Демистификация биолюминесцентной визуализации in vivo мышиной модели мышиной болезни Шагаса для исследований эффективности лекарств

Резюме

Представленный здесь протокол подробно описывает шаги по проведению исследований эффективности препарата на биолюминесцентной модели инфекции Trypanosoma cruzi с акцентом на сбор, анализ и интерпретацию данных. Также предусмотрены процедуры устранения неполадок и контроля качества для минимизации технических проблем.

Аннотация

Для контроля и снижения воздействия на общественное здравоохранение простейших болезней человека, таких как болезнь Шагаса, лейшманиоз и африканский трипаносомоз человека, необходимо ускорить разработку новых лекарств и вакцин. Однако этот процесс сопряжен с такими трудностями, как очень сложная биология паразитов и патогенез болезней и, как это типично для забытых тропических болезней, сравнительно ограниченное финансирование исследований и разработок. Таким образом, исследовательские модели in vitro и in vivo , которые могут в достаточной степени воспроизводить ключевые особенности инфекции и заболевания, обеспечивая при этом рациональное использование ресурсов, имеют важное значение для продвижения исследований этих состояний. Одним из примеров является мышиная модель болезни Шагаса с биолюминесцентной визуализацией (BLI) in vivo , которая обеспечивает высокочувствительное обнаружение длинноволнового света, генерируемого паразитами Trypanosoma cruzi , экспрессирующими люциферазу. Несмотря на то, что этот метод стал стандартным подходом к исследованиям эффективности лекарств in vivo , исследовательские группы все еще могут испытывать трудности с его внедрением из-за отсутствия надлежащей практической подготовки по обращению с оборудованием и применению процедур контроля качества, даже когда подходящее оборудование BLI легко доступно. Учитывая этот сценарий, данный протокол направлен на руководство от планирования экспериментов к сбору и анализу данных, с деталями, которые облегчают реализацию протоколов в исследовательских группах с небольшим опытом или без опыта работы с BLI, как для болезни Шагаса, так и для других моделей инфекционных заболеваний у мышей.

Введение

Болезнь Шагаса является эндемичной болезнью в Латинской Америке и поражает около семи миллионов человек во всем^мире1. Ежегодно более 50 000 смертей и экономические потери на сумму около 7 миллиардов долларов являются результатом инвалидизирующего характера^{этой болезни.} Болезнь Шагаса вызывается простейшим Trypanosoma cruzi, гетероксеновым гемофлагеллятным паразитом, способным инфицировать млекопитающих (диких и домашних) и переносчиков триатомов (Hemiptera, Reduviidae)³ в Северной и Южной Америке, где установлена векторная передача. К другим важным путям заражения относятся переливание крови, трансплантация органов, пероральный (при употреблении пищи, зараженной инфицированным триатомином)⁴ и врожденная передача. Невекторные пути передачи способствовали распространению болезни Шагаса в неэндемичные районы ^3,5.

Болезнь Шагаса проявляется в двух клинических фазах. Острая фаза в большинстве случаев протекает бессимптомно. Симптоматические инфекции обычно связаны с неспецифическими признаками, такими как лихорадка, усталость, миалгия, лимфаденопатия, спленомегалия и гепатомегалия. Острая фаза также часто связана с явной паразитемией и системной циркуляцией паразитов. Смерть может наступить в 10% диагностированных случаев, особенно в случаях инфекции полости рта⁶. Хроническая фаза часто характеризуется длительным периодом отсутствия каких-либо симптомов. Со временем примерно у одной трети пациентов, инфицированных десятилетиями ранее, проявляются сердечные проявления, обычно сопровождающиеся фиброзом и воспалением миокарда, и/или желудочно-кишечные расстройства, в основном связанные с развитием синдромов мегаэзофагуса и/или мегаколона^.

Этиологическое лечение болезни Шагаса состоит всего из двух препаратов: бензнидазола и нифуртимокса. Эти противопаразитарные средства доступны уже более 50 лет и обладают значительной токсичностью и ограниченной эффективностью ^5,7,8. Следовательно, существует острая необходимость в разработке новых, безопасных и более эффективных методов лечения пациентов с болезнью Шагаса.

Более совершенные и точные методики позволяют получить ответы на старые вопросы, которые позволяют продвинуться в поиске новых методов лечения болезни Шагаса. В этом смысле научное сообщество получает большую пользу от генетически модифицированных паразитов для исследований in vivo течения инфекции и оценки эффективности лекарств 9,10,11,12. Лонгитюдный анализ, основанный на системе биолюминесцентной визуализации (BLI), позволяет оценить эффективность во время и после режима лечения, что приводит к идентификации соединений с трипаноцидной активностью^10,13. Метод BLI обеспечивает прямое измерение паразитарной нагрузки, как в кровотоке, так и в тканях и органах, путем количественного определения света, производимого генетически модифицированным T. cruzi CL Brener Luc::Neon lineage¹¹, который конститутивно экспрессирует люциферазу¹² с красным смещением.

Тем не менее, спустя почти 10 лет после создания исследований на животной модели BLI при болезни Шагаса и эффективности лекарств, лишь несколько исследовательских групп доминируют в этом методе. Этот факт связан не только с ограниченным доступом к надлежащему оборудованию для визуализации, но и с отсутствием обучения и наличия структурированных, подробных протоколов. Этот метод имеет ряд преимуществ по сравнению с другими подходами, которые основаны на оценке паразитемии с помощью микроскопии, серологии или оценки инфекции органов/тканей с помощью количественной ПЦР для обнаружения ДНК паразита, поскольку он позволяет улучшить самочувствие мышей и сократить использование животных за счет возможности получения более надежных и интегрированных данных in vivo. Кроме того, этот метод, возможно, более чувствителен, так как позволяет легко обнаруживать паразитарные очаги в висцеральных органах после медикаментозного лечения^10,12. Таким образом, данный протокол призван помочь исследовательским группам по паразитологии и другим инфекционным заболеваниям внедрить эту методологию в своих лабораториях путем детализации технических процедур. В этой статье мы делимся опытом, полученным в ходе внедрения модели BLI болезни Шагаса в Бразилии, первой в своем роде в Латинской Америке, в рамках усилий по разработке лекарств, координируемых инициативой «Лекарства от забытых болезней» (DNDi).

протокол

Все процедуры, описанные в этом протоколе, были представлены, одобрены и проведены в соответствии с руководящими принципами¹⁴ , разработанными Комитетом по этике животных Instituto de Ciências Biomédicas в Университете Сан-Паулу: протокол CEUA ICB/USP no 5787250522.

1. Решения

ПРИМЕЧАНИЕ: Учитывайте предварительно вводимый объем 10 мл/кг (200 мкл для мыши весом 20 г)^15,16. Например, приготовьте рабочий раствор в концентрации 15 мг/мл для получения 150 мг/кг дозы для животных.

1. Суспензионный носитель гидроксипропилметилцеллюлозы (ГПМЦ-СВ)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Требуемые реагенты: 0,5% (v/v) гидроксипропилметилцеллюлозы (HPMC), 0,4% (v/v) Tween 80 и 0,5% (v/v) бензиловый спирт.
   1. На 200 мл автомобильного раствора взвесить 1 г ГПМЦ и растворить в 64 мл горячей сверхчистой воды. Помешивайте 2 мин.
   2. Добавьте 120 мл ледяной сверхчистой воды и перемешивайте в течение 1 часа. Добавьте 1 мл бензилового спирта.
   3. Затем добавьте 0,8 мл Tween 80 методом обратного пипетирования и продолжайте помешивать, пока раствор не станет прозрачным.
   4. Отрегулируйте раствор на итоговый объем 200 мл. Храните HPMC-SV в холодильнике (4 °C) не более 3 месяцев.
2. Бензнидазол
   1. Рассчитайте необходимое количество сложного раствора, следующим образом:
      Объем раствора соединения = (количество доз в каждый день x количество дней x количество мышей, подлежащих лечению x объем ввода каждой мыши) + 30% дополнительно.
   2. Взвесьте необходимое количество бензнидазола (БЗ), учитывая желаемую дозу. Для лечебного лечения пероральная доза 100 мг/кг один раз в сутки в течение 10 дней обеспечивает 100% излечение при хронической модели^{БК 17}.
   3. Учитывая желаемый конечный объем, рассчитайте правильное количество, чтобы достичь концентрации 5% (v/v) ДМСО и полностью растворить BZ в чистом ДМСО.
   4. Добавьте нужный объем автомобиля в стеклянную трубку, чтобы достичь концентрации 95% (v/v) HPMC-SV. Перенесите растворенный в ДМСО BZ в стеклянную трубку, содержащую ГПМЦ-СВ. Энергично гомогенизируйте суспензию и храните ее при температуре 4 °C.
      Например: Конечный объем рецептуры BZ = 10 мл (шаг 1.2.1)
      Количество BZ = 100 мг (шаг 1.2.2)
      5% ДМСО = 0,5 мл (шаг 1.2.3) и 95% ГПМЦ-SV = 9,5 мл (шаг 1.2.4)
   5. Перед каждым введением препарата препараты помещают на ультразвуковую водяную баню на 5 мин при температуре 37 °C и энергично гомогенизируют перед введением препарата животным.
3. Циклофосфамид
   1. Растворите необходимое количество циклофосфамида в ультрачистой воде для получения раствора 12,5 мг/мл.
   2. Стерилизуйте раствор фильтрацией и храните при температуре 4 °C.
4. Морилка Giemsa
   1. Растворите 0,6 мг порошкового реагента Гимза в 50 мл метанола. Добавьте 25 мл глицерина и перемешайте. Удалите осадки с помощью фильтровальной бумаги и воронки. Храните стоковый раствор при комнатной температуре (RT), защищенном от света месте.
   2. Приготовьте рабочий раствор, разведя 10 мл раствора Гимзы в 90 мл Mix-Phosphate Buffer (20,5 М Na₂HPO₄, 65,4 М KH₂PO₄ при pH 7,2).

2. Культура Trypanosoma cruzi

1. Работая в шкафу биологической безопасности (BSC), культивируйте 4 x 10⁶ эпимастигот/мл T. cruzi CL Brener Luc::Neon¹¹ в средах LIT (68,44 мМ NaCl, 5,36 мМ KCl, 112,7 мМ Na₂HPO₄, 5 г/л триптона, 5 г/л печеночного бульона, 0,03 М гемина, 4,16 мМ глюкозы), с добавлением 10% (v/v) фетальной сыворотки крупного рогатого скота (FBS), 100 мкг/мл пенициллина, 100 ЕД/мл стрептомицина и 150 мкг/мл гигромицина в качестве селективного препарата при 28 °С. Паразиты обычно достигают стационарной фазы за 3-4 дня.
2. Индуцировать метациклогенез для получения инфекционных паразитов путем инкубации 3 x 10⁸ эпимастигот в 10 мл среды Grace's Insect с 10% (v/v) FBS в конических пробирках объемом 15 мл при 28 °C в течение 7-10 дней.
3. Оцените скорость дифференцировки по мазкам, окрашивающим по Гимзе. Для этого распределите 20 μL дифференцированных паразитов на предметном стекле и дайте высохнуть в течение 10 минут.
4. В вытяжном шкафу приступайте к фиксации образца, накрыв предметное стекло чистым метанолом, и дайте полностью высохнуть (1-2 минуты). Накройте предметное стекло рабочим раствором Giemsa на 20 минут.
5. Аккуратно промойте предметное стекло дистиллированной водой. В микроскоп посчитайте процентное содержание метациклических трипомастигот. Если достигнут коэффициент дифференцировки не менее 10 процентов, переходите к следующему шагу.
6. Центрифугируйте паразитов (120 х г в течение 10 минут) и повторно суспендируйте гранулу 10 мл DPBS. Центрифугируйте еще раз и повторно суспендируйте паразитов в 5 мл DMEM с добавлением 10% (v/v) FBS, 100 мкг/мл пенициллина и 100 ЕД/мл стрептомицина.
7. В колбе для культур размером 25 см² проводят инфекцию 1,66 x 10⁵ клеток LLC-MK2 (эпителиальные клетки почек от Macaca mulatta) при 37 °C в 5% CO2, в увлажненном инкубаторе¹⁸.
8. Тканевые культуральные трипомастиготы (ТКТ) высвобождаются в среду через 8-9 дней. Заражайте свежие монослои клеток LLC-MK2 ТХТ при кратности инфекции (MOI) 1:40.

3. Анализ однородности популяции Trypanosoma cruzi с помощью проточного цитометра

1. Соберите ТХТ штаммов CL Brener Luc::Neon и CL Brener дикого типа, центрифугируйте при 120 x g в течение 10 минут и повторно суспендируйте ТХТ в DPBS. Отрегулируйте плотность паразитов до 1 x 10⁶/мл.
2. Продолжайте популяционный анализ с помощью проточного цитометра на основе флуоресценции mNeonGreen (например, 506/em. 517 нм)¹⁹, получая не менее 20 000 событий для каждого образца.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Процент флуоресцентной популяции получен путем сравнения дикого типа с трансфицированным паразитом. Для продолжения инфекции у мышей необходимо достичь минимум 95% популяции флуоресцентных паразитов линии CL Brener Luc::Neon (дополнительный рисунок 1).

4. Экспериментальное заражение мышей

Примечание: Для увеличения количества паразитов трипомастиготы (БТ) в кровотоке часто получают от мышей с иммунодефицитом^10,13. Здесь для получения БТ используется химическая иммуносупрессия мышей BALB/C. Для этого достигается легкая иммуносупрессия с помощью четырех внутрибрюшинных инъекций циклофосфамида (CTX) в дозе 62,5 мг/кг с интервалом 96 часов, которые выполняются одновременно с инфекцией T. cruzi.

1. Вводите 62,5 мг/кг стерильного циклофосфамида путем внутрибрюшинной инъекции (в/в) за 1 день до инфекции T. cruzi .
2. Заразите каждую мышь 1 x 10⁴ TCT в 0,2 мл DPBS через внутрибрюшинный путь. Внимание к высокому риску происшествий при работе с патогенами и иглами. Выполняйте инфекцию в BSC, надев перчатки и лицевой щиток на протяжении всей процедуры.
3. Ежедневно контролируйте паразитемию путем непосредственного наблюдения за БТ в крови (метод Пицци-Бренера)²⁰. На пике паразитемии, примерно через 13-17 дней после заражения (dpi), проведите забор крови. Для этого обезболивайте мышей 100 мг/кг кетамина и 10 мг/кг ксилазина.
4. Когда мыши полностью обезболены²¹, следует провести пункцию сердца с помощью шприца объемом 1 мл, прикрепленного к игле 24 G X3/4, содержащей 50 мкл 3,8% (w/v) цитрата натрия. Отключите иглу от сети и аккуратно поместите кровь в центрифужную пробирку.
5. В БСК проводят разведение аликвоты крови в буфере для лизиса аммония-хлорида-калия (ACK) и подсчитывают количество паразитов в камере Нейбауэра. Повторите эту процедуру не менее двух раз, так как небольшие сгустки крови влияют на подсчет паразитов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы предотвратить ошибки подсчета, отрегулируйте коэффициент разбавления таким образом, чтобы избежать количества трипомастигот ниже 30 и выше 300 в камере Нейбауэра.
6. Отрегулируйте плотность паразитов до 5 х 10³ Бт/мл, смешав необходимое количество чистой крови в DPBS.
7. Инфицируйте мышей без иммуносупрессии BALB/c 1 x 10³ BT в 0,2 мл DPBS на мышь (5 x 10³ BT/мл) внутрибрюшинным путем с помощью иглы 26 G (более узкие иглы приводят к лизису паразита)²². После введения объема внутрибрюшинно удерживайте иглу внутри мыши в течение 5 с, чтобы избежать обратного потока.
8. Временно поместите инфицированных мышей в коробку с бумажным полотенцем, чтобы определить потенциальную утечку или кровотечение, а затем верните мышей в клетки.

5. Визуализация in vivo

ПРИМЕЧАНИЕ: Глоссарий используемых здесь терминов выглядит следующим образом:

Сеанс визуализации: Биолюминесцентный сбор данных, проводимый во всех группах определенного эксперимента в определенный день. На рисунке 1А показан обзор процедуры.

Раунд визуализации: процедура, выполняемая в подгруппах из трех мышей, от инъекции D-люциферина до восстановления после анестезии. Рекомендуется, чтобы каждая экспериментальная группа содержала 6 мышей из-за присущей мышам изменчивости паразитарной нагрузки и других факторов, влияющих на количественное определение BLI, описанное ниже.

Получение изображений: фотосессия, выполняемая с помощью оборудования для обработки изображений для количественной оценки биолюминесценции, в результате которой изображение накладывается на фотографию, а количественная биолюминесценция отображается в виде псевдоцветовой шкалы.

Процедура визуализации: Все этапы обсуждаются на этом сеансе протокола.

Рисунок 1: Получение данных BLI. (A) Диаграмма рабочего процесса сбора данных, применяемого для исследований инфекционных заболеваний, на примере модели биолюминесцентной мыши болезни Шагаса. Мышей, инфицированных генетически модифицированным T. cruzi , анализируют с помощью визуализации in vivo на установленных временных точках. На каждом раунде визуализации группам до трех мышей вводят 150 мг/кг фермента-субстрата (D-люциферина). Через 5 мин вводят анестезию в дозе 2,5% (v/v) изофлурана в кислороде. Когда мыши полностью неподвижны, их помещают в систему визуализации, и сбор данных начинается в соответствии с определенными настройками. После визуализации мыши восстанавливаются после анестезии и возвращаются в клетки. Частые вопросы и проблемы, с которыми исследователи могут столкнуться во время сбора данных, выделены красным цветом. Эта схема была модифицирована из Lewis et al. (2014)¹² (создано с BioRender.com: UD26KWEVS2). (B) Кинетика in vivo D-люциферина/люциферазы светлячков с красным смещением (PpyRE9h). Мышам на пике паразитемии T. cruzi (n = 3) делали анестезию и вводили 150 мг/кг D-люциферина. Изображения были получены в течение 1 ч (время экспозиции: 2 мин; биннинг: 4). Вверху: количественное определение вентрального общего потока (p/s) (левая ось Y, красным цветом) и в процентах от наибольшего среднего измерения (правая ось Y, синим цветом). Данные отображаются в виде среднего значения (кривые) и стандартного отклонения (затененная область). Внизу: получены изображения первой (4 мин), самой высокой точки сигнала BLI (30 мин) и последней (62 мин) точки времени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

1. Проверьте зеленую полосу в окне Acquisition (Сбор данных ), чтобы убедиться, что камера с зарядовой связью (CCD) холодная (-90 °C). Нажмите на полосу (зеленую или красную), чтобы визуализировать температуру.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Согласно руководству по оборудованию для обработки изображений, оборудование для обработки изображений и программное обеспечение должны быть постоянно включены, чтобы ПЗС-матрица оставалась холодной.
2. Проверьте, была ли выполнена автоматическая настройка фона. Для этого нажмите « Приобретение > фон» > просмотреть доступный Dark Charge. Появится список с несколькими комбинациями настроек.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура снижает люминесцентный шум. Если выбранная конфигурация приводит к значению выше 1000, исходя из формулы «время воздействия x (биннинг²)», то темновой заряд не следует игнорировать. В зависимости от конфигурации программного обеспечения биннинг может быть показан в виде числа (коэффициент биннинга) или в диапазоне от «маленького» до «большого». Соответствие между диапазоном и коэффициентом биннинга можно найти в руководстве к устройству.
3. Если окно активности (белая область в нижней части программного обеспечения) не отображается, включите его в меню «Просмотр» > окне «Активность».
4. Установите область изображения, щелкнув окно сбора данных > поле зрения. Вариант C (13,2 см) позволяет получить 3 мыши, а вариант D (22 см) — 5 мышей.
5. Выберите опцию автосохранения, нажав « Получение» > «Автосохранение », и выберите или создайте новую папку для каждой временной точки.
6. Постелите матовую черную бумагу на область визуализации и разместите перегородочные стекла перпендикулярно между входными отверстиями. Если производитель не предусмотрел слайды, используйте кусочки (3 см х 15 см) матовой черной бумаги.
7. Отрегулируйте внутреннюю площадь камеры визуализации, чтобы стеклянные носовые конусы были прикреплены к входным отверстиям для анестезии. С помощью небольших кусочков черной изоленты прикрепите анестезиологическую систему к платформе (за пределами области изображения).
   ПРИМЕЧАНИЕ: В некоторых версиях устройств визуализации область визуализации определяется лазером. Если этот инструмент недоступен, получите изображения с помощью программного обеспечения, чтобы проверить слайды разбиения в области изображения.
8. Установите испаритель изофлурана на 2,5% (v/v) в кислороде для камер визуализации и индукции. Проверьте по манометру, протекает ли газ через систему²¹.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если к устройству визуализации не подключена система ингаляционной анестезии, возможны другие варианты анестезии, такие как инъекционный ксилазин и кетамин²³. В этом случае восстановление мышей происходит медленно, а риск летального исхода высок²⁴.
9. Наполните шприцы (иглы 31 г) D-люциферином (подробный протокол приготовления D-люциферина предоставляется различными поставщиками)^25,26, защитите их от прямого света и подготовьте несколько пластиковых контейнеров или дополнительных клеток, накрыв внутреннюю часть бумажным полотенцем.
10. Держите рядом часы, чтобы легко отслеживать время, и лабораторный блокнот, чтобы регистрировать группы мышей, время инъекции люциферина и любую другую информацию во время процедуры.
11. Взвесьте всех мышей и зарегистрируйте их вес. Отметьте каждую мышь маркером или татуировкой на хвосте. Следите за тем, чтобы идентификация мышей хорошо отображалась в течение всего эксперимента. Этот шаг также может быть выполнен за день до приобретения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Метка не должна занимать большую площадь тела, так как чернила могут мешать биолюминесцентному сигналу. Перманентные маркеры разных цветов также могут помочь дифференцировать группы.
12. Чтобы начать сеанс визуализации, зарегистрируйте фоновое люминесцентное изображение (настройки: Время экспозиции: 5 мин; Биннинг: 'большой' или '16', f/stop: 1) камеры визуализации без мышей. Эта процедура помогает выявить автолюминесцентные источники света или нежелательные проблемы на оборудовании.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку BLI основан на ферментативной реакции, время является существенной характеристикой эксперимента. Перед началом работы с животными проверьте все перечисленные выше элементы и настройки оборудования.
13. Вводите 150 мг/кг (в/в) D-люциферина первым 3 мышам, не достигая внутренних органов. Поместите мышей в контейнерную коробку, чтобы оценить, не протекает ли D-люциферин (ярко-желтый раствор). Делайте заметки, если это происходит, и регистрируйте группу мышей и время инъекции D-люциферина.
14. Подождите 5 минут, затем перенесите мышей в индукционную камеру для анестезии. Включите систему. Для полного обезболивания мышей требуется около 3 минут (отсутствие таких реакций, как тряска ногами, хвостом и т. д.) ²¹.
15. Откройте дверцу аппарата визуализации, включите поток анестетика в камеру визуализации и, одновременно, выключите индукционную камеру.
16. Расположите каждую мышь в положении носовых конусов: от мыши 1-3, слева направо. Аккуратно поместите мышей вентральной стороной вверх внутрь области визуализации, показанной лазером. Во время размещения проверьте идентификацию и положение мышей. Не стоит форсировать вход мышей, частично обезболенных в носовых конусах.
17. Поместите предметные стекла между мышами и закройте дверцу оборудования для визуализации.
18. Настройте параметры сбора данных в окне сбора данных программного обеспечения следующим образом:
    1. Для неинфицированных мышей время воздействия = 5 минут / Binning = «большой» или «16»
       (наиболее математически чувствительный набор конфигураций для установки пороговых значений).
    2. Для инфицированных мышей в острой модели: время воздействия = 2 мин / Биннинг = «средний» или «4».
    3. Для инфицированных мышей в хронической модели: Время воздействия = 5 мин / Биннинг = «большой» или «16».
19. Убедитесь, что инъекция D-люциферина была выполнена по крайней мере за 10 минут до начала забора. Если нет, подождите необходимый период для получения изображений во время пика сигнала люциферазы (рисунок 1В); в противном случае нажмите « Получить », чтобы начать получение изображения.
20. Окно Метки изображений появится после начала создания образа. Заполните поля соответствующей информацией о каждой группе, включая время инъекции люциферина, эксперимент, идентификацию мышей, временную точку и любую другую желаемую информацию, которая может помочь в ведении учета. Эта информация будет включена в файл таблицы измерений.
21. Проверьте, отображается ли предупреждающий знак «Насыщенное изображение » в конце получения изображения. Насыщенные изображения не приемлемы. Если это произошло, уменьшите биннинг и получите новое изображение. Делайте заметки, которые следует учитывать при анализе.
22. Как только изображение будет получено, откройте дверцу аппарата для визуализации и поверните мышей в положение спины (обратной стороной вверх). Выполните сбор данных еще раз и пометьте его соответствующей маркировкой.
23. По окончании получения изображений выключите поток анестетика. Аккуратно извлеките мышей из камеры визуализации и поместите их в контейнер.
24. Записывайте вес тела мыши, наблюдая за восстановлением после анестезии. Записывайте любые отклонения от нормы поведения или тела, обнаруженные во время процедуры. Как только мыши вернутся к движению, поместите их в клетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте интенсивность BLI для каждого полученного изображения. После завершения съемки записанное биолюминесцентное изображение и фотография будут отображаться в программном обеспечении с автоматической шкалой, которую не следует учитывать. Установите масштаб, определенный в анализе данных (описанном ниже) в окне Палитра инструментов .

6. Анализ данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Вышеуказанный протокол основан на коммерческом программном обеспечении для визуализации in vivo . Тем не менее, версия программного обеспечения без лицензии может выполнять самый базовый анализ. Подробную информацию о программном обеспечении можно найти в Таблице материалов.

1. Откройте файлы.
   1. Откройте папку, содержащую полученные данные за определенный момент времени съемки, выбрав меню «Файл» > браузера > «Выберите папку» (Рисунок 2A - Шаг 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Откроется новое окно в формате таблицы со всеми полученными данными, сохраненными в выбранном файле. Он будет отображать знак «Номер клика », который представляет собой идентификатор изображения, автоматически предоставленный программным обеспечением (данные и номера часов), информацию, предоставленную исследователем в окне «Метки изображений » во время сбора, и настройки сбора. Все эти данные помогают отсортировать изображения, которые могут быть использованы в анализе, учитывая, что насыщенные изображения использовать нельзя.
   2. Выберите несколько строк, связанных с выбранными изображениями, включая незараженные элементы управления. Запишите идентификатор изображения в лабораторный блокнот вместе с информацией, зарегистрированной во время сеанса визуализации.
   3. Соберите выбранные изображения, нажав на кнопку «Загрузить как группу». Эта процедура создает новое изображение последовательности. Таким образом, есть возможность настроить функции для всех изображений одновременно. Сохраните новое изображение последовательности в новой папке, отличной от той, которая использовалась на шаге 6.1, чтобы облегчить повторный анализ необработанных данных, если это необходимо.
   4. На изображении последовательности определите биннинг, используемый для каждого изображения, нажав « Параметры» > «Отображение» > «Выбрать коэффициент биннинга » (Рисунок 2A - Шаг 2). Полученный коэффициент биннинга будет отображаться в верхней части каждого изображения в последовательности.
   5. Исправьте все коэффициенты биннинга на одно и то же число. Для этого дважды кликните по изображению, которое нужно настроить. В окне «Палитра инструментов» > разделе «Настройка изображения» выберите подходящий коэффициент биннинга (Рисунок 2A - Шаг 3) - см. шаг 5.18 для выбора коэффициента биннинга. Выполняйте эту процедуру на всех расходящихся изображениях.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура непосредственно влияет на количественную оценку BLI (Таблица 1) и более подробно рассматривается в разделе «Обсуждение».
2. Установите масштаб.
   1. Различайте действительный биолюминесцентный сигнал (более 600 отсчетов согласно инструкции к прибору) на основе незараженного контроля. Для этого дважды кликните по изображению незараженных мышей. Затем в левом верхнем углу нового окна выберите опцию «Подсчеты » в поле «Единицы измерения ». Затем отрегулируйте Цветовую шкалу для минимального значения 600. Полученное изображение будет базовой линией для установки минимального масштаба в сиянии.
   2. При активном окне последовательности выберите опцию Сияние в поле Единицы измерения . Настройте цветовую шкалу и таблицу цветов в палитре инструментов. Для этого отключите поле «Индивидуальный » в области «Пределы цветовой шкалы ».
   3. Отметьте галочками Логарифмическая шкала и Вручную (Рисунок 2А - Шаг 4). Установите минимальные значения шкалы в соответствии с незараженным контролем (как показано на шаге 6.8) и область с самым высоким сигналом в качестве максимальной (как показано на рисунке 2А стрелками).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Измерение 2D света in vivo является относительным количественным измерением. Различные значения шкалы могут быть найдены из-за различий в версии и калибровке каждого устройства. Таким образом, значения, продемонстрированные в репрезентативных результатах, не могут соответствовать другим экспериментам, проведенным на других устройствах, и все же быть одинаково действительными в соответствии с данными внутреннего контроля (неинфицированные и инфицированные, не лечащиеся).
   4. Установив одинаковый масштаб для всех изображений, дважды щелкните по каждому изображению, разверните окно и экспортируйте изображение в формате изображения (.jpg, .tiff и т. д.) с помощью кнопки «Экспортировать графику », называя файлы по treatment_miceID_time точкам. (Рисунок 2А - Шаг 5). Выполните эту процедуру для всех изображений.
3. Выполните измерения.
   1. Выберите любое изображение из последовательности и дважды кликните по нему. В окне «Палитра инструментов » > разделе инструментов ROI нажмите на кнопку «Квадрат » (Рисунок 2B - Шаг 1) и нарисуйте прямоугольник, охватывающий всю мышь.
   2. Нажмите на границу созданного ROI и скопируйте и вставьте одинаковый ROI для каждой мыши (в результате получается три ROI на изображении). Сохраните ROI, нажав кнопку « Сохранить» в разделе «Инструменты ROI». Примените сохраненные ROI для всех изображений, установив флажок «Применить к последовательности», затем нажмите « Загрузить». Сохраненные ROI будут использоваться для всех мышей во всем эксперименте.
   3. Отрегулируйте положение ROI на каждой мыши, чтобы животное лучше подходило в области измерения. Когда все мыши помечены, нажмите кнопку «Измерить ROI» (Рисунок 2B - Шаг 2). Появится таблица измерений ROI . Выберите типы измерений: Сияние; Атрибуты изображения: все возможные значения; ROI Размеры: см. Затем нажмите кнопку «Выбрать все », а затем кнопку «Копировать ».
   4. Вставьте данные непосредственно в программное обеспечение для анализа таблиц (электронную таблицу). Вы также можете экспортировать файл в формате .csv или .txt.
4. Работа над данными.
   1. В программном обеспечении для анализа таблиц организуйте данные по группам (лечение, контроль неинфицированных, нелеченных и т. д.).
   2. Паразитарная нагрузка проявляется в виде биолюминесценции всего тела. Таким образом, расположите данные так, чтобы они соответствовали значениям вентрального и дорсального общего потока у одних и тех же мышей, и суммируйте их.
   3. Рассчитайте среднее значение и стандартное отклонение суммированных значений с учетом каждой группы (например, Дополнительная таблица 1). Отображайте данные в графическом и статистическом программном обеспечении.
   4. Подготовьте панель с биолюминесцентными изображениями в программном обеспечении для презентации изображений или слайдов. Поместите каждую мышь в столбец и каждую временную точку в строку, чтобы построить матрицу эффективности лекарства, которая упростит визуализацию и интерпретацию данных.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Существует возможность встраивания изображений непосредственно в программное обеспечение для работы с изображениями без выполнения шага 6.2.4 (Просмотр > окне компоновки изображений). Однако программный интерфейс и инструменты ограничивают организацию данных.

Рисунок 2: Этапы анализа данных от установки масштаба изображения до количественной оценки люминесценции. (A) Вид программного обеспечения Living Image для обработки данных изображений. Шаг 1: Загрузите полученные данные в виде последовательности с помощью инструмента «Браузер». Шаг 2: Определите группировку, используемую для каждого приобретения (она будет отображаться поверх отдельных изображений). Шаг 3: Установите для всех изображений инфицированных мышей один и тот же фактор биннинга 16 для неинфицированных мышей. Шаг 4: Установите цветовую шкалу вручную исходя из неинфицированных мышей (фиолетовая стрелка), которые должны быть видны на экране как небиолюминесцентные, и инфицированных и необработанных мышей в самых высоких биолюминесцентных очагах (красная стрелка), которые должны быть видны красным. Шаг 5: Чтобы получить изображение без какой-либо письменной информации, дважды щелкните по каждому изображению и экспортируйте изображение с помощью кнопки «Экспорт графики ». (b) Представление инструментов для определения областей интереса (ROI). Шаг 1: Нарисуйте ROI, полностью охватывающий мышь, и скопируйте и вставьте один и тот же ROI для каждого животного. Сохраните скорректированные ROI и примените их ко всем изображениям в эксперименте. Шаг 2: Нажмите кнопку «Измерить ROI», чтобы создать таблицу для экспорта как .csv или .txt. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

7. Процедура ex vivo

1. Введите мышке 150 мг/кг D-люциферина в/(один раз на раунд ex vivo ) и подождите 3 минуты. Обезболите мышей с помощью 100 мг/кг кетамина и 10 мг/кг ксилазина внутримышечного в/.
2. В шкафу биологической безопасности, когда мышь совершенно не реагирует на защемление лап, разрежьте кожу мыши, чтобы обнажить брюшину (не открывая брюшинную полость) и ткани левой подмышечной впадины. Приступайте к обескровливанию, разрезая подмышечную артерию и сосуд.
3. Соберите кровь с помощью одноразовой пастеровской пипетки. Затем перфузируйте 10 мл 0,3 мг/мл D-люциферина в растворе DPBS через левый желудочек сердца.
4. Выложите выбранные органы на заранее установленные места на чашке Петри и замочите их в растворе d-люциферина 0,3 мг/мл. Эта процедура должна быть выполнена в течение максимум 30 минут.
5. Получите люминесцентное изображение иссеченных органов (сердца, легких, тимуса, печени, четырехглавой мышцы, брыжейки, селезенки, почек, надпочечников, висцерального жира, пищевода, желудка, тонкой кишки, слепой кишки, толстой кишки, толстой кишки, головного мозга, подкожного жира, матки, гонадного жира, мочевого пузыря и перитонеальной оболочки) с использованием 5-минутного времени воздействия и биннинга 16, в зависимости от интенсивности сигнала (насыщенные изображения не принимаются)²².
   ПРИМЕЧАНИЕ: Та же процедура должна быть выполнена на неинфицированных мышах до того, как зараженные мыши установят пороговое значение.

Результаты

Используя адекватную мышиную модель, основанную на трансгенных паразитах, которые конститутивно экспрессируют люциферазу, можно воспроизвести ключевые особенности инфекции T. cruzi человека, причиняя минимальный вред хозяину, что позволяет отслеживать паразитов в режиме реального времени по БЛЖ всего тела хозяина в продольном (пожизненном) масштабе до нескольких месяцев¹².

На рисунке 3 показан пилотный эксперимент, демонстрирующий временной ход CL Brener Luc::Neon Infection от 1-го дня после заражения до 150 dpi у мышей BALB/c. В первые 20 dpi предполагаемая биолюминесцентная нагрузка паразитов увеличивается, что типично для пика паразитемии, за которым следует резкое снижение паразитарной нагрузки из-за иммунного контроля мышей. Таким образом, острой фазой инфекции считаются первые 50 dpi. Хроническая фаза определяется, когда инфекция достигает постоянной биолюминесцентной скорости, от 100-150 dpi.

Рисунок 3: Понимание модели. Кинетика Trypanosoma cruzi CL Brener Luc::Неоновая инфекция у мышей BALB/c (n = 11). Верхняя панель: вентральные и дорсальные биолюминесцентные изображения из разных временных точек в течение 150 дней после инфицирования (DPI) с 1 x 10³ трипомастиготами кровотока путем внутрибрюшинного введения. Шкала тепловой карты (в Log₁₀) биолюминесцентного сигнала в сиянии (/с/см²/ср). Цветовой код: Фиолетовый = 5 x 10³; красный = 1 x 10⁷. Нижняя панель: количественное определение биолюминесцентного сигнала в общем потоке (p/s) мышей, работающих по всему телу. Данные выражаются в виде средних значений (линий) и стандартных отклонений (заштрихованных областей). Периоды, определенные для острой и хронической фаз инфекции в этой мышиной модели, выделены оранжевым цветом. Средние значения люминесценции у неинфицированных мышей (n = 3) показаны в виде порога (светло-серая линия). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Терапевтические результаты также можно предсказать, поскольку основные фазы инфекции хорошо воспроизводятся в мышиной модели. Таким образом, BLI в настоящее время применяется в трансляционной науке посредством экспериментальных исследований, которые помогают принимать решения о потенциале эффективности соединений и продвижении в процессе разработки^10,27. В острой мышиной модели пероральное лечение следует начинать, когда инфекция достигает пика паразитемии (около 14-21 dpi), характеризующегося высоким количеством трипомастигот в кровотоке (примерно 1 x 10⁵ трипомастигот/мл - данные не показаны) и системной инфекцией. В хронической фазе лечение мышей начинается при давлении 100 dpi, когда паразитарная нагрузка сравнительно намного ниже, со стабильной субпатентной паразитемией.

Чтобы продемонстрировать применение описанного выше протокола при оценке противопаразитарных средств, мы сравнили эффективность лечения бензнидазолом (BZ), стандартным препаратом, используемым для лечения болезни Шагаса, и посаконазолом (Posa), ингибитором стерол-14α-деметилазы (CYP51), который не прошел клинические испытания при болезни Шагаса, и который также показал свою неэффективность в качестве противопаразитарного средства против T. cruzi in vitro и in vivo, в том числе в модели LI, описанной в настоящем протоколе 13,18,28,29,30.

Для модели острого состояния мышей когорты из 6 мышей в группе получали перорально gavage³¹ в течение 20 дней с Posa в дозе 20 мг/кг или BZ в дозе 100 мг/кг, один раз в день. Мышей также обрабатывали BZ в течение 5 дней в дозе 100 мг/кг один раз в день для оценки эффекта короткого лечения. После элиминации соединения (через 10 дней после окончания лечения) у BLI-отрицательных мышей наблюдалась иммуносупрессия, состояние, которое способствует рецидиву инфекции, когда паразитологическое излечение не достигается (рис. 4A). Лечение Позой привело к снижению на 99,49% ± 0,27% (среднее ± стандартным отклонением) предполагаемой биолюминесцентной нагрузки на паразитов в конце лечения и оставалось на тех же уровнях у неинфицированных мышей в течение периода элиминации лекарственного соединения (за исключением мыши #3 с переходным сигналом на 40 точек на дюйм и мыши #2, которая продемонстрировала слабое пятно BLI на уровне 44 точек на дюйм). По сравнению с группой, не получавшей лечения, обработка BZ в течение 20 дней снижала на 100% ± 0,01% предполагаемую биолюминесцентную нагрузку на паразитов в конце лечения. Напротив, короткое лечение BZ в течение 5 дней привело к снижению на 99,98% ± 0,03% при 19 dpi (аналогично пороговому уровню). Однако в этом случае снижение BLI было временным, и в последующих приобретениях у всех мышей наблюдалась реактивация инфекции (рисунок 4B).

Рисунок 4: Экспериментальный дизайн эксперимента и результаты, полученные с помощью биолюминесцентной визуализации на модели острой болезни Шагаса. (A) Схематическая диаграмма процесса на временной шкале в мышиной модели острой болезни Шагаса для доклинических исследований для оценки эффективности соединения. Черные точки: временные точки изображения. Аптечка и апельсиновый батончик: начало и конец лечения соответственно. Значок шприца: инъекции циклофосфамида. DPI: На следующий день после заражения. Цветовой код: серый = нелеченная инфекция; оранжевый = период лечения; синий = фаза выведения соединения; желтый = период иммуносупрессии. (B) Сроки лечения Trypanosoma cruzi. Левая панель: вентральные биолюминесцентные изображения мышей BALB/c (i) без лечения или лечения в течение 20 дней (ii) посаконазолом (Posa) в дозе 20 мг/кг, (iii) бензнидазолом (BZ) в дозе 100 мг/кг в течение 20 дней и (iv) BZ в дозе 100 мг/кг в течение 5 дней (n = 6/группа). Все процедуры проводились перорально через зонд (10 мл/кг) один раз в сутки. Тепловая карта по шкале_{Log 10} показывает интенсивность биолюминесцентного сигнала от низкого уровня (синий) до высокого (красный). Правый график: количественная оценка данных биолюминесцентной визуализации всего тела. Данные выражаются в виде средних значений (линий) и стандартных отклонений (заштрихованных областей). Обозначения: Флакон с лекарствами: начало лечения (14 dpi); оранжевая полоса: конец обработки (18 точек на дюйм / 33 точки на дюйм); шприц для инъекций циклофосфамида (с 44-53 дня); оранжевая точка: мышь, проанализированная с помощью процедуры ex vivo ; § данные исключены в связи с утечкой D-люциферина с мочой. (C) Процедура ex vivo для обнаружения очагов T. cruzi в органах и тканях. Ключ распределения пластин представлен в нижней части рисунка (создается с помощью BioRender.com: ZY26LG8AOF). Та же шкала сияния, что и на панели vivo . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

В этой модели противопаразитарная обработка может снизить паразитарную нагрузку ниже предела обнаружения BLI в 1000 паразитов. Таким образом, мыши проявляются как BLI отрицательный¹⁰. Для того, чтобы обеспечить достижение паразитологического излечения, необходимо стимулировать иммуносупрессию мышей с помощью лечения циклофосфамидом^29,32. Мыши, у которых после лечения препаратом все еще сохраняется неопределяемая паразитарная нагрузка, становятся BLI-положительными после иммуносупрессии. Этот эффект более широко проявляется при лечении Позой в острой модели, которое способствует рецидиву паразита. В этом эксперименте процедура ex vivo была выполнена на мышах с самым низким биолюминесцентным сигналом для оценки тропизма тканей паразита (рис. 4C). У необработанных мышей наблюдаются сильные биолюминесцентные сигналы, особенно в желудочно-кишечном тракте (TGI) и связанных с ним тканях, таких как висцеральный жир и брыжейка. Кроме того, кожа была участком, связанным с персистенцией паразитов. У мышей, получавших Posa, наблюдались биолюминесцентные пятна более низкой интенсивности, которые были более ограничены толстой кишкой, брыжейкой и висцеральным жиром. С другой стороны, у мышей, получавших лечебную схему лечения в виде BZ 100 мг/кг в течение 20 дней, биолюминесцентный сигнал не обнаруживается даже при иммуносупрессии. Поэтому, учитывая, что после создания условий для повышения биолюминесцентного сигнала выше порогового уровня^{1000 паразитов10}, и повышения чувствительности за счет воздействия на висцеральные органы, считается, что БЗ 100 мг/кг в течение 20 дней обеспечивает стерильное излечение. Оценка стерильного излечения ранее была валидирована с помощью различных методик 10,13,17,33,34.

Аналогичный дизайн исследования был применен к модели хронических заболеваний (рис. 5A), в которой мышей (n = 6/группа) начали лечить на 100-й день после заражения. На этом этапе Поза в дозе 20 мг/кг, BZ в дозе 100 мг/кг или 10 мг/кг один раз в сутки вводили перорально в течение 20 дней. После периода выведения препарата у BLI-отрицательных мышей наблюдалась иммуносупрессия. Кроме того, для оценки стерильного излечения мыши, которые все еще были BLI-отрицательными в конце фазы иммуносупрессии, были подвергнуты анализу ex vivo .

При хронической инфекции лечение Позой в дозе 20 мг/кг приводило к снижению на 95,03% ± 6,18% предполагаемой биолюминесцентной паразитарной нагрузки в конце лечения и оставалось на том же уровне у неинфицированных мышей в течение периода элиминации препарата. После иммуносупрессии у большинства мышей наблюдался вариабельный уровень сигнала и распределения BLI (рис. 5B). Процедура ex vivo показала, что у одной BLI-отрицательной мыши всего тела, получавших Posa, было биолюминесцентное пятно в толстой кишке, которое можно было обнаружить при исследовании ex vivo (рис. 5C).

Рисунок 5: Дизайн эксперимента по оценке лекарственного препарата и результаты, полученные на модели хронической инфекции Trypanosoma cruzi с помощью биолюминесцентной визуализации. (A) Схематическая схема схемы эксперимента на мышиной модели хронической болезни Шагаса. Черные точки: временные точки изображения. Аптечка и апельсиновый батончик: начало и конец лечения соответственно. Значок шприца: инъекции циклофосфамида. DPI: на следующий день после заражения. Цветовой код: Серый = нелеченная инфекция; оранжевый = период лечения; синий = фаза выведения соединения; желтый = иммуносупрессия; сирень = рецидив. (B) Продольная оценка эффективности лечения в модели хронической болезни Шагаса. Левая панель: вентральная BLI мышей BALB/c (i) не обработанных или обработанных в течение 20 дней (ii) посаконазолом (Posa) в дозе 20 мг/кг; (iii) бензнидазол (BZ) в дозе 100 мг/кг и (iv) BZ в дозе 10 мг/кг (n = 6/группа). Все процедуры проводились перорально через зонд один раз в день. Правый график: сумма необработанных данных по вентральному и дорсальному общему потоку. Обозначение: аптечка: начало лечения (102 dpi); оранжевая полоса: окончание обработки (121 dpi); Желтая полоска и значок шприца: инъекции циклофосфамида (с 131-142 дня). Оранжевая точка: мышь, проанализированная с помощью процедуры ex vivo . ! Мышь умерла во время анестезии. Мышь проявляет аномалии брюшной полости. Шкала тепловой карты (Log₁₀) показывает интенсивность биолюминесценции в единице излучения от низкого уровня (3 × 10⁵ как синий) до высокого (1 × 10⁷ как красный). (C) Анализ ex vivo тропизма T. cruzi в тканях. Биолюминесцентное обнаружение удаленных органов у иммуносупрессированных in vivo BLI-отрицательных мышей после лечения препаратами Поза и БЗ в дозе 100 мг/кг или мышей с наименьшим сигналом в группах без лечения и БЗ в дозе 10 мг/кг. Ключ распределения пластин показан в нижней части рисунка (созданного с помощью BioRender.com: ZY26LG8AOF). Шкала излучения равна панели in vivo . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обработка BZ в дозе 100 мг/кг снижала биолюминесценцию до пороговых значений (93,87% ± 2,14%) при 122 dpi и далее до конца эксперимента. При анализе ex vivo BZ достиг 100% излечения (6/6 мышей), так как ни у одной из мышей не наблюдался возврат биолюминесцентного сигнала даже при исследовании иммуносупрессивных и внутренних органов. Это означает отсутствие рецидива. Тем не менее, схема лечения BZ с более низкой концентрацией привела к незначительному снижению биолюминесценции (85,95% ± 18,43%), но не к излечению, так как у мышей продолжались обнаруживаемые биолюминесцентные сигнальные очаги во все последующие временные точки. Таким образом, эта модель позволяет количественно дифференцировать неэффективные методы лечения (посаконазол и неоптимальное лечение бензнидазолом) и эффективные методы лечения (оптимальная дозировка и продолжительность лечения бензнидазолом).

Дополнительный рисунок 1: Прединфекционный анализ популяционной экспрессии люциферазы T. cruzi путем измерения флуоресценции репортерного гена mNeonGreen. Проточная цитометрия флуоресцентного белка mNeonGreen, конститутивно экспрессируемого паразитом CL Brener Luc::Neon. Нормализована гистограмма числа паразитов (ось Y) по интенсивности флуоресценции mNeonGreen (ось X). Внутренняя легенда демонстрирует анализируемую деформацию и форму, медиану флуоресценции и процент популяции флуоресценции. Линии затвора определяются штаммом CL Brener дикого типа (WT) как нефлуоресцентный контроль. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная таблица 1: Пример таблицы анализа при измерении LI . Исходные данные, полученные в результате количественной оценки биолюминесцентной визуализации на 19-й день после инфицирования в острой модели, используются в репрезентативных результатах, показанных на рисунке 4B. Описание групп: Контроль как неинфицированные мыши (n = 3/группа); носители как необработанные инфицированные мыши; посаконазол (Posa) в дозе 20 мг/кг в течение 20 дней; бензнидазол (БЗ) в дозе 100 мг/кг в течение 20 дней; BZ в дозе 100 мг/кг обрабатывают в течение 5 дней (n = 6/группа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

Биолюминесцентная визуализация — это прорывной метод, который позволяет обнаружить ген отчета с помощью видимого и инфракрасного спектра электромагнитного излучения. Таким образом, нет необходимости в радиоактивных метках для отслеживания образца³⁵. BLI подходит для моделей грызунов и других мелких видов. Он очень полезен для доклинических исследований, потому что он безопаснее и позволяет проводить несколько раундов изображения, вызывая минимальный дискомфорт у животных. Кроме того, визуализация in vivo очень гибкая благодаря возможности сочетания биолюминесценции, флуоресценции и других методов, таких как позитронно-эмиссионная томография³⁶.

Оптическое изображение управляется оптическими физическими свойствами, такими как поглощение и рассеяние. Все ткани по-разному поглощают и рассеивают свет различных длин волн³⁷. Одним из важнейших шагов является выбор репортерного гена без учета длины волны, излучаемой светом, производимым химической реакцией. В то время как уровень экспрессии репортерного гена может быть высоким in vitro в биолюминесцентных анализах, те же уровни экспрессии могут быть не достигнуты при переходе к условиям in vivo. В этом протоколе мы использовали оптимизированную версию кодона Photinus pyralis luciferase (PpyRE9H)³⁸ для трипаносоматид⁹, которая излучает свет с длиной волны 617 нм, что является одним из наиболее подходящих для исследований in vivo ³⁹. Длины волн длиннее 600 нм меньше поглощаются и рассеиваются эндогенными хромофорами тела, особенно гемоглобином и меланином. Таким образом, красный свет может передаваться через несколько сантиметров ткани, что позволяет фотонам достигать ПЗС-камеры даже изнутри висцеральных тканей ^39,40.

Одной из проблем, вызывающих озабоченность в условиях визуализации, является отсутствие всестороннего понимания их функции и эффектов. Биннинг, метод предварительной обработки, объединяет информацию, полученную смежными детекторами, в более крупный пиксель. Этот процесс улучшает соотношение сигнал/шум, снижая фоновый шум и повышая чувствительность. Однако это снижает точность пространственного разрешения, в результате чего изображение становится пикселизированным^41,42. Этот компромисс является важным фактором в вашей стратегии визуализации.

Основанное на профиле целевого продукта и профиле целевого кандидата для болезни Шагаса³⁴, экспериментальное исследование сосредоточено на чувствительности к обнаружению T. cruzi и помогает установить, может ли новый препарат-кандидат достичь стерильного излечения (что выражается в отсутствии рецидива после нескольких раундов иммуносупрессии). Поэтому мы выполняем BLI, используя самый высокий коэффициент биннинга без перенасыщения изображения. Когда изображение перенасыщено, выполняется новое получение данных с использованием более низкого коэффициента биннинга. В ходе анализа применяется математическая коррекция к изображениям, для которых требовалось разное биннингование. Таким образом, окончательные данные должны быть представлены с использованием того же биннинга. В таблице 1 показаны различные значения, полученные при применении различных коэффициентов биннинга в одном и том же изображении и ROI.

Таблица 1: Влияние настроек биннинга на количественную оценку BLI. Количественная оценка трех ROI на изображении острой модели (d13) и хронической модели (d118), проанализированных в различных биннинг-факторах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

В связи с текущим сценарием болезни Шагаса в клиниках, усилия по разработке лекарств направлены на полную ликвидацию паразитов (паразитологическое лечение)^27,34. Таким образом, доклинический протокол in vivo включает подходы, которые преодолевают ограничения технической чувствительности BLI. Одним из подходов является лечение мышей циклофосфамидом для снижения иммунного ответа, который контролирует паразитарную нагрузку. Другая стратегия заключается в уменьшении глубины тканей и удалении слоев мышц, кожи и меха, которые препятствуют световому пути к камере. С помощью процедуры ex vivo могут быть обнаружены небольшие биолюминесцентные пятна, выявляющие очаги паразитов ниже порога in vivo BLI, как показано на рисунке 5C, in ex vivo результат мыши, обработанной Posa.

Разработка пилотного эксперимента для оценки самой модели и динамики инфекции имеет решающее значение для проведения точного эксперимента по оценке эффективности противопаразитарных препаратов. Таким образом, исследователь сможет заранее определить правильные настройки BLI и время инфекции. В исследовательском эксперименте одним из инструментов, который может быть полезен для определения настроек съемки, является «Автоэкспозиция». С помощью этого инструмента исследователь устанавливает приоритет трех настроек (Время экспозиции, Биннинг и F/Ступень) для получения наилучшего возможного изображения. В частности, исследователь должен убедиться, что изображения получены в динамическом диапазоне ПЗС-камеры, без перенасыщения или недодержки, которые могут быть проверены с помощью минимального и максимального пределов шкалы и функции автоэкспозиции (меню «Редактирование » > «Настройки » > вкладке «Получение » > вкладке «Автоэкспозиция»). В этом протоколе диафрагма камеры была установлена на максимальное значение (F/Stop: 1), а также были определены различные времена экспозиции и коэффициенты биннинга для моделей острого и хронического состояния. Эти настройки обеспечивают предсказуемость времени для одновременного выполнения различных раундов изображения. Учитывая, что репортерный метод основан на ферментативной реакции, как биораспределение субстрата в организме мыши, так и кинетика люциферазы влияют на биолюминесцентный сигнал и, таким образом, на количественную оценку инфекции (рис. 1В). Следовательно, получение изображений в различные моменты ферментативной кинетики приводит к вариабельности данных, которую невозможно учесть или скорректировать, и влияет на расчет общего потока (фотонов в секунду) или излучения (фотонов в секунду 2 см² / стерадиан). Кроме того, инфекция T. cruzi демонстрирует динамическое пространственное позиционирование у мышей (различные участки и ткани, глубина и паразитарная нагрузка). Следовательно, установление значения количества для получения может пропустить более слабые источники сигнала (малое количество паразитов в определенном месте глубже в ткани), если другой более сильный источник сигнала соответствует определенным критериям автовоздействия.

Хитрой функцией программного обеспечения Living Image является отображение полученного изображения в автоматической цветовой шкале. Не существует возможности предварительной установки масштаба для автоматического отображения совершенно нового полученного изображения в соответствии с выбранными значениями масштаба (см. шаг протокола 6.2). Эта ситуация вынуждает исследователя вручную поочередно изменять изображения на выбранные максимальные и минимальные значения. Как следствие, неопытные и плохо обученные пользователи не имеют надлежащего считывания данных во время сеанса сбора данных, и они могут ввести данные в заблуждение или потерять важную информацию в этот момент времени. Для этого полезен пилотный эксперимент.

Один из наиболее распространенных вопросов о дизайне эксперимента с доказательством концепции заключается в том, как выбрать продолжительность лечения и дозу. Для новых химических соединений эти параметры обычно определяются активностью и селективностью соединения in vitro в сочетании с данными, полученными в результате исследований метаболизма и фармакокинетики лекарственных препаратов (DMPK) и переносимости, проведенных до тестирования эффективности in vivo. Таким образом, после идентификации соединений, способных избирательно убивать паразита внутри клеток, первые эксперименты ADME (абсорбция, распределение, метаболизм и экскреция) проводятся in vitro для оценки растворимости соединений в воде, проницаемости клеток и метаболической стабильности, а также других параметров. Если соединения демонстрируют хороший баланс свойств in vitro (обычно определяемых в профилях кандидатов-мишеней), то эти кандидаты переходят к исследованиям фармакокинетики (ФК) in vivo на здоровых мышах, которые определяют экспозицию соединения в крови (и, возможно, также в тканях) и дают общее представление о переносимости при различных уровнях дозы^{. 34,43}. В идеале, целью оценки ФК при большинстве инфекционных заболеваний является определение возможности достижения концентраций в свободной плазме крови (с поправкой на связывание с белками плазмы), превышающих концентрации EC₅₀/EC₉₀ ⁴⁴ - эффективной концентрации, которая убивает или, по крайней мере, подавляет рост 50% или 90% паразитов, соответственно, в течение достаточно длительного периода времени. Если при определенном уровне дозы достигнута достаточная экспозиция, то этот режим может быть использован во время исследований эффективности с использованием модели BLI Шагаса. Для исследований по изменению положения препарата должны быть доступны данные по ФК in vitro и in vivo. Хорошим началом для перепрофилирования лекарств являются химические базы данных, такие как PubChem⁴⁵, которые предоставляют признанные данные, которые могут быть преобразованы на мышей с использованием аллометрического шкалирования⁴⁶ для оценки безопасных и нетоксичных схем лечения, подлежащих тестированию. Однако это не всегда так. Исследования фармакокинетики до сих пор остаются недооцененной областью в академической науке, и лишь немногие фармацевтические компании публикуют свои результаты по фармаколинии. Научное сообщество, занимающееся разработкой лекарственных средств, рекомендует включать оценку фармакокинетики in vivo вместе с анализами эффективности лекарств (фармакодинамика)⁴⁷. Таким образом, доклиническая визуализация совместима с измерениями соединений одновременно, и этот подход повышает надежность данных.

Кроме того, на протяжении всего эксперимента контролируется обращение с мышами, их вес и состояние здоровья. Признаки токсичности и побочные эффекты, такие как сгорбление, дрожь, потеря равновесия, нежелание двигаться, нежелание есть или пить, прострация или любые другие аномалии, присутствующие в группе или при отдельных состояниях мышей, должны быть зарегистрированы и сообщены в доклинических исследованиях. Одной из целей оптической визуализации является обеспечение благополучия животных. Таким образом, гуманные конечные точки должны применяться у мышей с болевыми признаками, описанными в шкале Гримасы⁴⁸. Кроме того, мышей еженедельно взвешивали во время получения BLI и, чаще, во время дозирования препарата и лечения CTX. В соответствии с правилами защиты животных, мыши, которые теряют более 20% массы тела, должны быть немедленно гуманно усыплены.

Биолюминесцентная модель T. cruzi в настоящее время является современной экспериментальной моделью для открытия и разработки новых методов лечения болезни Шагаса. Модель, которая воспроизводит ключевые особенности инфекции T. cruzi и болезни Шагаса⁴⁹, что позволяет проводить мониторинг паразитемии в режиме реального времени и дифференцировать соединения с различными профилями эффективности, связанными с известными способами действия. BLI — это метод, который повышает ассертивность при выявлении инфицированных тканей. Это позволяет использовать точный выбор инфицированных тканей в широком спектре подходов, включая все классические методы, уже примененные в исследовании T. cruzi ^50,51. Кроме того, это позволяет исследователям изучать передовые технологии и разрабатывать новые³³. Кроме того, BLI обеспечивает улучшение благополучия животных и более рациональное использование в соответствии с принципами 3R^10,35, все сразу.

Несколько исследовательских групп, специализирующихся на забытых тропических болезнях, работают в странах, где нет устройств визуализации in vivo. Чтобы преодолеть сложившийся сценарий, новые международные сети, такие как Global BioImaging и связанные с ними консорциумы, продвигают действия по обеспечению открытого доступа к основным объектам визуализации и улучшению подготовки персонала и ученых в области визуализации^52,53. Эти инициативы, наряду с дружественными пользовательскими протоколами, подобными этому, могут обеспечить условия демократизации передовых технологий для всех исследователей. Реализация этого метода в доклинической разработке лекарств обеспечила надежное считывание эффективности и прогностическую ценность клинического исхода, способствуя разработке лекарств от болезни Шагаса.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD LSRFortessa™ X-20 Cell Analyzer	BD Biosciences
Weighing Balance (animal facility)	Available from several suppliers
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System	Revvity (former PerkinElmer)
FlowJ Software v10.7.1	BD Biosciences
Living Image Software for Spectrum v4.7.1	Revvity (former PerkinElmer)		License Free Analysis Software called 'Aura Imaging' could be used for the most basic features provided by Spectral Instruments Imaging (Bruker company) (https://spectralinvivo.com/software/)
Microsoft Office software	Microsoft
GraphPad Prism v8.4.0	GraphPad Software Inc.
DMEM Low Glucose	Vitrocell	D0025
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761-500G
Foetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	16000-044
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
Trypsin 0.5% EDTA	Gibco	25300-062
LIT medium	In house
Hygromycin B (50 mg/mL)	Gibco	10687010
Grace′s Insect Medium	Sigma-Aldrich	G9771
HEPES	Sigma-Aldrich	54457
IVISBrite d-luciferin potassium salt	Revvity (former PerkinElmer)	122799	Also could be used: VivoGlo Luciferin, in vivo grade (Promega/P1043); D-Luciferin, Monopotassium Salt (Thermo Scientific/88293) or PierceD-Luciferin, Monosodium* Salt (Thermo Scientific/88291); D-Luciferin, Potassium Salt (GoldBio/LUCK or eLUCK); D-Luciferin, Sodium* Salt (GoldBio/LUCNA or eLUCNA) *Sodium or potassium salt differences relies minimal chances on solubility, however do not affect in vivo performance.
DPBS	Gibco	21600-044
Cyclophosphamide (CTX)	Sigma-Aldrich	C0768-5g
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D5879
(Hydroxypropyl)methyl cellulose (HPMC)	Sigma-Aldrich	09963-25G
Benzyl alcohol	Sigma-Aldrich	402834
Tween 80	Sigma-Aldrich	P1754-1L
Benznidazole	ELEA
Posaconazole (Noxafil commercial formulation)	Schering-Phough
Giemsa	Available from several suppliers
gavage needle (stainless-steel straight) - 22GA	Aton	CA2003
1 mL Syringe and 31G needle	Available from several suppliers
1 mL Syringe and removable 26G needle	Available from several suppliers
1 mL Syringe and removable 24G X¾ needle	Available from several suppliers
Sterile Syringe Filter 0.2 µm	Available from several suppliers
A4 Matte Black paper 120gr or thicker	Paper Color/ Canson (Available from several suppliers)
aluminum foil	Available from several suppliers
Neubauer chamber	Available from several suppliers