارورة الطب: بدء العلاج (102 نقطة في البوصة) ؛ الشريط البرتقالي: نهاية العلاج (121 نقطة في البوصة) ؛ شريط أصفر ورمز حقنة: حقن سيكلوفوسفاميد (من اليوم 131-142). النقطة البرتقالية: تم تحليل الماوس بواسطة إجراء خارج الجسم الحي . ! توفي الفأر أثناء التخدير. figure-results-11013 يعرض الماوس تشوهات في البطن. يشير مقياس خريطة الحرارة (Log10) إلى شدة التلألؤ الحيوي في وحدة الإشعاع من المستوى المنخفض (3 × 105 باللون الأزرق) إلى المستوى العالي (1 × 107 باللون الأحمر). ج: التحليل خارج الجسم الحي لانتحاء المطثية الكروزية في الأنسجة. كشف التلألؤ الحيوي للأعضاء المستأصلة من الفئران المثبطة للمناعة في الجسم الحي BLI السلبية بعد العلاج ب Posa و BZ عند 100 مغ / كغ أو الفئران ذات أدنى إشارة في المجموعات غير المعالجة و BZ عند 10 ملغم / كغم. يظهر مفتاح توزيع اللوحة في أسفل الشكل (تم إنشاؤه باستخدام BioRender.com: ZY26LG8AOF). مقياس الإشراق يساوي في لوحة الجسم الحي . يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

أدت المعالجة باستخدام BZ عند 100 مجم / كجم إلى تقليل التلألؤ الحيوي إلى مستويات العتبة (93.87٪ ± 2.14٪) عند 122 نقطة في البوصة وما بعدها حتى نهاية التجربة. بالنظر إلى التحليل خارج الجسم الحي ، حققت BZ معدل شفاء بنسبة 100٪ (6/6 فئران) ، حيث لم تقدم أي فئران عودة لإشارة التوهج الحيوي حتى عندما تم فحص الأعضاء الداخلية والمثبطة للمناعة. وهذا يعني عدم وجود انتكاسة. ومع ذلك ، أدى نظام علاج BZ بتركيز أقل إلى انخفاض طفيف في التلألؤ الحيوي (85.95٪ ± 18.43٪) ولكن لا يوجد علاج ، حيث استمرت الفئران في إظهار بؤر إشارة مضيئة حيوية يمكن اكتشافها في جميع النقاط الزمنية اللاحقة. وبالتالي ، يسمح هذا النموذج بالتمايز الكمي بين العلاجات غير الفعالة (بوساكونازول والعلاج دون المستوى الأمثل مع البنزنيدازول) والعلاجات الفعالة (الجرعات المثلى وطول العلاج مع البنزنيدازول).

الشكل التكميلي 1: تحليل ما قبل العدوى لتعبير مجموعة T. cruzi عن لوسيفيراز عن طريق قياس الجين المراسل mNeonGreen fluorescence. قياس التدفق الخلوي لبروتين الفلورسنت mNeonGreen الذي تم التعبير عنه بشكل أساسي بواسطة CL Brener Luc::Neon parasite. الرسم البياني الطبيعي لرقم الطفيلي (المحور Y) بواسطة شدة مضان mNeonGreen (المحور X). توضح الأسطورة الداخلية السلالة والشكل اللذين تم تحليلهما ، ومتوسط التألق ، والنسبة المئوية لسكان التألق. يتم تعريف خطوط البوابة بواسطة سلالة CL Brener البرية (WT) على أنها تحكم غير فلوري. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الجدول التكميلي 1: مثال على جدول التحليل في قياس BLI. البيانات الخام التي تم الحصول عليها من القياس الكمي لتصوير التلألؤ الحيوي لليوم 19 بعد الإصابة في النموذج الحاد المستخدم في النتائج التمثيلية الموضحة في الشكل 4B. وصف المجموعات: السيطرة كفئران غير مصابة (ن = 3 / مجموعة) ؛ مركبة كفئران مصابة غير معالجة ؛ بوساكونازول (Posa) عند 20 مغ/كغ لمدة 20 يوما؛ البنزنيدازول (BZ) عند 100 مغ/كغ لمدة 20 يوما؛ BZ عند 100 ملغ/كغ معالجة لمدة 5 أيام (ن = 6/مجموعة). الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Discussion

تصوير التلألؤ البيولوجي هو طريقة متطورة تسمح باكتشاف جين تقرير باستخدام طيف مرئي والأشعة تحت الحمراء من الإشعاع الكهرومغناطيسي. لذلك ، ليست هناك حاجة لعلامات مشعة لتتبع عينتك35. BLI مناسب لنماذج القوارض والأنواع الصغيرة الأخرى. إنه مفيد جدا للدراسات قبل السريرية لأنه أكثر أمانا ويسمح بعدة جولات للصور ، مما يسبب الحد الأدنى من الانزعاج للحيوانات. إلى جانب ذلك ، يعد التصوير في الجسم الحي مرنا للغاية نظرا لإمكانية الجمع بين التلألؤ الحيوي والتألق وتقنيات أخرى مثل التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني36.

يخضع التصوير البصري لخصائص فيزيائية بصرية ، مثل الامتصاص والتشتت. تمتص جميع الأنسجة الضوء وتشتت الضوء ذي الأطوال الموجية المميزة بشكل مختلف37. تتمثل إحدى الخطوات الحاسمة في اختيار جين مراسل دون مراعاة الطول الموجي المنبعث للضوء الناتج عن التفاعل الكيميائي. في حين أن مستوى التعبير الجيني للمراسل قد يكون مرتفعا في المختبر في مقايسات التوهج الحيوي ، فقد لا تتحقق نفس مستويات التعبير عند التقدم إلى الإعداد في الجسم الحي. في هذا البروتوكول ، استخدمنا نسخة Photinus pyralis luciferase (PpyRE9H) 38 المحسنة للكودون للتريبانوسوماتيدس9 ، والتي تنبعث منها الضوء عند 617 نانومتر ، وهي واحدة من أكثر الدراسات ملاءمة للدراسات في الجسم الحي 39. الأطوال الموجية الأطول من 600 نانومتر أقل امتصاصا وتشتتا بواسطة الكروموفورات الداخلية للجسم ، وخاصة الهيموجلوبين والميلانين. وبالتالي ، يمكن أن تنتقل الأضواء الحمراء عبر عدة سنتيمترات من الأنسجة ، مما يسمح للفوتونات بالوصول إلى كاميرا CCD حتى من داخل الأنسجة الحشوية39,40.

أحد مجالات القلق في إعدادات التصوير هو عدم وجود فهم شامل لوظيفتها وتأثيراتها. تجمع تقنية Binning ، وهي تقنية معالجة مسبقة ، المعلومات التي تم الحصول عليها بواسطة أجهزة الكشف المتجاورة في بكسل أكبر. تعمل هذه العملية على تحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء وتقليل ضوضاء الخلفية وتحسين الحساسية. ومع ذلك ، فإنه يقلل من دقة الدقة المكانية ، مما ينتج عنه صورة منقطة41,42. هذه المقايضة هي اعتبار مهم في استراتيجية التصوير الخاصة بك.

استنادا إلى ملف تعريف المنتج المستهدف وملف تعريف المرشح المستهدف لمرض شاغاس34 ، تركز دراسة إثبات المفهوم على الحساسية للكشف عن T. cruzi والمساعدة في تحديد ما إذا كان الدواء المرشح الجديد يمكنه تحقيق علاج معقم (يتمثل في عدم الانتكاس بعد عدة جولات من كبت المناعة). لذلك ، نقوم بتنفيذ BLI باستخدام أعلى عامل تجميع دون تشبع الصورة. عندما تكون الصورة مشبعة، يتم إجراء اكتساب جديد باستخدام عامل تجميع أقل. أثناء التحليل ، يتم تطبيق تصحيح رياضي على الصور التي تتطلب تجميعا مختلفا. بهذه الطريقة ، يجب تقديم البيانات النهائية باستخدام نفس binning. يوضح الجدول 1 القيم المختلفة التي تم الحصول عليها عند تطبيق عوامل binning المميزة في نفس الصورة وعائد الاستثمار.

الجدول 1: تأثير إعدادات binning على القياس الكمي BLI. القياس الكمي لثلاثة عائد استثمار على صورة النموذج الحاد (d13) والنموذج المزمن (d118) ، تم تحليلها في عوامل تجميع مختلفة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

بسبب السيناريو الحالي لمرض شاغاس في العيادة ، تهدف جهود اكتشاف الأدوية إلى القضاء التام على الطفيليات (العلاج الطفيلي)27,34. لذلك ، يتضمن البروتوكول قبل السريري في الجسم الحي مناهج تتغلب على قيود الحساسية التقنية BLI. أحد الأساليب هو علاج الفئران بسيكلوفوسفاميد لتقليل الاستجابة المناعية التي تتحكم في حمل الطفيلي. هناك استراتيجية أخرى تتمثل في تقليل عمق الأنسجة وإزالة طبقات العضلات والجلد والفراء التي تعيق مسار الضوء إلى الكاميرا. من خلال إجراء خارج الجسم الحي ، يمكن اكتشاف بقع مضيئة بيولوجيا صغيرة ، تكشف عن بؤر طفيلية أقل من عتبة BLI في الجسم الحي ، كما هو موضح في الشكل 5C في نتيجة خارج الجسم الحي للفأر المعالج بواسطة Posa.

يعد تصميم تجربة تجريبية لتقييم النموذج نفسه وديناميكيات العدوى أمرا بالغ الأهمية لإنشاء تجربة دقيقة لتقييم فعالية الأدوية المضادة للطفيليات. وبالتالي ، سيكون الباحث قادرا على تحديد إعدادات BLI المناسبة ودورة وقت العدوى مسبقا. في تجربة استكشافية ، إحدى الأدوات التي يمكن أن تكون مفيدة لتحديد إعدادات الاكتساب هي "التعرض التلقائي". باستخدام هذه الأداة ، يحدد الباحث أولوية ثلاثة إعدادات (وقت التعرض ، Binning ، و F / Stop) للحصول على أفضل صورة ممكنة. على وجه الخصوص ، يجب على الباحث التأكد من الحصول على الصور ضمن النطاق الديناميكي لكاميرا CCD ، دون التشبع الفائق أو التعرض الناقص ، والذي يمكن التحقق منه من خلال الحدود الدنيا والقصوى للمقياس وميزة التعرض التلقائي ( تحرير القائمة > تفضيلات > اكتساب علامة التبويب > التعرض التلقائي لعلامة التبويب). في هذا البروتوكول ، تم ضبط فتحة الكاميرا على القيمة القصوى (F / Stop: 1) ، وتم تحديد أوقات التعرض المختلفة وعوامل التجميع للنماذج الحادة والمزمنة. توفر هذه الإعدادات إمكانية التنبؤ بالوقت لإجراء جولات صور مختلفة في وقت واحد. بالنظر إلى أن طريقة المراسل تعتمد على تفاعل إنزيمي ، فإن كلا من التوزيع الحيوي للركيزة في الفأر وحركية luciferase يؤثران على إشارة التوهج الحيوي ، وبالتالي ، القياس الكمي للعدوى (الشكل 1 ب). وبالتالي ، فإن الحصول على صور في لحظات مختلفة من الحركية الأنزيمية يقدم تباينا في البيانات لا يمكن حسابه أو تصحيحه ويؤثر على حساب التدفق الكلي (الفوتونات / الثانية) أو الإشعاع (الفوتونات / الثانية / سم2 / الاستراديان). إلى جانب ذلك ، تعرض عدوى T. cruzi وضعا مكانيا ديناميكيا في الفئران (مناطق وأنسجة مختلفة ، وعمق ، وحمل طفيلي). ومن ثم ، فإن تحديد قيمة الأعداد التي يجب الحصول عليها يمكن أن يفوت مصادر إشارة أضعف (عدد منخفض من الطفيليات في بقعة معينة أعمق في الأنسجة) إذا كان مصدر إشارة أقوى آخر يفي بمعايير التعرض التلقائي المحددة.

ميزة صعبة لبرنامج Living Image هي عرض الصورة المكتسبة بمقياس ألوان تلقائي. لا يوجد خيار لضبط المقياس مسبقا لعرض صورة تم الحصول عليها جديدة تماما تلقائيا وفقا لقيم المقياس المحددة (انظر خطوة البروتوكول 6.2). يجبر هذا الموقف الباحث على تغيير الصور يدويا واحدة تلو الأخرى إلى القيم القصوى والدنيا المختارة. نتيجة لذلك ، لا يمتلك المستخدمون غير المتمرسين وغير المدربين تدريبا جيدا القراءة المناسبة أثناء جلسة الاستحواذ ، وقد يضللون البيانات أو يفقدون معلومات مهمة في تلك المرحلة الزمنية. لذلك ، فإن التجربة التجريبية مفيدة.

أحد الأسئلة الأكثر شيوعا حول تصميم تجربة إثبات المفهوم هو كيفية اختيار مدة العلاج والجرعة. بالنسبة للكيانات الكيميائية الجديدة ، عادة ما يتم تحديد هذه المعلمات من خلال قوة المركب والانتقائية في المختبر ، بالاقتران مع البيانات الناتجة عن استقلاب الأدوية والحرائك الدوائية (DMPK) ودراسات التحمل التي أجريت قبل الاختبار في الجسم الحي للتأكد من فعاليتها. باختصار ، بعد تحديد المركبات القادرة على قتل الطفيلي بشكل انتقائي داخل الخلايا ، يتم إجراء تجارب ADME الأولى (الامتصاص والتوزيع والتمثيل الغذائي والإفراز) في المختبر لتقدير قابلية الذوبان المائي للمركبات ونفاذية الخلية والاستقرار الأيضي ، من بين معايير أخرى. إذا أظهرت المركبات توازنا جيدا للخصائص في المختبر (عادة ما يتم تحديدها في ملفات تعريف المرشحين المستهدفة) ، فإن هؤلاء المرشحين يتم تقدمهم إلى دراسات الحرائك الدوائية في الجسم الحي (PK) في الفئران السليمة ، والتي تحدد تعرض المركب في الدم (وربما في الأنسجة أيضا) وتوفر فكرة عامة عن التحمل عند مستويات جرعة مختلفة17 ، 34,43. من الناحية المثالية ، فإن الهدف من تقييم PK في معظم الأمراض المعدية هو تحديد جدوى الوصول إلى تركيزات البلازما الحرة (المصححة لربط بروتين البلازما) التي تزيد عن تركيزات EC50 / EC90 44 - التركيز الفعال الذي يقتل أو على الأقل يمنع نمو 50٪ أو 90٪ من الطفيليات ، على التوالي - لفترة طويلة بما فيه الكفاية من الزمن. إذا تم تحقيق التعرض الكافي عند مستوى جرعة معين ، فيمكن استخدام هذا النظام أثناء دراسات الفعالية باستخدام نموذج Chagas BLI. بالنسبة لدراسات إعادة وضع الدواء ، يجب أن تكون بيانات PK في المختبر وفي الجسم الحي متاحة. بداية جيدة لإعادة تنميط الأدوية هي قواعد البيانات الكيميائية مثل PubChem45 ، والتي توفر بيانات معترف بها يمكن تحويلها إلى فئران باستخدام القياس الخيفي46 لتقدير أنظمة العلاج الآمنة وغير السامة التي سيتم اختبارها. ومع ذلك ، هذا ليس هو الحال دائما. لا تزال دراسات PK مجالا مهملا في العلوم الأكاديمية ، وينشر عدد قليل من شركات الأدوية نتائج PK الخاصة بهم. يوصي مجتمع علوم اكتشاف الأدوية بتضمين تقييم PK في الجسم الحي جنبا إلى جنب مع فحوصات فعالية الدواء (الديناميكا الدوائية)47. لذلك ، يتوافق التصوير قبل السريري مع القياسات المركبة في وقت واحد ، وهذا النهج المرتبط يعزز متانة البيانات.

بالإضافة إلى ذلك ، تتم مراقبة تعامل الفئران ووزنها وظروفها الصحية طوال التجربة بأكملها. يجب تسجيل علامات السمية والآثار الجانبية مثل الحدب أو الاهتزاز أو فقدان التوازن أو عدم الرغبة في الحركة أو الإحجام عن التغذية أو الشرب أو السجود أو أي تشوهات أخرى موجودة في المجموعة أو بسبب ظروف الفئران الفردية والإبلاغ عنها في الدراسات قبل السريرية. أحد أهداف التصوير البصري هو ضمان رفاهية. وبالتالي ، يجب تطبيق نقاط النهاية الإنسانية في الفئران ذات علامات الألم الموصوفة في "مقياس التجهم48. أيضا ، تم وزن الفئران أسبوعيا أثناء اكتساب BLI ، وفي كثير من الأحيان ، أثناء جرعات الدواء والعلاج CTX. وفقا للوائح رعاية ، يجب القتل الرحيم على الفور للفئران التي تفقد أكثر من 20٪ من وزن الجسم.

نموذج T. cruzi bioluminescent هو الآن أحدث نموذج تجريبي لاكتشاف وتطوير علاجات جديدة لمرض شاغاس. نموذج يكرر السمات الرئيسية لعدوى T. cruzi ومرض شاغاس49 ، مما يسمح بمراقبة الطفيليات في الوقت الفعلي وتمايز المركبات ذات ملامح الفعالية المتنوعة المرتبطة بأنماط العمل المعروفة. BLI هي تقنية تعزز الحزم في تحديد الأنسجة المصابة. إنه يتيح الاختيار الدقيق للأنسجة المصابة لاستخدامها في مجموعة واسعة من الأساليب ، بما في ذلك جميع الطرق الكلاسيكية المطبقة بالفعل في أبحاث T. cruzi 50,51. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يسمح للباحثين باستكشاف التقنيات المتطورة وتطوير تقنيات جديدة33. بالإضافة إلى ذلك ، يوفر BLI تحسين رفاهية والاستخدام الأكثر عقلانية وفقا لمبادئ 3Rs10,35 ، كل ذلك مرة واحدة.

يتم وضع العديد من المجموعات البحثية التي تركز على أمراض المناطق المدارية المهملة في البلدان التي لا تتوفر فيها أجهزة التصوير في الجسم الحي. للتغلب على السيناريو الحالي ، تعمل الشبكات الدولية الجديدة مثل Global BioImaging والاتحادات المرتبطة بها على تعزيز الإجراءات لتوفير الوصول المفتوح إلى المرافق الأساسية للتصوير وتحسين تدريب الموظفين وعلماء التصوير52,53. يمكن لهذه المبادرات ، إلى جانب بروتوكولات المستخدم الودية مثل هذا البروتوكول ، أن توفر الظروف التي تضفي الطابع الديمقراطي على التقنيات المتطورة لجميع الباحثين. قدم تنفيذ هذه الطريقة في اكتشاف الأدوية قبل السريرية قراءات فعالية قوية وقيمة تنبؤية للنتائج السريرية مما يسهل اكتشاف الأدوية لمرض شاغاس.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.

Acknowledgements

يشكر المؤلفون أماندا فرانسيسكو وجون كيلي وفاني إسكوديه على توفير تدريب BLI والدعم على مقايسات فعالية الأدوية ، وجون كيلي وسيمون كالديرانو لتوفير الطفيليات ، وغابرييل باديلا لدعمهم في الدراسات على. حصلت ACS على منحة CAPES PSDE للتدريب في كلية لندن للصحة والطب الاستوائي (المملكة المتحدة). يود المؤلفون أيضا أن يشكروا منصة قياس التدفق الخلوي وأبحاث التصوير (FLUIR) في المرفق الأساسي للبحث العلمي - جامعة ساو باولو (CEFAP-USP) على الدعم الفني في تحليل معدات IVIS Spectrum ، ومختبر علم الوراثة والتحكم الصحي ICB-USP لفحوصات ما بعد التجريب لمراقبة جودة الفئران باعتبارها خالية من مسببات الأمراض. تم تمويل هذا المشروع من قبل DNDi. وتعرب المؤسسة عن امتنانها لمانحيها، من القطاعين العام والخاص، الذين قدموا التمويل لجميع أنشطة المعهد منذ إنشائه في عام 2003. يمكن العثور على قائمة كاملة بالمتبرعين ل DNDi في https://dndi.org/about/donors/.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
BD LSRFortessa™ X-20 Cell AnalyzerBD Biosciences
Weighing Balance (animal facility)Available from several suppliers
IVIS Spectrum In Vivo Imaging SystemRevvity (former PerkinElmer)
FlowJ Software v10.7.1BD Biosciences
Living Image Software for Spectrum v4.7.1Revvity (former PerkinElmer)License Free Analysis Software called 'Aura Imaging' could be used for the most basic features provided by Spectral Instruments Imaging (Bruker company) (https://spectralinvivo.com/software/)
Microsoft Office softwareMicrosoft
GraphPad Prism v8.4.0GraphPad Software Inc.
DMEM Low GlucoseVitrocellD0025
Sodium bicarbonateSigma-AldrichS5761-500G
Foetal Bovine Serum (FBS)Gibco16000-044
Penicillin-StreptomycinGibco15140-122
Trypsin 0.5% EDTAGibco25300-062
LIT mediumIn house
Hygromycin B (50 mg/mL)Gibco10687010
Grace′s Insect MediumSigma-Aldrich G9771
HEPESSigma-Aldrich 54457
IVISBrite d-luciferin potassium saltRevvity (former PerkinElmer)122799Also could be used: VivoGlo Luciferin, in vivo grade (Promega/P1043); D-Luciferin, Monopotassium Salt (Thermo Scientific/88293) or PierceD-Luciferin, Monosodium* Salt (Thermo Scientific/88291); D-Luciferin, Potassium Salt (GoldBio/LUCK or eLUCK); D-Luciferin, Sodium* Salt (GoldBio/LUCNA or eLUCNA) *Sodium or potassium salt differences relies minimal chances on solubility, however do not affect in vivo performance. 
DPBSGibco21600-044
Cyclophosphamide (CTX)Sigma-AldrichC0768-5g
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD5879
(Hydroxypropyl)methyl cellulose (HPMC)Sigma-Aldrich09963-25G
Benzyl alcoholSigma-Aldrich402834
Tween 80Sigma-Aldrich P1754-1L
BenznidazoleELEA
Posaconazole (Noxafil commercial formulation)Schering-Phough
GiemsaAvailable from several suppliers
gavage needle (stainless-steel straight) - 22GAAton CA2003
1 mL Syringe and 31G needleAvailable from several suppliers
1 mL Syringe and removable 26G needleAvailable from several suppliers
1 mL Syringe and removable 24G X¾ needleAvailable from several suppliers
Sterile Syringe Filter 0.2 µmAvailable from several suppliers
A4 Matte Black paper 120gr or thickerPaper Color/ Canson (Available from several suppliers)
aluminum foilAvailable from several suppliers
Neubauer chamberAvailable from several suppliers

References

  1. WHO fact sheet. Chagas disease (also known as American trypanosomiasis). WHO, World Health Organization Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/chagas-disease (2023)
  2. Lee, B. Y., Bacon, K. M., Bottazzi, M. E., Hotez, P. J. Global economic burden of Chagas disease: a computational simulation model. Lancet Infect Dis. 13 (4), 342-348 (2013).
  3. Bern, C. Chagas' disease. N Engl J Med. 373 (5), 456-466 (2015).
  4. Shikanai-Yasuda, M. A., Carvalho, N. B. Oral transmission of Chagas disease. Clin Infect Dis. 54 (6), 845-852 (2012).
  5. Lidani, K. C. F., et al. Chagas disease: From discovery to a worldwide health problem. Front Public Health. 7, 166 (2019).
  6. Perez-Molina, J. A., Molina, I. Chagas disease. Lancet. 391 (10115), 82-94 (2018).
  7. Field, M. C., et al. Anti-trypanosomatid drug discovery: An ongoing challenge and a continuing need. Nat Rev Microbiol. 15 (7), 447 (2017).
  8. Kratz, J. M. Drug discovery for chagas disease: A viewpoint. Acta Trop. 198, 105107 (2019).
  9. McLatchie, A. P., et al. Highly sensitive in vivo imaging of Trypanosoma brucei expressing 'red-shifted' luciferase. PLoS Negl Trop Dis. 7 (11), e2571 (2013).
  10. Lewis, M. D., Francisco, A. F., Taylor, M. C., Kelly, J. M. A new experimental model for assessing drug efficacy against Trypanosoma cruzi infection based on highly sensitive in vivo imaging. J Biomol Screen. 20 (1), 36-43 (2015).
  11. Costa, F. C., et al. Expanding the toolbox for Trypanosoma cruzi: A parasite line incorporating a bioluminescence-fluorescence dual reporter and streamlined CRISPR/Cas9 functionality for rapid in vivo localisation and phenotyping. PLoS Negl Trop Dis. 12 (4), e0006388 (2018).
  12. Lewis, M. D., et al. Bioluminescence imaging of chronic Trypanosoma cruzi infections reveals tissue-specific parasite dynamics and heart disease in the absence of locally persistent infection. Cell Microbiol. 16 (9), 1285-1300 (2014).
  13. Francisco, A. F., et al. Limited ability of posaconazole to cure both acute and chronic Trypanosoma cruzi infections revealed by highly sensitive in vivo imaging. Antimicrob Agents Chemother. 59 (8), 4653-4661 (2015).
  14. du Sert, N. P., et al. The arrive guidelines 2.0: Updated guidelines for reporting animal research. PLoS Biol. 18 (7), e3000410 (2020).
  15. Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider. J Am Assoc Lab Anim Sci. 50 (5), 600-613 (2011).
  16. Turner, P. V., Pekow, C., Vasbinder, M. A., Brabb, T. Administration of substances to laboratory animals: equipment considerations, vehicle selection, and solute preparation. J Am Assoc Lab Anim Sci. 50 (5), 614-627 (2011).
  17. Francisco, A. F., et al. Nitroheterocyclic drugs cure experimental Trypanosoma cruzi infections more effectively in the chronic stage than in the acute stage. Sci Rep. 6, 35351 (2016).
  18. Moraes, C. B., et al. Nitroheterocyclic compounds are more efficacious than CYP51 inhibitors against Trypanosoma cruzi: implications for Chagas disease drug discovery and development. Sci Rep. 4, 4703 (2014).
  19. Shaner, N. C., et al. A bright monomeric green fluorescent protein derived from Branchiostoma lanceolatum. Nat Methods. 10 (5), 407-409 (2013).
  20. de Araújo-Jorge, T. C., de Castro, S. L. . Chagas Disease: Manual for Animal Experimentation. , (2000).
  21. JoVE. JoVE Science Education Database. Anesthesia Induction and Maintenance. JoVE. , (2023).
  22. Taylor, M. C., et al. Exploiting genetically modified dual-reporter strains to monitor experimental Trypanosoma cruzi infections and host-parasite interactions. Methods Mol Biol. 1955, 147-163 (2019).
  23. Keyaerts, M., et al. Inhibition of firefly luciferase by general anesthetics: effect on in vitro and in vivo bioluminescence imaging. PLoS One. 7 (1), e30061 (2012).
  24. Jiron, J. M., et al. Comparison of isoflurane, ketamine-dexmedetomidine, and ketamine-xylazine for general anesthesia during oral Procedures in rice rats (Oryzomys palustris). J Am Assoc Lab Anim Sci. 58 (1), 40-49 (2019).
  25. GoldBio. GoldBio Luciferin In Vivo Handbook - a detailed method for Luciferin preparation and administration for model animals. GoldBio Protocol Available from: https://goldbio.com/documents/1068/Luciferin%20in%20vivo%20handbook.pdf (2013)
  26. Revity. Preparation of IVISbriteTM D-Luciferin for in vitro and in vivo bioluminescent assays. Revvity Standard Operate Procedure (Tech Notes) Available from: https://resources.perkinelmer.com/lab-solutions/resources/docs/SOP_LuciferinPrep_InVitroInVivo_BLI-Assays.pdf (2023)
  27. Chatelain, E., Scandale, I. Animal models of Chagas disease and their translational value to drug development). Expert Opin Drug Discov. 15 (12), 1381-1402 (2020).
  28. Khare, S., et al. Antitrypanosomal treatment with benznidazole is superior to posaconazole regimens in mouse models of Chagas disease. Antimicrob Agents Chemother. 59 (10), 6385-6394 (2015).
  29. Bustamante, J. M., Craft, J. M., Crowe, B. D., Ketchie, S. A., Tarleton, R. L. New, combined, and reduced dosing treatment protocols cure Trypanosoma cruzi infection in mice. J Infect Dis. 209 (1), 150-162 (2014).
  30. Molina, I., et al. Randomized trial of posaconazole and benznidazole for chronic Chagas' disease. N Engl J Med. 370 (20), 1899-1908 (2014).
  31. JoVE. Science Education Database. Compound Administration II. JoVE. , (2023).
  32. Pukhalsky, A. L., Toptygina, A. P., Viktorov, V. V. Immunosuppressive action of cyclophosphamide in mice: Contribution of some factors to determination of strain differences. Int J Immunopharmacol. 15 (4), 509-514 (1993).
  33. Francisco, A. F., et al. Comparing in vivo bioluminescence imaging and the Multi-Cruzi immunoassay platform to develop improved Chagas disease diagnostic procedures and biomarkers for monitoring parasitological cure. PLoS Negl Trop Dis. 16 (10), e0010827 (2022).
  34. Kratz, J. M., et al. The translational challenge in Chagas disease drug development. Mem Inst Oswaldo Cruz. 117, e200501 (2022).
  35. Youn, H., Hong, K. -. J. In vivo noninvasive small animal molecular imaging. Osong Public Health Res Perspect. 3 (1), 48-59 (2012).
  36. Refaat, A., et al. In vivo fluorescence imaging: success in preclinical imaging paves the way for clinical applications. J Nanobiotechnology. 20 (1), 450 (2022).
  37. Pirovano, G., Roberts, S., Kossatz, S., Reiner, T. Optical imaging modalities: Principles and applications in preclinical research and clinical settings. J Nucl Med. 61 (10), 1419-1427 (2020).
  38. Branchini, B. R., Southworth, T. L., Khattak, N. F., Michelini, E., Roda, A. Red- and green-emitting firefly luciferase mutants for bioluminescent reporter applications. Anal Biochem. 345 (1), 140-148 (2005).
  39. Zhao, H., et al. Emission spectra of bioluminescent reporters and interaction with mammalian tissue determine the sensitivity of detection in vivo. J Biomed Opt. 10 (4), 041210 (2005).
  40. O'Neill, K., Lyons, S. K., Gallagher, W. M., Curran, K. M., Byrne, A. T. Bioluminescent imaging: a critical tool in pre-clinical oncology research. J Pathol. 220 (3), 317-327 (2010).
  41. Mennel, L., et al. A photosensor employing data-driven binning for ultrafast image recognition. Sci Rep. 12 (1), 14441 (2022).
  42. Yoo, Y., Im, J., Paik, J. Low-light image enhancement using adaptive digital pixel binning. Sensors. 15 (7), 14917-14931 (2015).
  43. Moraes, C. B., et al. Accelerating drug discovery efforts for trypanosomatidic infections using an integrated transnational academic drug discovery platform. SLAS Discov. 24 (3), 346-361 (2019).
  44. Sebaugh, J. L. Guidelines for accurate EC50/IC50 estimation. Pharm Stat. 10 (2), 128-134 (2011).
  45. Kim, S., et al. PubChem 2023 update. Nucleic Acids Res. 51, D1373-D1380 (2023).
  46. Sharma, V., McNeill, J. H. To scale or not to scale: the principles of dose extrapolation. Br J Pharmacol. 157 (6), 907-921 (2009).
  47. Barrow, J. C., Lindsley, C. W. The importance of PK-PD. J Med Chem. 66 (7), 4273-4274 (2023).
  48. Langford, D. J., et al. Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse. Nat Methods. 7 (6), 447-449 (2010).
  49. Lewis, M. D., Kelly, J. M. Putting infection dynamics at the heart of Chagas disease. Trends Parasitol. 32 (11), 899-911 (2016).
  50. Brener, Z. Therapeutic activity and criterion of cure on mice experimentally infected with Trypanosoma cruzi. Rev Inst Med Trop Sao Paulo. 4, 389-396 (1962).
  51. Cummings, K. L., Tarleton, R. L. Rapid quantitation of Trypanosoma cruzi in host tissue by real-time PCR. Mol Biochem Parasitol. 129 (1), 53-59 (2003).
  52. . Global BioImaging Available from: https://globalbioimaging.org (2024)
  53. Pfander, C., et al. Euro-BioImaging - Interdisciplinary research infrastructure bringing together communities and imaging facilities to support excellent research. iScience. 25 (2), 103800 (2022).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved