يصف البروتوكول المقدم هنا الخطوات التفصيلية لإجراء دراسات فعالية الدواء في نموذج التوهج الحيوي لعدوى المثقبية الكروزية ، مع التركيز على الحصول على البيانات وتحليلها وتفسيرها. كما يتم توفير إجراءات استكشاف الأخطاء وإصلاحها ومراقبة الجودة لتقليل المشكلات الفنية.
ومن أجل مكافحة وخفض تأثير الأمراض الأولية البشرية على الصحة العامة مثل داء شاغاس وداء الليشمانيات وداء المثقبيات الأفريقي البشري، من الضروري التعجيل بتطوير عقاقير ولقاحات جديدة. ومع ذلك، فإن هذه العملية مليئة بصعوبات مثل بيولوجيا الطفيليات المعقدة للغاية والتسبب في الأمراض، وكما هو الحال بالنسبة لأمراض المناطق المدارية المهملة، فإن التمويل المحدود نسبيا للبحث والتطوير. وبالتالي ، فإن نماذج الدراسة في المختبر وفي الجسم الحي التي يمكنها إعادة إنتاج السمات الرئيسية للعدوى والمرض بشكل كاف مع توفير الاستخدام الرشيد للموارد ضرورية لتقدم البحث عن هذه الحالات. ومن الأمثلة على ذلك نموذج الفأر لتصوير التلألؤ الحيوي في الجسم الحي (BLI) لمرض شاغاس، الذي يوفر كشفا شديد الحساسية للضوء طويل الطول الموجي الناتج عن طفيليات المثقبية الكروزية التي تعبر عن لوسيفيراز. على الرغم من أن هذه التقنية أصبحت النهج القياسي لفعالية الأدوية في دراسات الجسم الحي ، إلا أن مجموعات البحث قد لا تزال تكافح من أجل تنفيذها بسبب نقص التدريب العملي المناسب على التعامل مع المعدات وتطبيق إجراءات مراقبة الجودة ، حتى عندما تكون معدات BLI المناسبة متاحة بسهولة. بالنظر إلى هذا السيناريو ، يهدف هذا البروتوكول إلى التوجيه من تخطيط التجارب إلى الحصول على البيانات وتحليلها ، مع التفاصيل التي تسهل تنفيذ البروتوكولات في مجموعات البحث ذات الخبرة القليلة أو المعدومة مع BLI ، إما لمرض شاغاس أو لنماذج الفئران الأخرى للأمراض المعدية.
مرض شاغاس متوطن في أمريكا اللاتينية ويصيب ما يقرب من سبعة ملايين شخص في جميع أنحاء العالم1. سنويا ، أكثر من 50000 حالة وفاة وخسائر اقتصادية تبلغ حوالي 7 مليارات دولار ناتجة عن الطبيعة المعوقة لهذا المرض2. يحدث مرض شاغاس بسبب المثقبية الكروزية الأولية ، وهو طفيلي هيموفلاجيلات غير متجانس قادر على إصابة الثدييات (البرية والمنزلية) ونواقل الترياتومين (Hemiptera ، Reduviidae)3 في الأمريكتين ، حيث يتم تأسيس انتقال النواقل. تشمل طرق العدوى المهمة الأخرى نقل الدم وزرع الأعضاء والفم (عن طريق تناول طعام ملوث بالترياتومين المصاب)4 والانتقال الخلقي. وقد أسهمت طرق الانتقال غير الناقلة في انتشار داء شاغاس إلى المناطق غير الموبوءة 3,5.
يتجلى مرض شاغاس في مرحلتين سريريتين. المرحلة الحادة ، في معظم الحالات ، بدون أعراض. عادة ما ترتبط العدوى المصحوبة بأعراض بعلامات غير محددة مثل الحمى والتعب والألم العضلي واعتلال العقد اللمفية وتضخم الطحال وتضخم الكبد. غالبا ما ترتبط المرحلة الحادة أيضا بطفيليات براءات الاختراع والدورة الدموية الجهازية للطفيليات. قد تحدث الوفاة في ما يصل إلى 10٪ من الحالات التي تم تشخيصها ، خاصة في حالات العدوى الفموية6. غالبا ما تتميز المرحلة المزمنة بفترة طويلة من عدم وجود أي أعراض. مع مرور الوقت ، يظهر ما يقرب من ثلث المرضى المصابين قبل عقود مظاهر قلبية ، وعادة ما تكون مصحوبة بالتليف والتهاب عضلة القلب ، و / أو اضطرابات الجهاز الهضمي المرتبطة في الغالب بتطور تضخم المريء و / أو متلازمات تضخم القولون3،5،6.
يتكون العلاج المسبب لمرض شاغاس من عقارين فقط: بنزنيدازول ونيفورتيموكس. هذه العوامل المضادة للطفيليات متاحة منذ أكثر من 50 عاما ولها سمية كبيرة وفعالية محدودة5،7،8. وبالتالي، هناك حاجة ملحة لتطوير علاجات جديدة وآمنة وأكثر فعالية لمرضى داء شاغاس.
تقنيات أكثر تطورا ودقة تجعل من الممكن الآن الحصول على إجابات للأسئلة القديمة التي تسمح بالتقدم في البحث عن علاجات جديدة لمرض شاغاس. بهذا المعنى ، يستفيد المجتمع العلمي بشكل كبير من الطفيليات المعدلة وراثيا للدراسات في الجسم الحي حول مسار العدوى وتقييم فعالية الدواء9،10،11،12. يسمح الفحص الطولي القائم على نظام التصوير الحيوي (BLI) بتقييم الفعالية أثناء وبعد نظام العلاج ، مما يؤدي إلى تحديد المركبات ذات نشاط المثقبيات10,13. توفر طريقة BLI قياسا مباشرا لحمل الطفيليات ، سواء في الدورة الدموية أو في الأنسجة والأعضاء ، من خلال تحديد كمية الضوء الناتج عن T. cruzi CL Brener Luc المعدل وراثيا :: سلالةالنيون 11 ، والتي تعبر بشكل أساسي عن اليراع الأحمر luciferase12.
ومع ذلك ، بعد ما يقرب من 10 سنوات من إنشاء النموذج الحيواني لمرض شاغاس BLI ودراسات فعالية الأدوية ، لا تهيمن على هذه التقنية سوى عدد قليل من المجموعات البحثية. هذه الحقيقة لا ترجع فقط إلى انخفاض الوصول إلى معدات التصوير المناسبة ولكن أيضا إلى نقص التدريب وتوافر بروتوكولات منظمة ومفصلة. تقدم هذه الطريقة العديد من المزايا مقارنة بالأساليب الأخرى ، والتي تعتمد على تقييم الطفيليات عن طريق الفحص المجهري أو الأمصال أو تقييم عدوى الأعضاء / الأنسجة بواسطة qPCR للكشف عن الحمض النووي للطفيلي ، لأنها تسمح بتحسين رفاهية الفئران وتقليل استخدام من خلال إمكانية توليد بيانات أكثر قوة وتكاملا في الجسم الحي. علاوة على ذلك ، يمكن القول إن هذه الطريقة أكثر حساسية ، لأنها تتيح الكشف السهل عن بؤر الطفيليات في الأعضاء الحشوية بعد العلاج بالعقاقير10,12. لذلك ، يهدف هذا البروتوكول إلى توجيه مجموعات البحث في علم الطفيليات والأمراض المعدية الأخرى لإنشاء هذه المنهجية في مختبراتها من خلال تفصيل الإجراءات الفنية. وهنا، نتشاطر الخبرة المكتسبة من خلال تنفيذ نموذج BLI لمرض شاغاس في البرازيل، وهو الأول من نوعه في أمريكا اللاتينية، كجزء من جهود اكتشاف الأدوية التي تنسقها مبادرة أدوية الأمراض المهملة (DNDi).
تم تقديم جميع الإجراءات الموضحة في هذا البروتوكول والموافقة عليها وتنفيذها وفقا للمبادئ التوجيهية14 التي وضعتها لجنة أخلاقيات التابعة لمعهد العلوم الطبية الحيوية في جامعة ساو باولو: بروتوكول CEUA ICB / USP no 5787250522.
1. الحلول
ملاحظة: ضع في اعتبارك الحجم المعطى مسبقا البالغ 10 مل / كجم (200 ميكرولتر لوزن الفأر 20 جم) 15,16. على سبيل المثال ، قم بإعداد محلول عمل 15 مجم / مل للوصول إلى 150 مجم / كجم من جرعات.
2. ثقافة المثقبية الكروزية
3. تحليل تجانس مجموعة المثقبية الكروزية بواسطة مقياس التدفق الخلوي
4. عدوى الفئران التجريبية
ملاحظة: لزيادة كمية الطفيليات ، يتم الحصول على المثقبيات في مجرى الدم (BT) بشكل متكرر من الفئران التي تعاني من نقص المناعة10،13. هنا ، يتم استخدام كبت المناعة الكيميائية للفئران BALB / C للحصول على BT. لذلك ، يتم تحقيق كبت مناعي خفيف بأربع حقن داخل الصفاق من سيكلوفوسفاميد (CTX) عند 62.5 مجم / كجم مع فترات 96 ساعة ، والتي يتم إجراؤها بالتزامن مع عدوى T. cruzi .
5. التصوير في الجسم الحي
ملاحظة: فيما يلي مسرد المصطلحات المستخدمة هنا:
جلسة تصوير: يتم إجراء اكتساب التلألؤ البيولوجي في جميع مجموعات تجربة معينة في يوم معين. يوضح الشكل 1 أ نظرة عامة على الإجراء.
جولة التصوير: يتم إجراء العملية في مجموعات فرعية من ثلاثة فئران ، من حقن D-luciferin إلى التعافي من التخدير. يوصى بأن تحتوي كل مجموعة تجريبية على 6 فئران ، بسبب التباين الجوهري للفئران في حمل الطفيليات والعوامل الأخرى التي تؤثر على القياس الكمي ل BLI الموصوف أدناه.
اقتناء التصوير: التصوير الضوئي الذي تقوم به معدات التصوير لتحديد التلألؤ البيولوجي ، مما ينتج عنه تراكب صورة للصورة والتلألؤ البيولوجي الكمي الموضح كمقياس ألوان زائف.
إجراء التصوير: جميع الخطوات التي تمت مناقشتها في هذه الجلسة من البروتوكول.
الشكل 1: الحصول على بيانات BLI. (أ) رسم تخطيطي لسير عمل الاقتناء المطبق على دراسات الأمراض المعدية ، باستخدام نموذج الفأر المضيء بيولوجيا لمرض شاغاس كمثال. يتم تحليل الفئران المصابة ب T. cruzi المعدلة وراثيا عن طريق التصوير في الجسم الحي على النقاط الزمنية المحددة. في كل جولة تصوير ، يتم حقن مجموعات تصل إلى ثلاثة فئران ب 150 مجم / كجم من الركيزة الإنزيمية (D-luciferin). بعد 5 دقائق ، يتم إعطاء التخدير بنسبة 2.5٪ (v / v) إيزوفلوران في الأكسجين. عندما تكون بلا حراك تماما ، يتم وضع الفئران في نظام تصوير ، ويبدأ الاستحواذ باتباع الإعدادات المحددة. بعد التصوير ، تتعافى الفئران من التخدير وتعود إلى الأقفاص. يتم تمييز الأسئلة والقضايا المتكررة التي قد يواجهها الباحثون ويواجهونها أثناء الاستحواذ باللون الأحمر. تم تعديل هذا المخطط من Lewis et al. (2014) 12 (تم إنشاؤه باستخدام BioRender.com: UD26KWEVS2). (ب) حركية في الجسم الحي ل D-luciferin / luciferase اليراع الأحمر (PpyRE9h). تم تخدير الفئران في ذروة الطفيليات T. cruzi (ن = 3) وحقنها ب 150 مغ/كغ د-لوسيفيرين. تم الحصول على الصور لمدة 1 ساعة (وقت التعرض: 2 دقيقة ؛ binning: 4). أعلى: القياس الكمي للتدفق الكلي البطني (p / s) (المحور Y الأيسر ، باللون الأحمر) وكنسبة مئوية من أعلى متوسط قياس (المحور Y الأيمن ، باللون الأزرق). يتم عرض البيانات كمتوسط (منحنيات) وانحراف معياري (منطقة مظللة). أسفل: الصور التي تم الحصول عليها لأول نقطة زمنية (4 دقائق) وأعلى إشارة BLI (30 دقيقة) وآخر (62 دقيقة). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
6. تحليل البيانات
ملاحظة: يعتمد البروتوكول أعلاه على برامج التصوير التجارية في الجسم الحي . ومع ذلك ، يمكن للإصدار الخالي من ترخيص البرنامج إجراء التحليل الأساسي. يمكن العثور على تفاصيل البرنامج في جدول المواد.
الشكل 2: خطوات تحليل البيانات من ضبط مقاييس الصورة إلى قياس التلألؤ. (أ) عرض برنامج الصور الحية لمعالجة بيانات الصور. الخطوة 1: قم بتحميل البيانات التي تم الحصول عليها كتسلسل باستخدام أداة المتصفح. الخطوة 2: حدد التجميع المستخدم لكل عملية اكتساب (سيظهر أعلى الصور الفردية). الخطوة 3: اضبط جميع صور الفئران المصابة على نفس عامل التجميع وقم بتطبيق عامل التجميع 16 على الفئران غير المصابة. الخطوة 4: اضبط مقياس الألوان يدويا بناء على الفئران غير المصابة (السهم الأرجواني) ، والتي يجب رؤيتها على الشاشة على أنها غير مضيئة بيولوجيا ، والفئران المصابة وغير المعالجة في أعلى بؤر التوهج الحيوي (السهم الأحمر) ، والتي يجب أن ينظر إليها على أنها حمراء. الخطوة 5: للحصول على صورة خالية من أي معلومات مكتوبة ، انقر نقرا مزدوجا فوق كل صورة وقم بتصدير الصورة باستخدام ملف تصدير الرسومات زر. (ب) عرض أدوات مناطق الاهتمام (ROI). الخطوة 1: ارسم عائد استثمار يغطي الماوس بالكامل وانسخ والصق نفس عائد الاستثمار لكل. احفظ عائد الاستثمار المعدل وقم بتطبيقه على جميع الصور في التجربة. باسو 2: انقر فوق الزر "قياس عائد الاستثمار" لإنشاء الجدول المراد تصديره بتنسيق .csv أو .txt. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
7. إجراء خارج الجسم الحي
باستخدام نموذج فأر مناسب يعتمد على الطفيليات المحورة وراثيا التي تعبر بشكل أساسي عن luciferase ، من الممكن إعادة إنتاج ميزات عدوى T. cruzi البشرية الرئيسية التي تسبب الحد الأدنى من الضرر للمضيف ، مما يسمح بتتبع الطفيليات في الوقت الفعلي بواسطة BLI كامل الجسم للمضيف بطريقة طولية (مدى الحياة) ، لمدة تصل إلى عدة أشهر12.
يوضح الشكل 3 تجربة تجريبية توضح الدورة الزمنية لعدوى CL Brener Luc::Neon من اليوم 1 بعد الإصابة حتى 150 نقطة في البوصة في الفئران BALB / c. في أول 20 نقطة في البوصة ، يزداد عبء الطفيليات المستنبطة من التلألؤ الحيوي ، وهو نموذجي لذروة الطفيليات ، يليه انخفاض حاد في حمل الطفيليات ، بسبب التحكم المناعي للفئران. وبالتالي ، تعتبر المرحلة الحادة من العدوى أول 50 نقطة في البوصة. يتم تعريف المرحلة المزمنة عندما تصل العدوى إلى معدل تلألؤ حيوي ثابت ، من 100-150 نقطة في البوصة.
الشكل 3: فهم النموذج. حركية المثقبية الكروزية CL Brener Luc::عدوى النيون في الفئران BALB / c (ن = 11). اللوحة العلوية: صور مضيئة بيولوجية بطنية وظهرية من نقاط زمنية مختلفة لمدة 150 يوما بعد الإصابة (نقطة في البوصة) مع 1 × 10³ تريبوماستيغوت مجرى الدم عن طريق الحقن داخل الصفاق. مقياس خريطة الحرارة (في السجل10) لإشارة التوهج الحيوي في الإشعاع (p / s / cm2 / sr). رمز اللون: أرجواني = 5 × 103 ؛ أحمر = 1 × 107. اللوحة السفلية: القياس الكمي لإشارة التوهج الحيوي في التدفق الكلي (p / s) للفئران التي تغطي الجسم بالكامل. يتم التعبير عن البيانات كوسائل (خطوط) وانحرافات معيارية (مناطق مظللة). يتم تمييز الفترات المحددة للمراحل الحادة والمزمنة من العدوى في نموذج الماوس هذا باللون البرتقالي. تظهر قيم متوسط التلألؤ للفئران غير المصابة (n = 3) كعتبة (خط رمادي فاتح). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
يمكن أيضا التنبؤ بالنتائج العلاجية لأن المراحل الرئيسية للعدوى يتم استنساخها جيدا في نموذج الفأر. وبالتالي ، يتم تطبيق BLI الآن على العلوم الانتقالية من خلال دراسات إثبات المفهوم التي تدعم اتخاذ القرار بشأن إمكانات فعالية المركب والتقدم في خط أنابيب التطوير10,27. في نموذج الفأر الحاد ، يجب أن يبدأ العلاج عن طريق الفم عندما تصل العدوى إلى ذروة الطفيليات (حوالي 14-21 نقطة في البوصة) ، والتي تتميز بعدد كبير من المثقبيات في مجرى الدم (حوالي 1 × 105 تريبوماستيغوتيس / مل - البيانات غير معروضة) والعدوى الجهازية. في المرحلة المزمنة ، يبدأ علاج الفئران عند 100 نقطة في البوصة ، عندما يكون حمل الطفيلي أقل بكثير نسبيا ، مع تطفل الدم الفرعي المستقر.
لإثبات تطبيق البروتوكول الموصوف أعلاه في تقييم العوامل المضادة للطفيليات ، قمنا بمقارنة فعالية علاج البنزنيدازول (BZ) ، وهو الدواء القياسي المستخدم لعلاج مرض شاغاس ، وبوساكونازول (Posa) ، وهو مثبط ستيرول 14α-demethylase (CYP51) فشل في التجارب السريرية لمرض شاغاس ، وقد ثبت أيضا أنه غير فعال كعامل مضاد للطفيليات ضد T. cruzi في المختبر وفي الجسم الحي، بما في ذلك في نموذج BLI الموصوف في هذا البروتوكول13،18،28،29،30.
بالنسبة لنموذج الفئران الحادة ، عولجت مجموعات من 6 فئران لكل مجموعة عن طريق الفم عن طريق التزجيج31 لمدة 20 يوما مع Posa عند 20 مجم / كجم أو BZ عند 100 مجم / كجم ، مرة واحدة يوميا. كما عولجت الفئران ب BZ لمدة 5 أيام بمعدل 100 مجم / كجم مرة واحدة يوميا لتقييم تأثير العلاجات القصيرة. بعد التخلص من المركب (بعد 10 أيام من انتهاء العلاج) ، تم تثبيط مناعة الفئران السلبية BLI ، وهي حالة تعزز انتكاس العدوى عندما لا يتم تحقيق علاج طفيلي (الشكل 4 أ). أدى علاج Posa إلى انخفاض بنسبة 99.49٪ ± 0.27٪ (متوسط ± الانحراف المعياري) في عبء الطفيليات المستنبطة من التلألؤ الحيوي في نهاية العلاج وظل عند مستويات مماثلة من الفئران غير المصابة خلال فترة التخلص من مركب الدواء (باستثناء الماوس # 3 ، مع إشارة عابرة عند 40 نقطة في البوصة ، والماوس # 2 ، الذي أظهر بقعة BLI ضعيفة عند 44 نقطة في البوصة). بالمقارنة مع المجموعة غير المعالجة ، قلل علاج BZ لمدة 20 يوما بنسبة 100٪ ± 0.01٪ من عبء الطفيليات المستنبطة من التلألؤ الحيوي في نهاية العلاج. في المقابل ، أدى العلاج القصير مع BZ لمدة 5 أيام إلى انخفاض بنسبة 99.98٪ ± 0.03٪ عند 19 نقطة في البوصة (على غرار مستوى العتبة). ومع ذلك ، في هذه الحالة ، كان تخفيض BLI عابرا وفي عمليات الاستحواذ اللاحقة ، قدمت جميع الفئران إعادة تنشيط العدوى (الشكل 4B).
الشكل 4: تصميم تجربة إثبات المفهوم والنتائج التي تم الحصول عليها من خلال تصوير التلألؤ الحيوي في النموذج الحاد لمرض شاغاس. (أ) مخطط تخطيطي لعملية الجدول الزمني في نموذج فأر مرض شاغاس الحاد للدراسات قبل السريرية لتقييم فعالية المركب. النقاط السوداء: نقاط وقت التصوير. قارورة الدواء وشريط البرتقال: بداية العلاج ونهايته ، على التوالي. رمز حقنة: حقن سيكلوفوسفاميد. DPI: يوم ما بعد الإصابة. رمز اللون: رمادي = عدوى غير معالجة ؛ البرتقالي = فترة العلاج ؛ الأزرق = مرحلة القضاء على المركب ؛ الأصفر = فترة كبت المناعة. (ب) المسار الزمني لعلاج المثقبية الكروزي. اللوحة اليسرى: صور التلألؤ الحيوي البطني لفئران BALB / c (i) غير المعالجة أو المعالجة لمدة 20 يوما مع (ii) بوساكونازول (Posa) عند 20 مجم / كجم ، (iii) بنزنيدازول (BZ) عند 100 مجم / كجم معالج لمدة 20 يوما و (iv) BZ عند 100 مجم / كجم معالج لمدة 5 أيام باستخدام (n = 6 / مجموعة). تم إعطاء جميع العلاجات عن طريق الفم عن طريق التزويج (10 مل / كجم) مرة واحدة في اليوم. تشير خريطة الحرارة بمقياسLog 10 إلى شدة إشارة التوهج الحيوي من المستوى المنخفض (الأزرق) إلى العالي (الأحمر). الرسم البياني الأيمن: القياس الكمي لكامل الجسم لبيانات تصوير التلألؤ الحيوي. يتم التعبير عن البيانات كوسائل (خطوط) وانحرافات معيارية (مناطق مظللة). مفتاح: قارورة الطب: بدء العلاج (14 نقطة في البوصة) ؛ الشريط البرتقالي: نهاية المعالجة (18 نقطة في البوصة / 33 نقطة في البوصة) ؛ حقنة أيقونة حقن سيكلوفوسفاميد (من يوم 44-53) ؛ النقطة البرتقالية: تم تحليل الماوس بواسطة إجراء خارج الجسم الحي ؛ § البيانات المستبعدة بسبب تسرب D-luciferin في البول. (ج) إجراء خارج الجسم الحي للكشف عن بؤر T. cruzi في الأعضاء والأنسجة. يتم تقديم مفتاح توزيع اللوحة في أسفل الشكل (تم إنشاؤه باستخدام BioRender.com: ZY26LG8AOF). نفس مقياس السطوع كما هو موضح في لوحة الجسم الحي . يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
في هذا النموذج ، قد يقلل العلاج المضاد للطفيليات من حمل الطفيليات إلى ما دون حد اكتشاف BLI البالغ 1000 طفيلي. وهكذا ، تظهر الفئران على أنها BLI سالب10. لضمان تحقيق علاج طفيلي ، من الضروري تعزيز كبت المناعة للفئران باستخدام علاج سيكلوفوسفاميد29,32. الفئران التي لا يزال لديها حمولة طفيلية لا يمكن اكتشافها بعد العلاج بالعقاقير ستصبح إيجابية BLI بعد كبت المناعة. يظهر هذا التأثير على نطاق أوسع من خلال علاج Posa في النموذج الحاد ، والذي يعزز انتكاس الطفيليات. في هذه التجربة ، تم إجراء ex vivo على الفئران ذات أدنى إشارة توهج حيوي لتقييم انتحاء أنسجة الطفيليات (الشكل 4C). تظهر الفئران غير المعالجة إشارات توهج حيوي قوية ، خاصة في الجهاز الهضمي (TGI) والأنسجة المرتبطة بها مثل الدهون الحشوية والمساريق. بالإضافة إلى ذلك ، كان الجلد موقعا مرتبطا باستمرار الطفيليات. قدمت الفئران التي عولجت ب Posa بقعا مضيئة بيولوجيا منخفضة الكثافة كانت أكثر تقييدا على القولون والمساريق والدهون الحشوية. من ناحية أخرى ، في الفئران المعالجة بنظام علاج علاجي ، مثل BZ 100 mg / kg لمدة 20 يوما ، لا يتم الكشف عن أي إشارة تلألؤ حيوي حتى في ظل كبت المناعة. لذلك ، بالنظر إلى أنه بعد تعزيز ظروف إشارة التوهج الحيوي التي ترتفع فوق مستوى عتبة 1000 طفيلي10 ، وزيادة الحساسية عن طريق تعريض الأعضاء الحشوية ، يعتبر أن BZ 100 mg / kg لمدة 20 يوما يوفر علاجا معقما. تم التحقق من صحة تقييم العلاج المعقم سابقا من خلال تقنيات مختلفة10،13،17،33،34.
تم تطبيق تصميم دراسة مماثل على النموذج المزمن (الشكل 5 أ) ، حيث بدأ علاج الفئران (ن = 6 / مجموعة) في اليوم 100 بعد الإصابة. في هذه المرحلة ، تم إعطاء Posa 20 mg / kg ، BZ بمعدل 100 mg / kg ، أو 10 mg / kg مرة واحدة يوميا عن طريق الفم لمدة 20 يوما. بعد فترة التخلص من المخدرات ، تم تثبيط مناعة الفئران السلبية BLI. بالإضافة إلى ذلك ، لتقييم العلاج المعقم ، خضعت الفئران التي كانت لا تزال سلبية BLI في نهاية مرحلة كبت المناعة لتحليل خارج الجسم الحي .
في العدوى المزمنة ، أدى العلاج ب Posa عند 20 مغ / كغ إلى انخفاض بنسبة 95.03٪ ± 6.18٪ في عبء الطفيليات المستنبطة من التلألؤ البيولوجي في نهاية العلاج وظل عند مستويات مماثلة من الفئران غير المصابة خلال فترة التخلص من الدواء. بعد كبت المناعة ، أظهرت غالبية الفئران مستوى متغيرا من إشارة BLI وتوزيعها (الشكل 5B). كشف الإجراء خارج الجسم الحي أن فئرانا سلبية BLI لكامل الجسم عولجت ب Posa كان لديها بقعة مضيئة بيولوجيا في القولون يمكن اكتشافها عن طريق الفحص خارج الجسم الحي (الشكل 5C).
الشكل 5: تصميم تجربة تقييم الأدوية والنتائج المحققة في النموذج المزمن لعدوى المثقبية الكروزية عن طريق التصوير الحيوي. (أ) مخطط تخطيطي لتصميم تجربة نموذج فأر مرض شاغاس المزمن. النقاط السوداء: نقاط وقت التصوير. قارورة الدواء وشريط البرتقال: بداية العلاج ونهايته ، على التوالي. رمز حقنة: حقن سيكلوفوسفاميد. نقطة في البوصة: يوم ما بعد الإصابة. رمز اللون: رمادي = عدوى غير معالجة. البرتقالي = فترة العلاج ؛ الأزرق = مرحلة القضاء على المركب ؛ الأصفر = كبت المناعة. أرجواني = الانتكاس. (ب) التقييم الطولي لفعالية العلاج في نموذج مرض شاغاس المزمن. اللوحة اليسرى: BLI البطني للفئران BALB / c (i) غير المعالجة أو المعالجة لمدة 20 يوما مع (ii) بوساكونازول (Posa) عند 20 مجم / كجم ؛ '3' البنزنيدازول عند 100 مغ/كغ، و'4' بى زيد عند 10 مغ/كغ (ن = 6/مجموعة). تم إعطاء جميع العلاجات عن طريق الفم عن طريق التزويج مرة واحدة في اليوم. الرسم البياني الأيمن: مجموع البيانات الأولية للتدفق الكلي البطني والظهري. مفتاح: قارورة الطب: بدء العلاج (102 نقطة في البوصة) ؛ الشريط البرتقالي: نهاية العلاج (121 نقطة في البوصة) ؛ شريط أصفر ورمز حقنة: حقن سيكلوفوسفاميد (من اليوم 131-142). النقطة البرتقالية: تم تحليل الماوس بواسطة إجراء خارج الجسم الحي . ! توفي الفأر أثناء التخدير. يعرض الماوس تشوهات في البطن. يشير مقياس خريطة الحرارة (Log10) إلى شدة التلألؤ الحيوي في وحدة الإشعاع من المستوى المنخفض (3 × 105 باللون الأزرق) إلى المستوى العالي (1 × 107 باللون الأحمر). ج: التحليل خارج الجسم الحي لانتحاء المطثية الكروزية في الأنسجة. كشف التلألؤ الحيوي للأعضاء المستأصلة من الفئران المثبطة للمناعة في الجسم الحي BLI السلبية بعد العلاج ب Posa و BZ عند 100 مغ / كغ أو الفئران ذات أدنى إشارة في المجموعات غير المعالجة و BZ عند 10 ملغم / كغم. يظهر مفتاح توزيع اللوحة في أسفل الشكل (تم إنشاؤه باستخدام BioRender.com: ZY26LG8AOF). مقياس الإشراق يساوي في لوحة الجسم الحي . يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
أدت المعالجة باستخدام BZ عند 100 مجم / كجم إلى تقليل التلألؤ الحيوي إلى مستويات العتبة (93.87٪ ± 2.14٪) عند 122 نقطة في البوصة وما بعدها حتى نهاية التجربة. بالنظر إلى التحليل خارج الجسم الحي ، حققت BZ معدل شفاء بنسبة 100٪ (6/6 فئران) ، حيث لم تقدم أي فئران عودة لإشارة التوهج الحيوي حتى عندما تم فحص الأعضاء الداخلية والمثبطة للمناعة. وهذا يعني عدم وجود انتكاسة. ومع ذلك ، أدى نظام علاج BZ بتركيز أقل إلى انخفاض طفيف في التلألؤ الحيوي (85.95٪ ± 18.43٪) ولكن لا يوجد علاج ، حيث استمرت الفئران في إظهار بؤر إشارة مضيئة حيوية يمكن اكتشافها في جميع النقاط الزمنية اللاحقة. وبالتالي ، يسمح هذا النموذج بالتمايز الكمي بين العلاجات غير الفعالة (بوساكونازول والعلاج دون المستوى الأمثل مع البنزنيدازول) والعلاجات الفعالة (الجرعات المثلى وطول العلاج مع البنزنيدازول).
الشكل التكميلي 1: تحليل ما قبل العدوى لتعبير مجموعة T. cruzi عن لوسيفيراز عن طريق قياس الجين المراسل mNeonGreen fluorescence. قياس التدفق الخلوي لبروتين الفلورسنت mNeonGreen الذي تم التعبير عنه بشكل أساسي بواسطة CL Brener Luc::Neon parasite. الرسم البياني الطبيعي لرقم الطفيلي (المحور Y) بواسطة شدة مضان mNeonGreen (المحور X). توضح الأسطورة الداخلية السلالة والشكل اللذين تم تحليلهما ، ومتوسط التألق ، والنسبة المئوية لسكان التألق. يتم تعريف خطوط البوابة بواسطة سلالة CL Brener البرية (WT) على أنها تحكم غير فلوري. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الجدول التكميلي 1: مثال على جدول التحليل في قياس BLI. البيانات الخام التي تم الحصول عليها من القياس الكمي لتصوير التلألؤ الحيوي لليوم 19 بعد الإصابة في النموذج الحاد المستخدم في النتائج التمثيلية الموضحة في الشكل 4B. وصف المجموعات: السيطرة كفئران غير مصابة (ن = 3 / مجموعة) ؛ مركبة كفئران مصابة غير معالجة ؛ بوساكونازول (Posa) عند 20 مغ/كغ لمدة 20 يوما؛ البنزنيدازول (BZ) عند 100 مغ/كغ لمدة 20 يوما؛ BZ عند 100 ملغ/كغ معالجة لمدة 5 أيام (ن = 6/مجموعة). الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
تصوير التلألؤ البيولوجي هو طريقة متطورة تسمح باكتشاف جين تقرير باستخدام طيف مرئي والأشعة تحت الحمراء من الإشعاع الكهرومغناطيسي. لذلك ، ليست هناك حاجة لعلامات مشعة لتتبع عينتك35. BLI مناسب لنماذج القوارض والأنواع الصغيرة الأخرى. إنه مفيد جدا للدراسات قبل السريرية لأنه أكثر أمانا ويسمح بعدة جولات للصور ، مما يسبب الحد الأدنى من الانزعاج للحيوانات. إلى جانب ذلك ، يعد التصوير في الجسم الحي مرنا للغاية نظرا لإمكانية الجمع بين التلألؤ الحيوي والتألق وتقنيات أخرى مثل التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني36.
يخضع التصوير البصري لخصائص فيزيائية بصرية ، مثل الامتصاص والتشتت. تمتص جميع الأنسجة الضوء وتشتت الضوء ذي الأطوال الموجية المميزة بشكل مختلف37. تتمثل إحدى الخطوات الحاسمة في اختيار جين مراسل دون مراعاة الطول الموجي المنبعث للضوء الناتج عن التفاعل الكيميائي. في حين أن مستوى التعبير الجيني للمراسل قد يكون مرتفعا في المختبر في مقايسات التوهج الحيوي ، فقد لا تتحقق نفس مستويات التعبير عند التقدم إلى الإعداد في الجسم الحي. في هذا البروتوكول ، استخدمنا نسخة Photinus pyralis luciferase (PpyRE9H) 38 المحسنة للكودون للتريبانوسوماتيدس9 ، والتي تنبعث منها الضوء عند 617 نانومتر ، وهي واحدة من أكثر الدراسات ملاءمة للدراسات في الجسم الحي 39. الأطوال الموجية الأطول من 600 نانومتر أقل امتصاصا وتشتتا بواسطة الكروموفورات الداخلية للجسم ، وخاصة الهيموجلوبين والميلانين. وبالتالي ، يمكن أن تنتقل الأضواء الحمراء عبر عدة سنتيمترات من الأنسجة ، مما يسمح للفوتونات بالوصول إلى كاميرا CCD حتى من داخل الأنسجة الحشوية39,40.
أحد مجالات القلق في إعدادات التصوير هو عدم وجود فهم شامل لوظيفتها وتأثيراتها. تجمع تقنية Binning ، وهي تقنية معالجة مسبقة ، المعلومات التي تم الحصول عليها بواسطة أجهزة الكشف المتجاورة في بكسل أكبر. تعمل هذه العملية على تحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء وتقليل ضوضاء الخلفية وتحسين الحساسية. ومع ذلك ، فإنه يقلل من دقة الدقة المكانية ، مما ينتج عنه صورة منقطة41,42. هذه المقايضة هي اعتبار مهم في استراتيجية التصوير الخاصة بك.
استنادا إلى ملف تعريف المنتج المستهدف وملف تعريف المرشح المستهدف لمرض شاغاس34 ، تركز دراسة إثبات المفهوم على الحساسية للكشف عن T. cruzi والمساعدة في تحديد ما إذا كان الدواء المرشح الجديد يمكنه تحقيق علاج معقم (يتمثل في عدم الانتكاس بعد عدة جولات من كبت المناعة). لذلك ، نقوم بتنفيذ BLI باستخدام أعلى عامل تجميع دون تشبع الصورة. عندما تكون الصورة مشبعة، يتم إجراء اكتساب جديد باستخدام عامل تجميع أقل. أثناء التحليل ، يتم تطبيق تصحيح رياضي على الصور التي تتطلب تجميعا مختلفا. بهذه الطريقة ، يجب تقديم البيانات النهائية باستخدام نفس binning. يوضح الجدول 1 القيم المختلفة التي تم الحصول عليها عند تطبيق عوامل binning المميزة في نفس الصورة وعائد الاستثمار.
الجدول 1: تأثير إعدادات binning على القياس الكمي BLI. القياس الكمي لثلاثة عائد استثمار على صورة النموذج الحاد (d13) والنموذج المزمن (d118) ، تم تحليلها في عوامل تجميع مختلفة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
بسبب السيناريو الحالي لمرض شاغاس في العيادة ، تهدف جهود اكتشاف الأدوية إلى القضاء التام على الطفيليات (العلاج الطفيلي)27,34. لذلك ، يتضمن البروتوكول قبل السريري في الجسم الحي مناهج تتغلب على قيود الحساسية التقنية BLI. أحد الأساليب هو علاج الفئران بسيكلوفوسفاميد لتقليل الاستجابة المناعية التي تتحكم في حمل الطفيلي. هناك استراتيجية أخرى تتمثل في تقليل عمق الأنسجة وإزالة طبقات العضلات والجلد والفراء التي تعيق مسار الضوء إلى الكاميرا. من خلال إجراء خارج الجسم الحي ، يمكن اكتشاف بقع مضيئة بيولوجيا صغيرة ، تكشف عن بؤر طفيلية أقل من عتبة BLI في الجسم الحي ، كما هو موضح في الشكل 5C في نتيجة خارج الجسم الحي للفأر المعالج بواسطة Posa.
يعد تصميم تجربة تجريبية لتقييم النموذج نفسه وديناميكيات العدوى أمرا بالغ الأهمية لإنشاء تجربة دقيقة لتقييم فعالية الأدوية المضادة للطفيليات. وبالتالي ، سيكون الباحث قادرا على تحديد إعدادات BLI المناسبة ودورة وقت العدوى مسبقا. في تجربة استكشافية ، إحدى الأدوات التي يمكن أن تكون مفيدة لتحديد إعدادات الاكتساب هي "التعرض التلقائي". باستخدام هذه الأداة ، يحدد الباحث أولوية ثلاثة إعدادات (وقت التعرض ، Binning ، و F / Stop) للحصول على أفضل صورة ممكنة. على وجه الخصوص ، يجب على الباحث التأكد من الحصول على الصور ضمن النطاق الديناميكي لكاميرا CCD ، دون التشبع الفائق أو التعرض الناقص ، والذي يمكن التحقق منه من خلال الحدود الدنيا والقصوى للمقياس وميزة التعرض التلقائي ( تحرير القائمة > تفضيلات > اكتساب علامة التبويب > التعرض التلقائي لعلامة التبويب). في هذا البروتوكول ، تم ضبط فتحة الكاميرا على القيمة القصوى (F / Stop: 1) ، وتم تحديد أوقات التعرض المختلفة وعوامل التجميع للنماذج الحادة والمزمنة. توفر هذه الإعدادات إمكانية التنبؤ بالوقت لإجراء جولات صور مختلفة في وقت واحد. بالنظر إلى أن طريقة المراسل تعتمد على تفاعل إنزيمي ، فإن كلا من التوزيع الحيوي للركيزة في الفأر وحركية luciferase يؤثران على إشارة التوهج الحيوي ، وبالتالي ، القياس الكمي للعدوى (الشكل 1 ب). وبالتالي ، فإن الحصول على صور في لحظات مختلفة من الحركية الأنزيمية يقدم تباينا في البيانات لا يمكن حسابه أو تصحيحه ويؤثر على حساب التدفق الكلي (الفوتونات / الثانية) أو الإشعاع (الفوتونات / الثانية / سم2 / الاستراديان). إلى جانب ذلك ، تعرض عدوى T. cruzi وضعا مكانيا ديناميكيا في الفئران (مناطق وأنسجة مختلفة ، وعمق ، وحمل طفيلي). ومن ثم ، فإن تحديد قيمة الأعداد التي يجب الحصول عليها يمكن أن يفوت مصادر إشارة أضعف (عدد منخفض من الطفيليات في بقعة معينة أعمق في الأنسجة) إذا كان مصدر إشارة أقوى آخر يفي بمعايير التعرض التلقائي المحددة.
ميزة صعبة لبرنامج Living Image هي عرض الصورة المكتسبة بمقياس ألوان تلقائي. لا يوجد خيار لضبط المقياس مسبقا لعرض صورة تم الحصول عليها جديدة تماما تلقائيا وفقا لقيم المقياس المحددة (انظر خطوة البروتوكول 6.2). يجبر هذا الموقف الباحث على تغيير الصور يدويا واحدة تلو الأخرى إلى القيم القصوى والدنيا المختارة. نتيجة لذلك ، لا يمتلك المستخدمون غير المتمرسين وغير المدربين تدريبا جيدا القراءة المناسبة أثناء جلسة الاستحواذ ، وقد يضللون البيانات أو يفقدون معلومات مهمة في تلك المرحلة الزمنية. لذلك ، فإن التجربة التجريبية مفيدة.
أحد الأسئلة الأكثر شيوعا حول تصميم تجربة إثبات المفهوم هو كيفية اختيار مدة العلاج والجرعة. بالنسبة للكيانات الكيميائية الجديدة ، عادة ما يتم تحديد هذه المعلمات من خلال قوة المركب والانتقائية في المختبر ، بالاقتران مع البيانات الناتجة عن استقلاب الأدوية والحرائك الدوائية (DMPK) ودراسات التحمل التي أجريت قبل الاختبار في الجسم الحي للتأكد من فعاليتها. باختصار ، بعد تحديد المركبات القادرة على قتل الطفيلي بشكل انتقائي داخل الخلايا ، يتم إجراء تجارب ADME الأولى (الامتصاص والتوزيع والتمثيل الغذائي والإفراز) في المختبر لتقدير قابلية الذوبان المائي للمركبات ونفاذية الخلية والاستقرار الأيضي ، من بين معايير أخرى. إذا أظهرت المركبات توازنا جيدا للخصائص في المختبر (عادة ما يتم تحديدها في ملفات تعريف المرشحين المستهدفة) ، فإن هؤلاء المرشحين يتم تقدمهم إلى دراسات الحرائك الدوائية في الجسم الحي (PK) في الفئران السليمة ، والتي تحدد تعرض المركب في الدم (وربما في الأنسجة أيضا) وتوفر فكرة عامة عن التحمل عند مستويات جرعة مختلفة17 ، 34,43. من الناحية المثالية ، فإن الهدف من تقييم PK في معظم الأمراض المعدية هو تحديد جدوى الوصول إلى تركيزات البلازما الحرة (المصححة لربط بروتين البلازما) التي تزيد عن تركيزات EC50 / EC90 44 - التركيز الفعال الذي يقتل أو على الأقل يمنع نمو 50٪ أو 90٪ من الطفيليات ، على التوالي - لفترة طويلة بما فيه الكفاية من الزمن. إذا تم تحقيق التعرض الكافي عند مستوى جرعة معين ، فيمكن استخدام هذا النظام أثناء دراسات الفعالية باستخدام نموذج Chagas BLI. بالنسبة لدراسات إعادة وضع الدواء ، يجب أن تكون بيانات PK في المختبر وفي الجسم الحي متاحة. بداية جيدة لإعادة تنميط الأدوية هي قواعد البيانات الكيميائية مثل PubChem45 ، والتي توفر بيانات معترف بها يمكن تحويلها إلى فئران باستخدام القياس الخيفي46 لتقدير أنظمة العلاج الآمنة وغير السامة التي سيتم اختبارها. ومع ذلك ، هذا ليس هو الحال دائما. لا تزال دراسات PK مجالا مهملا في العلوم الأكاديمية ، وينشر عدد قليل من شركات الأدوية نتائج PK الخاصة بهم. يوصي مجتمع علوم اكتشاف الأدوية بتضمين تقييم PK في الجسم الحي جنبا إلى جنب مع فحوصات فعالية الدواء (الديناميكا الدوائية)47. لذلك ، يتوافق التصوير قبل السريري مع القياسات المركبة في وقت واحد ، وهذا النهج المرتبط يعزز متانة البيانات.
بالإضافة إلى ذلك ، تتم مراقبة تعامل الفئران ووزنها وظروفها الصحية طوال التجربة بأكملها. يجب تسجيل علامات السمية والآثار الجانبية مثل الحدب أو الاهتزاز أو فقدان التوازن أو عدم الرغبة في الحركة أو الإحجام عن التغذية أو الشرب أو السجود أو أي تشوهات أخرى موجودة في المجموعة أو بسبب ظروف الفئران الفردية والإبلاغ عنها في الدراسات قبل السريرية. أحد أهداف التصوير البصري هو ضمان رفاهية. وبالتالي ، يجب تطبيق نقاط النهاية الإنسانية في الفئران ذات علامات الألم الموصوفة في "مقياس التجهم48. أيضا ، تم وزن الفئران أسبوعيا أثناء اكتساب BLI ، وفي كثير من الأحيان ، أثناء جرعات الدواء والعلاج CTX. وفقا للوائح رعاية ، يجب القتل الرحيم على الفور للفئران التي تفقد أكثر من 20٪ من وزن الجسم.
نموذج T. cruzi bioluminescent هو الآن أحدث نموذج تجريبي لاكتشاف وتطوير علاجات جديدة لمرض شاغاس. نموذج يكرر السمات الرئيسية لعدوى T. cruzi ومرض شاغاس49 ، مما يسمح بمراقبة الطفيليات في الوقت الفعلي وتمايز المركبات ذات ملامح الفعالية المتنوعة المرتبطة بأنماط العمل المعروفة. BLI هي تقنية تعزز الحزم في تحديد الأنسجة المصابة. إنه يتيح الاختيار الدقيق للأنسجة المصابة لاستخدامها في مجموعة واسعة من الأساليب ، بما في ذلك جميع الطرق الكلاسيكية المطبقة بالفعل في أبحاث T. cruzi 50,51. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يسمح للباحثين باستكشاف التقنيات المتطورة وتطوير تقنيات جديدة33. بالإضافة إلى ذلك ، يوفر BLI تحسين رفاهية والاستخدام الأكثر عقلانية وفقا لمبادئ 3Rs10,35 ، كل ذلك مرة واحدة.
يتم وضع العديد من المجموعات البحثية التي تركز على أمراض المناطق المدارية المهملة في البلدان التي لا تتوفر فيها أجهزة التصوير في الجسم الحي. للتغلب على السيناريو الحالي ، تعمل الشبكات الدولية الجديدة مثل Global BioImaging والاتحادات المرتبطة بها على تعزيز الإجراءات لتوفير الوصول المفتوح إلى المرافق الأساسية للتصوير وتحسين تدريب الموظفين وعلماء التصوير52,53. يمكن لهذه المبادرات ، إلى جانب بروتوكولات المستخدم الودية مثل هذا البروتوكول ، أن توفر الظروف التي تضفي الطابع الديمقراطي على التقنيات المتطورة لجميع الباحثين. قدم تنفيذ هذه الطريقة في اكتشاف الأدوية قبل السريرية قراءات فعالية قوية وقيمة تنبؤية للنتائج السريرية مما يسهل اكتشاف الأدوية لمرض شاغاس.
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.
يشكر المؤلفون أماندا فرانسيسكو وجون كيلي وفاني إسكوديه على توفير تدريب BLI والدعم على مقايسات فعالية الأدوية ، وجون كيلي وسيمون كالديرانو لتوفير الطفيليات ، وغابرييل باديلا لدعمهم في الدراسات على. حصلت ACS على منحة CAPES PSDE للتدريب في كلية لندن للصحة والطب الاستوائي (المملكة المتحدة). يود المؤلفون أيضا أن يشكروا منصة قياس التدفق الخلوي وأبحاث التصوير (FLUIR) في المرفق الأساسي للبحث العلمي - جامعة ساو باولو (CEFAP-USP) على الدعم الفني في تحليل معدات IVIS Spectrum ، ومختبر علم الوراثة والتحكم الصحي ICB-USP لفحوصات ما بعد التجريب لمراقبة جودة الفئران باعتبارها خالية من مسببات الأمراض. تم تمويل هذا المشروع من قبل DNDi. وتعرب المؤسسة عن امتنانها لمانحيها، من القطاعين العام والخاص، الذين قدموا التمويل لجميع أنشطة المعهد منذ إنشائه في عام 2003. يمكن العثور على قائمة كاملة بالمتبرعين ل DNDi في https://dndi.org/about/donors/.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
BD LSRFortessa™ X-20 Cell Analyzer | BD Biosciences | ||
Weighing Balance (animal facility) | Available from several suppliers | ||
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Revvity (former PerkinElmer) | ||
FlowJ Software v10.7.1 | BD Biosciences | ||
Living Image Software for Spectrum v4.7.1 | Revvity (former PerkinElmer) | License Free Analysis Software called 'Aura Imaging' could be used for the most basic features provided by Spectral Instruments Imaging (Bruker company) (https://spectralinvivo.com/software/) | |
Microsoft Office software | Microsoft | ||
GraphPad Prism v8.4.0 | GraphPad Software Inc. | ||
DMEM Low Glucose | Vitrocell | D0025 | |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761-500G | |
Foetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Trypsin 0.5% EDTA | Gibco | 25300-062 | |
LIT medium | In house | ||
Hygromycin B (50 mg/mL) | Gibco | 10687010 | |
Grace′s Insect Medium | Sigma-Aldrich | G9771 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | 54457 | |
IVISBrite d-luciferin potassium salt | Revvity (former PerkinElmer) | 122799 | Also could be used: VivoGlo Luciferin, in vivo grade (Promega/P1043); D-Luciferin, Monopotassium Salt (Thermo Scientific/88293) or PierceD-Luciferin, Monosodium* Salt (Thermo Scientific/88291); D-Luciferin, Potassium Salt (GoldBio/LUCK or eLUCK); D-Luciferin, Sodium* Salt (GoldBio/LUCNA or eLUCNA) *Sodium or potassium salt differences relies minimal chances on solubility, however do not affect in vivo performance. |
DPBS | Gibco | 21600-044 | |
Cyclophosphamide (CTX) | Sigma-Aldrich | C0768-5g | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D5879 | |
(Hydroxypropyl)methyl cellulose (HPMC) | Sigma-Aldrich | 09963-25G | |
Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich | 402834 | |
Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754-1L | |
Benznidazole | ELEA | ||
Posaconazole (Noxafil commercial formulation) | Schering-Phough | ||
Giemsa | Available from several suppliers | ||
gavage needle (stainless-steel straight) - 22GA | Aton | CA2003 | |
1 mL Syringe and 31G needle | Available from several suppliers | ||
1 mL Syringe and removable 26G needle | Available from several suppliers | ||
1 mL Syringe and removable 24G X¾ needle | Available from several suppliers | ||
Sterile Syringe Filter 0.2 µm | Available from several suppliers | ||
A4 Matte Black paper 120gr or thicker | Paper Color/ Canson (Available from several suppliers) | ||
aluminum foil | Available from several suppliers | ||
Neubauer chamber | Available from several suppliers |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved