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Resumen

El protocolo proporcionado aquí describe los pasos detallados para realizar estudios de eficacia de fármacos en un modelo bioluminiscente de infección por Trypanosoma cruzi , con un enfoque en la adquisición, análisis e interpretación de datos. También se proporcionan procedimientos de solución de problemas y control de calidad para minimizar los problemas técnicos.

Resumen

Para controlar y disminuir el impacto en la salud pública de las enfermedades protozoarias humanas, como la enfermedad de Chagas, la leishmaniasis y la tripanosomiasis africana humana, es necesario acelerar el desarrollo de nuevos medicamentos y vacunas. Sin embargo, este proceso está lleno de dificultades, como la muy compleja biología de los parásitos y la patogénesis de las enfermedades y, como es típico de las enfermedades tropicales desatendidas, la financiación comparativamente limitada para la investigación y el desarrollo. Por lo tanto, los modelos de estudio in vitro e in vivo que puedan reproducir suficientemente las características clave de la infección y la enfermedad y que al mismo tiempo proporcionen un uso racional de los recursos son esenciales para avanzar en la investigación de estas afecciones. Un ejemplo es el modelo de ratón de imágenes de bioluminiscencia (BLI) in vivo para la enfermedad de Chagas, que proporciona una detección altamente sensible de la luz de longitud de onda larga generada por los parásitos Trypanosoma cruzi que expresan luciferasa. A pesar de que esta técnica se ha convertido en el enfoque estándar para los estudios de eficacia de fármacos in vivo , los grupos de investigación aún pueden tener dificultades para implementarla debido a la falta de capacitación práctica adecuada sobre el manejo de equipos y la aplicación de procedimientos de control de calidad, incluso cuando se dispone de equipos BLI adecuados. Teniendo en cuenta este panorama, este protocolo tiene como objetivo guiar desde la planificación de experimentos hasta la adquisición y análisis de datos, con detalles que faciliten la implementación de protocolos en grupos de investigación con poca o nula experiencia con BLI, ya sea para la enfermedad de Chagas o para otros modelos de ratones con enfermedades infecciosas.

Introducción

La enfermedad de Chagas es endémica en América Latina y afecta aproximadamente a siete millones de personas en todo el mundo1. Anualmente, más de 50.000 muertes y pérdidas económicas de alrededor de 7 mil millones de dólares son el resultado de la naturaleza incapacitante de esta enfermedad2. La enfermedad de Chagas es causada por el protozoo Trypanosoma cruzi, un parásito hemoflagelado heteroxénico capaz de infectar mamíferos (silvestres y domésticos) y vectores triatominos (Hemiptera, Reduviidae)3 en las Américas, donde se establece la transmisión vectorial. Otras vías de infección importantes son la transfusión de sangre, el trasplante de órganos, la transmisión oral (por la ingestión de alimentos contaminados con un triatomino infectado)4 y la transmisión congénita. Las vías de transmisión no vectorial han contribuido a la diseminación de la enfermedad de Chagas a zonas no endémicas 3,5.

La enfermedad de Chagas se manifiesta en dos fases clínicas. La fase aguda es, en la mayoría de los casos, asintomática. Las infecciones sintomáticas suelen asociarse a signos inespecíficos como fiebre, fatiga, mialgia, linfadenopatías, esplenomegalia y hepatomegalia. La fase aguda también se asocia a menudo con parasitemia patente y circulación sistémica de parásitos. La muerte puede ocurrir hasta en el 10% de los casos diagnosticados, especialmente en los de infección oral6. La fase crónica a menudo se caracteriza por un largo período de ausencia de síntomas. Con el tiempo, aproximadamente un tercio de los pacientes infectados décadas antes presentan manifestaciones cardíacas, generalmente acompañadas de fibrosis e inflamación miocárdica, y/o trastornos gastrointestinales, en su mayoría relacionados con el desarrollo de síndromes de megaesófago y/o megacolon 3,5,6.

El tratamiento etiológico de la enfermedad de Chagas consiste en solo dos fármacos: benznidazol y nifurtimox. Estos agentes antiparasitarios están disponibles desde hace más de 50 años y tienen una toxicidad considerable y una eficacia limitada 5,7,8. En consecuencia, existe una necesidad apremiante de desarrollar tratamientos nuevos, seguros y más eficaces para los pacientes con enfermedad de Chagas.

Técnicas más sofisticadas y precisas permiten ahora obtener respuestas a viejas preguntas que permiten avanzar en la búsqueda de nuevos tratamientos para la enfermedad de Chagas. En este sentido, la comunidad científica se beneficia enormemente de los parásitos modificados genéticamente para estudios in vivo sobre el curso de la infección y evaluación de la eficacia de los fármacos 9,10,11,12. Un ensayo longitudinal basado en el sistema de imágenes de bioluminiscencia (BLI) permite evaluar la eficacia durante y después de la pauta de tratamiento, lo que lleva a la identificación de compuestos con actividad tripanocida10,13. El método BLI proporciona una medición directa de la carga parasitaria, tanto en circulación como en tejidos y órganos, a través de la cuantificación de la luz producida por el linaje11 modificado genéticamente de T. cruzi CL Brener Luc::Neon, que expresa constitutivamente la luciferasa 12 de luciérnagadesplazada al rojo.

Sin embargo, casi 10 años después del establecimiento del modelo animal BLI de la enfermedad de Chagas y de los estudios de eficacia de los fármacos, solo unos pocos grupos de investigación dominan esta técnica. Este hecho se debe no solo al reducido acceso a equipos de imagen adecuados, sino también a la falta de capacitación y disponibilidad de protocolos estructurados y detallados. Este método presenta varias ventajas frente a otros enfoques, que se basan en la evaluación de la parasitemia por microscopía, serología o evaluación de infecciones de órganos/tejidos por qPCR para la detección de ADN del parásito, ya que permite mejorar el bienestar de los ratones y reducir el uso de animales por la posibilidad de generar datos in vivo más robustos e integrados. Además, podría decirse que este método es más sensible, ya que permite la detección rápida de focos de parásitos en órganos viscerales después del tratamiento farmacológico 10,12. Por lo tanto, este protocolo tiene como objetivo orientar a los grupos de investigación en Parasitología y otras enfermedades infecciosas para establecer esta metodología en sus laboratorios detallando los procedimientos técnicos. Aquí, compartimos la experiencia obtenida a través de la implementación del modelo BLI de la enfermedad de Chagas en Brasil, el primero de su tipo en América Latina, como parte de los esfuerzos de descubrimiento de fármacos coordinados por la iniciativa Medicamentos para Enfermedades Desatendidas (DNDi).

Protocolo

Todos los procedimientos descritos en este protocolo fueron sometidos, aprobados y realizados de acuerdo con las directrices14 preconizadas por el Comité de Ética Animal del Instituto de Ciencias Biomédicas de la Universidad de São Paulo: protocolo CEUA ICB/USP nº 5787250522.

1. Soluciones

NOTA: Considere el volumen administrado preconizado de 10 mL/kg (200 μL para un ratón de 20 g de peso)15,16. Por ejemplo, prepare una solución de trabajo de 15 mg/ml para alcanzar 150 mg/kg de dosis para animales.

  1. Vehículo con suspensión de hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC-SV)
    NOTA: Los reactivos necesarios son 0,5% (p/v) de hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC), 0,4% (v/v) Tween 80 y 0,5% (v/v) de alcohol bencílico.
    1. Para 200 ml de solución para vehículos, pesar 1 g de HPMC y disolver en 64 ml de agua ultrapura caliente. Revuelve durante 2 min.
    2. Añadir 120 mL de agua ultrapura helada y remover durante 1 h. Agrega 1 mL de alcohol bencílico.
    3. A continuación, añada 0,8 mL de Tween 80 mediante la técnica de pipeteo inverso y siga agitando hasta que la solución se vuelva transparente.
    4. Ajuste la solución para el volumen final de 200 mL. Almacene el HPMC-SV en refrigeración (4 °C) durante un máximo de 3 meses.
  2. benznidazol
    1. Calcule la cantidad necesaria de solución compuesta, de la siguiente manera:
      Volumen de solución compuesta = (número de dosis en cada día x número de días x número de ratones a tratar x volumen administrado en cada ratón) + 30% extra.
    2. Pesar la cantidad necesaria de benznidazol (BZ), considerando la dosis deseada. Para el tratamiento curativo, una dosis oral de 100 mg/kg una vez al día durante 10 días logra una curación del 100% en el modelo crónico de EC17.
    3. Teniendo en cuenta el volumen final deseado, calcule la cantidad adecuada para alcanzar una concentración de 5% (v/v) de DMSO y disuelva completamente BZ en DMSO puro.
    4. Agregue el volumen adecuado del vehículo a un tubo de vidrio para alcanzar una concentración del 95% (v/v) de HPMC-SV. Transfiera el BZ disuelto en DMSO al tubo de vidrio que contiene HPMC-SV. Homogeneizar enérgicamente la suspensión y almacenarla a 4 °C.
      Ej.: Volumen final de la formulación BZ = 10 mL (paso 1.2.1)
      Cantidad de BZ = 100 mg (paso 1.2.2)
      DMSO al 5 % = 0,5 ml (paso 1.2.3) y HPMC-SV al 95 % = 9,5 ml (paso 1.2.4)
    5. Antes de la administración de cada fármaco, las formulaciones se colocan en un baño de agua ultrasónico durante 5 min a 37 °C y se homogeneizan vigorosamente antes de la dosificación animal.
  3. Ciclofosfamida
    1. Disuelva la cantidad necesaria de ciclofosfamida en agua ultrapura para obtener una solución de 12,5 mg/mL.
    2. Esterilizar la solución por filtración y almacenar a 4 °C.
  4. Mancha de Giemsa
    1. Disolver 0,6 mg de reactivo en polvo de Giemsa en 50 mL de metanol. Agrega 25 mL de glicerol y mezcla. Elimine los precipitados con papel de filtro y un embudo. Almacene la solución madre a temperatura ambiente (RT), protegida de la luz.
    2. Prepare una solución de trabajo diluyendo 10 mL de solución de Giemsa en 90 mL de tampón de mezcla de fosfato (20,5 m na2HPO4, 65,4 m KH2PO4 a pH 7,2).

2. Cultivo de Trypanosoma cruzi

  1. Trabajando en una cabina de seguridad biológica (BSC), cultive 4 x 106 epimastigotes/mL de T. cruzi CL Brener Luc::Neon11 en medios LIT (68.44 mM NaCl, 5.36 mM KCl, 112.7 mM Na2HPO4, 5 g/L de triptona, 5 g/L de caldo de infusión hepática, 0.03 M de hemina, 4.16 mM de glucosa), suplementado con 10% (v/v) de suero fetal bovino (FBS), 100 μg/mL de penicilina, 100 U/mL de estreptomicina y 150 μg/mL de higromicina como fármaco selectivo a 28 °C. Los parásitos suelen alcanzar una fase estacionaria en 3-4 días.
  2. Inducir la metaciclogénesis para obtener parásitos infecciosos mediante la incubación de 3 x 108 epimastigotes en 10 mL de medio Grace Insect con 10% (v/v) de FBS en tubos cónicos de 15 mL a 28 °C durante 7-10 días.
  3. Evaluar la tasa de diferenciación por frotis de tinción de Giemsa. Para ello, esparce 20 μL de los parásitos diferenciados en un portaobjetos de cristal y deja secar durante 10 min.
  4. En una campana extractora, proceda a la fijación de la muestra cubriendo el portaobjetos de vidrio con metanol puro y deje secar completamente (1-2 min). Cubra el portaobjetos de vidrio con la solución de trabajo de Giemsa durante 20 min.
  5. Lave suavemente el portaobjetos de vidrio con agua destilada. En un microscopio, cuente el porcentaje de tripomastigotes metacíclicos. Si se logra una tasa de diferenciación de al menos el 10 por ciento, continúe con el siguiente paso.
  6. Centrifugar los parásitos (120 x g durante 10 min) y resuspender el pellet con 10 mL de DPBS. Centrifugar una vez más y resuspender los parásitos en 5 mL de DMEM suplementado con 10% (v/v) de FBS, 100 μg/mL de penicilina y 100 U/mL de estreptomicina.
  7. En un matraz de cultivo de 25cm2 , realizar la infección de 1,66 x 105 células LLC-MK2 (células epiteliales renales de Macaca mulatta) a 37 °C en CO2 al 5%, en una incubadora humidificada18.
  8. Los tripomastigotes de cultivo de tejidos (TCT) se liberan en el medio después de 8-9 días. Infecte monocapas frescas de células LLC-MK2 con TCT a una multiplicidad de infección (MOI) de 1:40.

3. Análisis de la homogeneidad poblacional de Trypanosoma cruzi mediante citómetro de flujo

  1. Recoja los TCT de las cepas CL Brener Luc::Neon y CL Brener de tipo salvaje, centrifugue a 120 x g durante 10 minutos y vuelva a suspender los TCT en DPBS. Ajuste la densidad del parásito para lograr 1 x 106/mL.
  2. Proceda con el análisis de la población mediante citómetro de flujo basado en la fluorescencia mNeonGreen (ex. 506/em. 517 nm)19, adquiriendo al menos 20.000 eventos para cada muestra.
    NOTA: El porcentaje de la población fluorescente se obtiene comparando el tipo salvaje con el parásito transfectado. Para proceder con la infección en ratones, se debe alcanzar un mínimo del 95% de la población de parásitos fluorescentes del linaje CL Brener Luc::Neon (Figura suplementaria 1).

4. Infección experimental en ratones

NOTA: Para aumentar la cantidad de parásitos, los tripomastigotes del torrente sanguíneo (BT) se obtienen frecuentemente de ratones inmunodeficientes10,13. En este caso, se utiliza la inmunosupresión química de ratones BALB/C para obtener BT, para lo cual se consigue una inmunosupresión leve con cuatro inyecciones intraperitoneales de ciclofosfamida (CTX) a 62,5 mg/kg con intervalos de 96 h, que se realiza de forma concomitante a la infección por T. cruzi.

  1. Administrar 62,5 mg/kg de ciclofosfamida estéril por inyección intraperitoneal (i.p.) 1 día antes de la infección por T. cruzi .
  2. Infectar cada ratón con 1 x 104 TCTs en 0,2 mL de DPBS a través de la vía intraperitoneal. Atención al alto riesgo de incidentes en la manipulación de patógenos y agujas. Realice la infección en un BSC, usando guantes y un protector facial durante todo el procedimiento.
  3. Seguimiento diario de la parasitemia mediante observación directa de la BT en sangre (método de Pizzi-Brener)20. En el pico de parasitemia, alrededor de 13-17 días después de la infección (dpi), se realiza la recolección de sangre. Para ello, anestesiar a los ratones con 100 mg/kg de ketamina y 10 mg/kg de xilacina.
  4. Cuando los ratones estén completamente anestesiados21, se procederá a la punción cardíaca con una jeringa de 1 mL conectada a una aguja de 24 G X3/4 que contenga 50 μL de citrato de sodio al 3,8% (p/v). Desconecte la aguja y coloque suavemente la sangre en un tubo de centrífuga.
  5. En un BSC, realice una dilución de una alícuota de sangre en tampón de lisis de cloruro de amonio-potasio (ACK) y cuente los parásitos en la cámara de Neubauer. Repita este procedimiento al menos dos veces, ya que los pequeños coágulos de sangre influyen en el recuento de parásitos.
    NOTA: Para evitar errores de conteo, ajuste el factor de dilución para evitar recuentos inferiores a 30 y superiores a 300 tripomastigotes en la cámara de Neubauer.
  6. Ajustar la densidad del parásito a 5 x 103 BT/mL mezclando la cantidad necesaria de sangre pura en DPBS.
  7. Infectar ratones BALB/c no inmunodeprimidos con 1 x 103 BT en 0,2 mL de DPBS por ratón (5 x 103 BT/mL) por vía intraperitoneal utilizando una aguja de 26 G (las agujas más estrechas conducen a la lisis del parásito)22. Después de inyectar el volumen por vía intraperitoneal, mantenga la aguja dentro del ratón durante 5 s para evitar el reflujo.
  8. Coloque a los ratones infectados temporalmente en una caja con una toalla de papel para identificar posibles fugas o sangrados y luego devuelva a los ratones a sus jaulas.

5. Imágenes in vivo

NOTA: El glosario de los términos utilizados aquí es el siguiente:

Sesión de imagen: Adquisición de bioluminiscencia realizada en todos los grupos de un determinado experimento en un día determinado. La Figura 1A muestra una descripción general del procedimiento.

Ronda de imágenes: Procedimiento realizado en subgrupos de tres ratones, desde la inyección de D-luciferina hasta la recuperación de la anestesia. Se recomienda que cada grupo experimental contenga 6 ratones, debido a la variabilidad intrínseca de la carga parasitaria de los ratones y otros factores que influyen en la cuantificación de BLI que se describen a continuación.

Adquisición de imágenes: Sesión fotográfica realizada por el equipo de imágenes para cuantificar la bioluminiscencia, que da como resultado una superposición de imagen de una fotografía y la bioluminiscencia cuantificada se muestra como una escala de pseudocolores.

Procedimiento de diagnóstico por imágenes: Todos los pasos discutidos en esta sesión del protocolo.

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Figura 1: Adquisición de datos BLI (A) Diagrama del flujo de trabajo de adquisición aplicado para estudios de enfermedades infecciosas, utilizando como ejemplo el modelo de ratón bioluminiscente de la enfermedad de Chagas. Los ratones infectados con T. cruzi modificado genéticamente se analizan mediante imágenes in vivo en los puntos de tiempo establecidos. En cada ronda de imágenes, se inyectan grupos de hasta tres ratones con 150 mg/kg de sustrato enzimático (D-luciferina). Después de 5 min, la anestesia se administra a 2,5% (v/v) de isoflurano en oxígeno. Cuando están completamente inmóviles, los ratones se colocan en un sistema de imágenes y la adquisición se inicia siguiendo la configuración definida. Después de las imágenes, los ratones se recuperan de la anestesia y son devueltos a las jaulas. Las preguntas frecuentes y los problemas que los investigadores pueden tener y a los que se enfrentan durante la adquisición se resaltan en rojo. Este esquema ha sido modificado de Lewis et al. (2014)12 (creado con BioRender.com: UD26KWEVS2). (B) Cinética in vivo de D-luciferina/luciferasa de luciérnaga desplazada al rojo (PpyRE9h). Los ratones en el pico de parasitemia de T. cruzi (n = 3) fueron anestesiados e inyectados con 150 mg/kg de D-luciferina. Las imágenes se adquirieron durante 1 h (tiempo de exposición: 2 min; binning: 4). Arriba: cuantificación del flujo total ventral (p/s) (eje Y izquierdo, en rojo) y como porcentaje de la medición media más alta (eje Y derecho, en azul). Los datos se muestran como media (curvas) y desviación estándar (área sombreada). Abajo: Imágenes adquiridas del primer (4 min), la señal BLI más alta (30 min) y el último (62 min) puntos de tiempo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Compruebe la barra verde de la ventana Adquisición para comprobar si la cámara del dispositivo de carga acoplada (CCD) está fría (-90 °C). Haga clic en la barra (verde o roja) para visualizar la temperatura.
    NOTA: De acuerdo con el manual del equipo de imágenes, el equipo y el software de imágenes deben estar encendidos todo el tiempo para mantener frío el CCD.
  2. Verifique si se realizó el ajuste automático de fondo. Para hacerlo, haga clic en Adquisición > Fondo > Ver Carga oscura disponible. Aparecerá una lista con varias combinaciones de ajustes.
    NOTA: Este procedimiento reduce el ruido de luminiscencia. Si la configuración elegida da como resultado un valor superior a 1000, basado en la fórmula "tiempo de exposición x (binning²)", entonces la carga oscura no debe ignorarse. Dependiendo de las configuraciones de software, la agrupación se puede mostrar como un número (factor de agrupación) o un rango de 'pequeño' a 'grande'. La correspondencia entre el rango y el factor de agrupación se puede encontrar en el manual del dispositivo.
  3. Si no se muestra la ventana de actividad (área blanca en la parte inferior del software), habilítela en la vista de menú > ventana de actividad.
  4. Establezca el área de imagen haciendo clic en Ventana de adquisición > Campo de visión. La opción C (13,2 cm) adquiere 3 ratones, y la opción D (22 cm) adquiere 5 ratones.
  5. Seleccione la opción de guardado automático haciendo clic en Adquisición > Guardado automático y seleccione o cree una nueva carpeta para cada punto de tiempo.
  6. Coloque un papel negro mate sobre el área de imagen y coloque las correderas de partición perpendicularmente entre las entradas. Si el fabricante no ha facilitado las diapositivas, utilice trozos (3 cm x 15 cm) de papel negro mate.
  7. Ajuste el área interna de la cámara de imágenes para acomodar los conos de la nariz de vidrio a las entradas de anestesia. Use pequeños pedazos de cinta aislante negra para sujetar el sistema de anestesia a la plataforma (fuera del área de la imagen).
    NOTA: En algunas versiones de dispositivos de imagen, un láser define el área de imagen. Si esta herramienta no está disponible, adquiera imágenes a través del software para verificar las diapositivas de partición dentro del área de imágenes.
  8. Ajuste el vaporizador de isoflurano al 2,5% (v/v) de oxígeno para las cámaras de imagen e inducción. Compruebe con el manómetro si el gas fluye a través del sistema21.
    NOTA: Si el dispositivo de diagnóstico por imágenes no tiene un sistema de anestesia inhalatoria conectado, son posibles otras opciones de anestesia, como xilacina inyectable y ketamina23. En este caso, la recuperación de los ratones es lenta y el riesgo de muerte es alto24.
  9. Llene las jeringas (agujas de 31 G) con D-luciferina (diferentes proveedores proporcionan un protocolo completo para preparar la D-luciferina)25,26, protéjalas de la luz directa y prepare algunos recipientes de plástico o jaulas adicionales cubriendo el interior con una toalla de papel.
  10. Tenga a mano un reloj para controlar fácilmente el tiempo y un cuaderno de laboratorio para registrar los grupos de ratones, el tiempo de inyección de luciferina y cualquier otra información durante el procedimiento.
  11. Pesa a todos los ratones y registra su peso. Marca cada ratón con un rotulador o un tatuaje en la cola. Mantenga la identificación de los ratones bien visible durante todo el experimento. Este paso también se puede realizar el día anterior a la adquisición.
    NOTA: La marca no debe ocupar un área corporal grande porque la tinta puede interferir con la señal bioluminiscente. Los marcadores permanentes de diferentes colores también pueden ayudar a diferenciar los grupos.
  12. Para iniciar la sesión de imágenes, registre una imagen luminiscente de fondo (ajustes: Tiempo de exposición: 5 min; Agrupación: 'grande' o '16', f/stop: 1) de la cámara de imagen sin ratones. Este procedimiento ayuda a identificar fuentes de luz autoluminiscentes o problemas no deseados en el equipo.
    NOTA: Debido a que BLI se basa en la reacción enzimática, el tiempo es una característica esencial del experimento. Verifique todos los elementos enumerados anteriormente y la configuración del equipo antes de comenzar el manejo de animales.
  13. Inyectar 150 mg/kg (i.p.) de D-luciferina en los 3 primeros ratones sin que lleguen a los órganos internos. Coloque los ratones en la caja del contenedor para evaluar si hay fugas de D-luciferina (solución amarilla brillante). Tome notas si esto sucede y registre el grupo de ratones y el tiempo de inyección de D-luciferina.
  14. Espere 5 minutos y luego transfiera los ratones a la cámara de inducción de anestesia. Encienda el sistema. Los ratones tardan unos 3 minutos en estar completamente anestesiados (ausencia de respuestas como temblores de patas, cola, etc.) Artículo 21.
  15. Abra la puerta del dispositivo de imagen, abra el flujo anestésico a la cámara de imágenes y, al mismo tiempo, apague la cámara de inducción.
  16. Coloque cada ratón en la posición de los conos de la nariz: del ratón 1-3, de izquierda a derecha. Acomode suavemente los ratones con el lado ventral hacia arriba dentro del área de imagen mostrada por el láser. Durante el alojamiento, verifique la identificación y la posición de los ratones. No forzar la entrada de ratones parcialmente anestesiados en los conos nasales.
  17. Coloque los portaobjetos divisorios entre los ratones y cierre la puerta del equipo de imagen.
  18. Ajuste la configuración de adquisición en la ventana de adquisición de software, de la siguiente manera:
    1. Para ratones no infectados, tiempo de exposición = 5 min / Binning = 'grande' o '16'
      (el conjunto de configuraciones más sensible matemáticamente para establecer los valores de umbral).
    2. Para ratones infectados en el modelo agudo: Tiempo de exposición = 2 min/ Binning = 'medio' o '4'.
    3. Para ratones infectados en el modelo crónico: Tiempo de exposición = 5 min/ Binning = 'grande' o '16'.
  19. Verifique si el tiempo de inyección de D-luciferina se realizó al menos 10 minutos antes de comenzar la adquisición. Si no es así, espere el período necesario para obtener las imágenes durante el pico de la señal de luciferasa (Figura 1B); de lo contrario, haga clic en Adquirir para comenzar la adquisición de imágenes.
  20. La ventana Etiquetas de imagen aparecerá después de que se inicie la imagen. Llene las casillas con la información apropiada sobre cada grupo, incluido el tiempo de inyección de luciferina, el experimento, la identificación de ratones, el punto de tiempo y cualquier otra información deseada que pueda ayudar a mantener un registro. Esta información se incluirá en el archivo de la tabla de mediciones.
  21. Verifique si se muestra la señal de advertencia Imagen saturada al final de la adquisición de imágenes. Las imágenes saturadas no son aceptables. Si esto sucede, disminuya la discretización y adquiera una nueva imagen. Toma notas para tener en cuenta en el análisis.
  22. Una vez obtenida la imagen, abra la puerta de la máquina de imágenes y gire los ratones a la vista dorsal (boca arriba hacia arriba). Vuelva a realizar la adquisición y etiquétela adecuadamente.
  23. Al final de esta adquisición de imágenes, apague el flujo anestésico. Retire suavemente los ratones de la cámara de imágenes y colóquelos en un recipiente.
  24. Registre el peso corporal de los ratones mientras observa la recuperación de la anestesia. Registre cualquier comportamiento anormal o anomalías corporales encontradas durante el procedimiento. Una vez que los ratones vuelvan a moverse, colócalos en sus jaulas.
    NOTA: Verifique la intensidad de BLI para cada imagen adquirida. Una vez finalizada la adquisición, la imagen bioluminiscente grabada y la fotografía se mostrarán en el software con una escala automática que no debe tenerse en cuenta. Establezca la escala definida en el análisis de datos (descrita a continuación) en la ventana Paleta de herramientas .

6. Análisis de datos

NOTA: El protocolo anterior se basa en software comercial de imágenes in vivo . Sin embargo, una versión sin licencia de software puede realizar el análisis más básico. Los detalles del software se pueden encontrar en la Tabla de materiales.

  1. Abrir archivos.
    1. Abra la carpeta que contiene los datos adquiridos de un determinado punto de tiempo de imagen seleccionando Menú Archivo > Navegador > Seleccione la carpeta (Figura 2A - Paso 1).
      NOTA: Se abrirá una nueva ventana en formato de tabla con todos los datos adquiridos guardados en el archivo elegido. Mostrará el signo de número de clic , que es la identificación de la imagen proporcionada automáticamente por el software (números de datos y horas), la información proporcionada por el investigador en la ventana de etiquetas de imagen durante la adquisición y la configuración de la adquisición. Todos estos datos ayudan a ordenar las imágenes que se pueden utilizar en el análisis, dado que no se deben utilizar imágenes saturadas.
    2. Seleccione varias filas relacionadas con las imágenes elegidas, incluidos los controles no infectados. Anote el ID de la imagen en el cuaderno del laboratorio junto con la información registrada durante la sesión de imágenes.
    3. Ensamble las imágenes seleccionadas haciendo clic en Cargar como grupo. Este procedimiento crea una nueva imagen de secuencia. Por lo tanto, es posible ajustar las características de todas las imágenes simultáneamente. Guarde la nueva imagen de secuencia en una nueva carpeta diferente de la utilizada en el paso 6.1 para facilitar el reanálisis de los datos sin procesar si es necesario.
    4. En la imagen de secuencia, identifique el agrupamiento utilizado para cada imagen haciendo clic en Opciones > Visualización > Seleccionar factor de agrupamiento (Figura 2A - Paso 2). El factor de agrupación adquirido se mostrará en la parte superior de cada imagen de la secuencia.
    5. Corrija todos los factores de discretización al mismo número. Para ello, haga doble clic en la imagen que desea ajustar. En la ventana Paleta de herramientas > sección Ajuste de imagen , elija el factor de agrupación adecuado (Figura 2A - Paso 3) - consulte el paso 5.18 para la elección del factor de agrupación. Realice este procedimiento en todas las imágenes divergentes.
      NOTA: Este procedimiento influye directamente en la cuantificación de BLI (Tabla 1) y se aborda con más detalle en la sección de Discusión.
  2. Establecer la escala.
    1. Distinga la señal bioluminiscente válida (por encima de 600 recuentos según el manual del dispositivo) en función del control no infectado. Para ello, haga doble clic en la imagen de los ratones no infectados. A continuación, en la esquina superior izquierda de la nueva ventana, seleccione la opción Recuentos en el campo Unidades . A continuación, ajuste la escala de colores para el valor mínimo de 600. La imagen resultante será la línea de base para establecer la escala mínima de radiancia.
    2. Con la ventana de secuencia activa, seleccione la opción Resplandor en el campo Unidades . Ajuste la escala de colores y la tabla de colores en la paleta de herramientas. Para eso, deshabilite la casilla Individual en el área Límites de escala de colores .
    3. Marque las casillas Escala logarítmica y Manual (Figura 2A - Paso 4). Establezca los números mínimos de la escala de acuerdo con el control no infectado (como se observa en el paso 6.8) y el área con la señal más alta como el máximo (como se muestra en la Figura 2A junto a las flechas).
      NOTA: La medición de la luz 2D in vivo es una cuantificación relativa. Se pueden encontrar diferentes valores de escala debido a las diferencias en la versión y la calibración de cada dispositivo. Por lo tanto, los valores demostrados en los resultados representativos no podrían ajustarse a otros experimentos realizados en otros dispositivos y, sin embargo, ser igualmente válidos según los controles internos (no infectados e infectados no tratados).
    4. Después de establecer la misma escala para todas las imágenes, haga doble clic en cada imagen, maximice la ventana y exporte la vista de la imagen en un formato de imagen (.jpg, .tiff, etc.) utilizando el botón Exportar gráficos , nombrando los archivos por treatment_miceID_time punto. (Figura 2A - Paso 5). Realice este procedimiento para todas las imágenes.
  3. Realizar mediciones.
    1. Elija cualquier imagen de la secuencia y haga doble clic en ella. En la ventana Paleta de herramientas > sección de herramientas de ROI , haga clic en el botón Cuadrado (Figura 2B- Paso 1) y dibuje un rectángulo que cubra todo el mouse.
    2. Haga clic en el borde del ROI creado y copie y pegue el mismo ROI para cada mouse (lo que da como resultado tres ROI en la imagen). Guarde los ROI haciendo clic en guardar en la sección Herramientas de ROI. Aplique los ROI guardados para todas las imágenes seleccionando la casilla Aplicar a la secuencia, luego haga clic en Cargar. Los ROI guardados se utilizarán para todos los ratones de todo el experimento.
    3. Ajuste la posición del ROI en cada ratón para que el animal se adapte mejor en el área de medición. Cuando todos los ratones estén etiquetados, haga clic en el botón Medir el retorno de la inversión (Figura 2B- Paso 2). Aparecerá la tabla de mediciones de ROI . Seleccione los tipos de medición: Radiancia; Atributos de imagen: todos los valores posibles; Dimensiones ROI: cm. Luego, haga clic en el botón Seleccionar todo , seguido del botón Copiar .
    4. Pegue los datos directamente en un software de análisis de tablas (hoja de cálculo). También puede exportar un archivo en formato .csv o .txt.
  4. Trabaja en los datos.
    1. En el software de análisis de tablas, organice los datos por grupos (tratamiento, control no infectado, no tratado, etc.).
    2. La carga del parásito se muestra como bioluminiscencia de todo el cuerpo. Por lo tanto, organice los datos para que coincidan con los valores de flujo total ventral y dorsal de los mismos ratones y súmelos.
    3. Calcular la media y la desviación estándar de los valores sumados considerando cada grupo (ej.: Tabla Suplementaria 1). Trace los datos en software de gráficos y estadísticas.
    4. Prepare un panel con imágenes bioluminiscentes en un software de presentación de imágenes o diapositivas. Coloque cada ratón en una columna y cada punto de tiempo en la fila para construir una matriz de eficacia del fármaco que facilite la visualización e interpretación de los datos.
      NOTA: Existe una opción para crear las imágenes directamente en el software de creación de imágenes sin realizar el paso 6.2.4 (Ver > ventana de diseño de imagen). Sin embargo, la interfaz y las herramientas del software limitan la organización de los datos.

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Figura 2: Pasos del análisis de datos desde el establecimiento de las escalas de la imagen hasta la cuantificación de la luminiscencia. (A) Vista del software Living Image para el procesamiento de datos de imágenes. Paso 1: Cargue los datos adquiridos como una secuencia utilizando la herramienta Navegador. Paso 2: Identifique el binning utilizado para cada adquisición (aparecerá en la parte superior de las imágenes individuales). Paso 3: Configure todas las imágenes de ratones infectados con el mismo factor de agrupación y aplique el factor de agrupación 16 para los ratones no infectados. Paso 4: Establezca la escala de colores manualmente en función de los ratones no infectados (flecha morada), que deben verse en la pantalla como no bioluminiscentes, y los ratones infectados y no tratados en los focos bioluminiscentes más altos (flecha roja), que deben verse en rojo. Paso 5: Para obtener una imagen libre de cualquier información escrita, haga doble clic en cada imagen y exporte la imagen usando el botón Exportar gráficos . (b) Herramientas de vista de regiones de interés (ROI). Paso 1: Dibuja un ROI que abarque completamente un ratón y copia y pega el mismo ROI para cada animal. Guarde el ROI ajustado y aplíquelo a todas las imágenes del experimento. Paso 2: Haga clic en el botón Medir el ROI para generar la tabla y exportarla como .csv o .txt. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

7. Procedimiento ex vivo

  1. Inyectar 150 mg/kg de D-luciferina i.p. en el ratón (una por ronda ex vivo ) y esperar 3 min. Anestesiar a los ratones con 100 mg/kg de ketamina y 10 mg/kg de xilacina i.p.
  2. En un gabinete de seguridad biológica, cuando el ratón no responde en absoluto al pellizco de las patas, corte la piel del ratón para exponer el peritoneo (sin abrir la cavidad del peritoneo) y el tejido de la axila del lado izquierdo. Proceda con la exanguinación cortando la arteria axilar y el vaso.
  3. Recoja la sangre con una pipeta Pasteur desechable. A continuación, perfundir 10 mL de 0,3 mg/mL de D-luciferina en solución de DPBS a través del ventrículo izquierdo del corazón.
  4. Coloque los órganos seleccionados en puntos preestablecidos en una placa de Petri y sumérjalos en una solución de d-luciferina de 0,3 mg/mL. Este procedimiento debe realizarse dentro de los 30 minutos como máximo.
  5. Adquiera la imagen luminiscente de los órganos extirpados (corazón, pulmones, timo, hígado, músculo cuádriceps, mesenterio, bazo, riñón, glándula suprarrenal, grasa visceral, esófago, estómago, intestino delgado, ciego, colon, cerebro, grasa subcutánea, útero, grasa gonadal, vejiga y membrana peritoneal) utilizando 5 min de tiempo de exposición y binning 16, dependiendo de la intensidad de la señal (las imágenes saturadas no son aceptables)22.
    NOTA: El mismo procedimiento debe realizarse en un ratón no infectado antes de los infectados para establecer el umbral.

Resultados Representativos

Utilizando un modelo de ratón adecuado basado en parásitos transgénicos que expresan constitutivamente luciferasa, es posible reproducir las características clave de la infección humana por T. cruzi causando un daño mínimo al huésped, lo que permite el seguimiento en tiempo real de los parásitos por BLI de cuerpo entero del huésped de manera longitudinal (de por vida), hasta varios meses12.

La Figura 3 muestra un experimento piloto que demuestra el curso temporal de la infección por CL Brener Luc::Neon desde el día 1 después de la infección hasta 150 ppp en ratones BALB/c. En los primeros 20 dpi, la carga parasitaria inferida por bioluminiscencia aumenta, típica del pico de parasitemia, seguido de una fuerte disminución de la carga parasitaria, debido al control inmunológico de los ratones. Así, la fase aguda de la infección se considera los primeros 50 dpi. La fase crónica se define cuando la infección alcanza una tasa bioluminiscente constante, de 100 a 150 ppp.

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Figura 3: Descripción del modelo. Cinética de la infección por Trypanosoma cruzi CL Brener Luc::Neon en ratones BALB/c (n = 11). Panel superior: imágenes bioluminiscentes ventrales y dorsales desde diferentes puntos temporales durante 150 días post-infección (dpi) con 1 x 10³ de tripomastigotes del torrente sanguíneo por inyección intraperitoneal. Escala del mapa de calor (en Log10) de la señal bioluminiscente en radiancia (p/s/cm2/sr). Código de color: Púrpura = 5 x 103; rojo = 1 x 107. Panel inferior: cuantificación de señales bioluminiscentes en flujo total (p/s) de ratones de cuerpo entero. Los datos se expresan como medias (líneas) y desviaciones estándar (regiones sombreadas). Los períodos definidos para las fases aguda y crónica de la infección en este modelo de ratón se resaltan en naranja. Los valores medios de luminiscencia de los ratones no infectados (n = 3) se muestran como umbral (línea gris claro). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los resultados terapéuticos también se pueden predecir, ya que las fases principales de la infección se reproducen bien en un modelo de ratón. Por lo tanto, BLI ahora se aplica a la ciencia traslacional a través de estudios de prueba de concepto que respaldan la toma de decisiones sobre el potencial de eficacia de los compuestos y la progresión en la línea de desarrollo10,27. En el modelo agudo de ratón, el tratamiento oral debe comenzar cuando la infección alcanza el pico de parasitemia (alrededor de 14-21 dpi), caracterizado por un alto número de tripomastigotes en el torrente sanguíneo (aproximadamente 1 x 105 tripomastigotes/mL - datos no mostrados) e infección sistémica. En la fase crónica, el tratamiento con ratones comienza a los 100 dpi, cuando la carga parasitaria es comparativamente mucho menor, con parasitemia subpatente estable.

Para demostrar la aplicación del protocolo descrito anteriormente en la evaluación de agentes antiparasitarios, comparamos la eficacia del tratamiento del benznidazol (BZ), el fármaco estándar utilizado para el tratamiento de la enfermedad de Chagas, y el posaconazol (Posa), un inhibidor de la 14α-desmetilasa (CYP51) que fracasó en los ensayos clínicos para la enfermedad de Chagas, y que también ha demostrado ser ineficaz como agente antiparasitario contra T. cruzi in vitro e in vivo, incluyendo en el modelo BLI descrito en este protocolo 13,18,28,29,30.

Para el modelo agudo de ratón, cohortes de 6 ratones por grupo fueron tratadas por vía oral con sonda nasogástrica31 durante 20 días con Posa a 20 mg/kg o BZ a 100 mg/kg, una vez al día. Los ratones también fueron tratados con BZ durante 5 días a 100 mg/kg una vez al día para evaluar el efecto de los tratamientos cortos. Después de la eliminación del compuesto (10 días después de finalizado el tratamiento), los ratones BLI negativos fueron inmunosuprimidos, una condición que promueve la recaída de la infección cuando no se logra una cura parasitológica (Figura 4A). El tratamiento con Posa dio como resultado una reducción del 99,49% ± 0,27% (media ± desviación estándar) en la carga de parásitos inferida por bioluminiscencia al final del tratamiento y se mantuvo en niveles similares de ratones no infectados durante el período de eliminación del compuesto del fármaco (excepto para el ratón #3, con una señal transitoria a 40 ppp, y el ratón #2, que demostró un punto BLI débil a 44 ppp). En comparación con el grupo no tratado, el tratamiento con BZ durante 20 días redujo entre un 100% ± un 0,01% la carga parasitaria inferida por bioluminiscencia al final del tratamiento. Por el contrario, el tratamiento corto con BZ durante 5 días condujo a una reducción del 99,98% ± del 0,03% a 19 ppp (similar al nivel umbral). Sin embargo, en este caso, la reducción de BLI fue transitoria y en las adquisiciones posteriores, todos los ratones presentaron reactivación de la infección (Figura 4B).

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Figura 4: Diseño del experimento de prueba de concepto y resultados obtenidos con imágenes de bioluminiscencia en el modelo agudo de la enfermedad de Chagas. (A) Gráfico esquemático del proceso de la línea de tiempo en el modelo de ratón de la enfermedad de Chagas aguda para estudios preclínicos para la evaluación de la eficacia del compuesto. Puntos negros: puntos de tiempo de imagen. Frasco de medicamento y barra naranja: inicio y fin del tratamiento, respectivamente. Icono de jeringa: inyecciones de ciclofosfamida. DPI: día después de la infección. Código de color: gris = infección no tratada; naranja = período de tratamiento; azul = fase de eliminación de compuestos; amarillo = período de inmunosupresión. (B) Curso temporal del tratamiento del Trypanosoma cruzi. Panel izquierdo: imágenes de bioluminiscencia ventral de ratones BALB/c (i) no tratados o tratados durante 20 días con (ii) posaconazol (Posa) a 20 mg/kg, (iii) benznidazol (BZ) a 100 mg/kg tratados durante 20 días y (iv) BZ a 100 mg/kg tratados durante 5 días con (n = 6/grupo). Todos los tratamientos se administraron por vía oral por sonda nasogástrica (10 mL/kg) una vez al día. El mapa de calor a escala Log10 indica la intensidad de la señal bioluminiscente desde el nivel más bajo (azul) hasta el más alto (rojo). Gráfico de la derecha: cuantificación de cuerpo entero de datos de imágenes de bioluminiscencia. Los datos se expresan como medias (líneas) y desviaciones estándar (regiones sombreadas). Clave: Matraz de medicamento: inicio del tratamiento (14 dpi); barra naranja: fin del tratamiento (18 ppp/33 ppp); inyectables de ciclofosfamida (a partir del día 44-53); Punto naranja: ratón analizado por procedimiento ex vivo ; § Datos excluidos debido a la fuga de D-luciferina en la orina. (C) Procedimiento ex vivo para la detección de focos de T. cruzi en órganos y tejidos. La clave de distribución de placas se presenta en la parte inferior de la figura (creada con BioRender.com: ZY26LG8AOF). La misma escala de radiación que se muestra en el panel vivo . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

En este modelo, el tratamiento antiparasitario puede reducir la carga parasitaria por debajo del límite de detección de BLI de 1000 parásitos. Por lo tanto, los ratones aparecen como BLI negativo10. Para asegurar que se ha logrado una cura parasitológica, es necesario promover la inmunosupresión de ratones mediante el tratamiento con ciclofosfamida29,32. Los ratones que aún tienen una carga parasitaria indetectable después del tratamiento farmacológico se convertirán en BLI positivos después de la inmunosupresión. Este efecto se muestra más ampliamente con el tratamiento con Posa en el modelo agudo, que promueve la recaída del parásito. En este experimento, el procedimiento ex vivo se realizó en ratones con la señal bioluminiscente más baja para evaluar el tropismo del tejido del parásito (Figura 4C). Los ratones no tratados muestran fuertes señales bioluminiscentes, especialmente en el tracto gastrointestinal (TGI) y los tejidos asociados, como la grasa visceral y el mesenterio. Además, la piel fue un sitio asociado con la persistencia del parásito. Los ratones tratados con Posa presentaron manchas bioluminiscentes de menor intensidad que estaban más restringidas al colon, el mesenterio y la grasa visceral. Por otro lado, en ratones tratados con un régimen de tratamiento curativo, como BZ 100 mg/kg durante 20 días, no se detecta ninguna señal bioluminiscente incluso bajo inmunosupresión. Por lo tanto, considerando que después de promover las condiciones para que la señal bioluminiscente se eleve por encima del nivel umbral de 1000 parásitos10, y aumentar la sensibilidad al exponer los órganos viscerales, se considera que BZ 100 mg/kg durante 20 días proporciona una cura estéril. La evaluación de la cura estéril fue validada previamente por diferentes técnicas 10,13,17,33,34.

Un diseño de estudio similar se aplicó al modelo crónico (Figura 5A), en el que los ratones (n = 6/grupo) comenzaron a ser tratados a los 100 días después de la infección. En este punto, se administraron Posa 20 mg/kg, BZ a 100 mg/kg o 10 mg/kg una vez al día por vía oral durante 20 días. Después del período de eliminación del fármaco, los ratones BLI negativos fueron inmunosuprimidos. Además, para evaluar la cura estéril, los ratones que aún eran BLI negativos al final de la fase de inmunosupresión se sometieron a análisis ex vivo .

En la infección crónica, el tratamiento con Posa a 20 mg/kg condujo a una disminución del 95,03% ± del 6,18% en la carga parasitaria inferida por bioluminiscencia al final del tratamiento y se mantuvo en niveles similares a los de los ratones no infectados durante el período de eliminación del fármaco. Después de la inmunosupresión, la mayoría de los ratones mostraron un nivel variable de señal y distribución de BLI (Figura 5B). El procedimiento ex vivo reveló que un ratón BLI negativo para todo el cuerpo tratado con Posa tenía una mancha bioluminiscente en el colon detectable mediante un examen ex vivo (Figura 5C).

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Figura 5: Diseño del experimento de evaluación de fármacos y resultados obtenidos en el modelo crónico de infección por Trypanosoma cruzi mediante imágenes de bioluminiscencia. (A) Gráfico esquemático del diseño experimental del modelo de ratón con enfermedad de Chagas crónica. Puntos negros: puntos de tiempo de imagen. Frasco de medicamento y barra naranja: inicio y fin del tratamiento, respectivamente. Icono de jeringa: inyecciones de ciclofosfamida. Dpi: día después de la infección. Código de color: Gris = infección no tratada; naranja = período de tratamiento; azul = fase de eliminación de compuestos; amarillo = inmunosupresión; lila = recaída. (B) Evaluación longitudinal de la eficacia del tratamiento en el modelo crónico de la enfermedad de Chagas. Panel izquierdo: BLI ventral de ratones BALB/c (i) no tratados o tratados durante 20 días con (ii) posaconazol (Posa) a 20 mg/kg; (iii) benznidazol (BZ) a 100 mg/kg, y (iv) BZ a 10 mg/kg (n = 6/grupo). Todos los tratamientos se administraron por vía oral por sonda nasogástrica una vez al día. Gráfico de la derecha: suma de los datos brutos de flujo total ventral y dorsal. Clave: matraz de medicamento: inicio del tratamiento (102 dpi); barra naranja: fin del tratamiento (121 dpi); Icono de barra y jeringa amarillas: Inyecciones de ciclofosfamida (a partir del día 131-142). Punto naranja: ratón analizado por procedimiento ex vivo . ! El ratón murió durante la anestesia. figure-representative results-13473 El ratón muestra anomalías abdominales. La escala del mapa de calor (Log10) indica la intensidad de bioluminiscencia en la unidad de radiancia desde el nivel más bajo (3 × 105 como azul) hasta el nivel más alto (1 × 107 como rojo). (C) Análisis ex vivo del tropismo de T. cruzi en tejido. Detección de bioluminiscencia de órganos extirpados de ratones inmunodeprimidos in vivo BLI negativos después del tratamiento con Posa y BZ a 100 mg/kg o ratones con la señal más baja en los grupos no tratados y BZ a 10 mg/kg. La clave de distribución de placas se muestra en la parte inferior de la figura (creada con BioRender.com: ZY26LG8AOF). La escala de radiancia es igual al panel in vivo . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El tratamiento con BZ a 100 mg/kg redujo la bioluminiscencia a niveles umbral (93,87% ± 2,14%) a 122 ppp y en adelante hasta el final del experimento. Considerando el análisis ex vivo , BZ logró una tasa de curación del 100% (6/6 ratones), ya que ningún ratón presentó un retorno de señal bioluminiscente incluso cuando se examinaron los órganos inmunodeprimidos e internos. Es decir, no hay recaídas. No obstante, el régimen de tratamiento con BZ con una concentración más baja resultó en una ligera reducción de la bioluminiscencia (85,95% ± 18,43%) pero no en curación, ya que los ratones continuaron mostrando focos de señal bioluminiscente detectables en todos los puntos temporales posteriores. Así, este modelo permite diferenciar cuantitativamente entre tratamientos ineficaces (posaconazol y tratamiento subóptimo con benznidazol) y tratamientos eficaces (dosificación óptima y duración del tratamiento con benznidazol).

Figura complementaria 1: Análisis previo a la infección de la expresión de luciferasa en la población de T. cruzi mediante la medición del gen reportero de fluorescencia mNeonGreen. Citometría de flujo de la proteína fluorescente mNeonGreen expresada constitutivamente por el parásito CL Brener Luc::Neon. Histograma normalizado del número de parásitos (eje Y) por intensidad de fluorescencia mNeonGreen (eje X). La leyenda interna muestra la cepa y la forma analizadas, la mediana de fluorescencia y el porcentaje de población de fluorescencia. Las líneas de compuerta se definen por la cepa CL Brener de tipo salvaje (WT) como control no fluorescente. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla complementaria 1: Ejemplo de tabla de análisis en la medición de BLI. Los datos brutos obtenidos de la cuantificación de imágenes de bioluminiscencia del día 19 post-infección en el modelo agudo se utilizaron en los resultados representativos que se muestran en la Figura 4B. Descripción de los grupos: Control como ratones no infectados (n = 3/grupo); vehículo como ratones infectados no tratados; posaconazol (Posa) a 20 mg/kg durante 20 días; benznidazol (BZ) a 100 mg/kg durante 20 días; BZ a 100 mg/kg tratado durante 5 días (n = 6/grupo). Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

La imagen de bioluminiscencia es un método innovador que permite la detección de un gen de informe utilizando un espectro visible e infrarrojo de radiación electromagnética. Por lo tanto, no hay necesidad de marcadores radiomarcados para rastrear su espécimen35. BLI es adecuado para modelos de roedores y otras especies pequeñas. Es muy útil para estudios preclínicos porque es más seguro y permite varias rondas de imagen, causando molestias mínimas en los animales. Además, la imagen in vivo es muy flexible debido a la posibilidad de combinar bioluminiscencia, fluorescencia y otras técnicas como la tomografía por emisión de positrones36.

Las imágenes ópticas se rigen por propiedades físicas ópticas, como la absorción y la dispersión. Todos los tejidos absorben y dispersan la luz de longitudes de onda distintas de manera diferente37. Un paso crítico es seleccionar un gen indicador sin tener en cuenta la longitud de onda emitida de la luz producida por la reacción química. Si bien el nivel de expresión de un gen reportero puede ser alto in vitro en los ensayos bioluminiscentes, es posible que no se logren los mismos niveles de expresión cuando se progresa al entorno in vivo. En este protocolo, utilizamos la versión optimizada para codones de Photinus pyralis luciferasa (PpyRE9H)38 desplazada al rojo para tripanosomátidos9, que emite luz a 617 nm, una de las más adecuadas para estudios in vivo 39. Las longitudes de onda superiores a 600 nm son menos absorbidas y dispersadas por los cromóforos endógenos del cuerpo, especialmente la hemoglobina y la melanina. Así, las luces rojas pueden ser transmitidas a través de varios centímetros de tejido, permitiendo que los fotones lleguen a la cámara CCD incluso desde el interior de los tejidos viscerales39,40.

Un área de preocupación en los entornos de imágenes es la falta de una comprensión completa de su función y efectos. El binning, una técnica de preprocesamiento, combina la información adquirida por detectores contiguos en un píxel más grande. Este proceso mejora la relación señal-ruido, reduciendo el ruido de fondo y mejorando la sensibilidad. Sin embargo, disminuye la precisión de la resolución espacial, lo que da como resultado una imagen pixelada41,42. Esta compensación es una consideración importante en su estrategia de imagen.

Basado en el Perfil de Producto Objetivo y el Perfil de Candidato Objetivo para la enfermedad de Chagas34, el estudio de prueba de concepto se centra en la sensibilidad para detectar T. cruzi y ayudar a establecer si un nuevo candidato a fármaco puede lograr una cura estéril (representada por la falta de recaída después de varias rondas de inmunosupresión). Por lo tanto, ejecutamos el BLI utilizando el factor de agrupamiento más alto sin sobresaturar la imagen. Cuando la imagen se sobresatura, se realiza una nueva adquisición utilizando un factor de agrupamiento más bajo. Durante el análisis, se aplica una corrección matemática a las imágenes que requirieron un binning diferente. De esta manera, los datos finales deben presentarse utilizando el mismo binning. En la Tabla 1 se muestran los diferentes valores obtenidos cuando se aplicaron factores de agrupación distintivos en la misma imagen y ROI.

Tabla 1: Influencia de la configuración de agrupación en la cuantificación de BLI. Cuantificación de tres ROIs en la imagen del modelo agudo (d13) y del modelo crónico (d118), analizados en diferentes factores de binning. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Debido al escenario actual de la enfermedad de Chagas en la clínica, los esfuerzos de descubrimiento de fármacos tienen como objetivo eliminar completamente los parásitos (cura parasitológica)27,34. Por lo tanto, el protocolo preclínico in vivo incluye enfoques que superan las limitaciones de la sensibilidad técnica de BLI. Uno de los enfoques es tratar a los ratones con ciclofosfamida para disminuir la respuesta inmunitaria que controla la carga parasitaria. Otra estrategia es disminuir la profundidad del tejido y eliminar las capas de músculo, piel y pelaje que obstruyen el camino de la luz hacia la cámara. A través del procedimiento ex vivo, se pueden detectar pequeñas manchas bioluminiscentes, revelando focos de parásitos por debajo del umbral BLI in vivo, como se muestra en la Figura 5C en el resultado ex vivo del ratón tratado por Posa.

El diseño de un experimento piloto para evaluar el modelo en sí y la dinámica de la infección es crucial para establecer un experimento preciso para la evaluación de la eficacia de los medicamentos antiparasitarios. Por lo tanto, el investigador podrá definir con anticipación la configuración adecuada de BLI y el curso del tiempo de infección. En un experimento exploratorio, una herramienta que puede ser útil para definir la configuración de adquisición es la 'Autoexposición'. Con esta herramienta, el investigador establece la prioridad de tres configuraciones (Tiempo de exposición, Binning y F/Stop) para obtener la mejor imagen posible. En particular, el investigador debe asegurarse de que las imágenes se adquieran dentro del rango dinámico de la cámara CCD, sin sobresaturación ni subexposición, lo que se puede verificar a través de los límites mínimo y máximo de la escala y la función de exposición automática (Menú Editar > Preferencias > Adquisición de pestañas > Autoexposición de pestañas). En este protocolo, la apertura de la cámara se estableció en el valor máximo (F/Stop: 1), y se definieron diferentes tiempos de exposición y factores de agrupación para modelos agudos y crónicos. Estos ajustes dan previsibilidad al tiempo para realizar diferentes rondas de imágenes simultáneamente. Teniendo en cuenta que el método reportero se basa en una reacción enzimática, tanto la biodistribución del sustrato en el ratón como la cinética de la luciferasa influyen en la señal bioluminiscente y, por tanto, en la cuantificación de la infección (Figura 1B). En consecuencia, la adquisición de imágenes en diferentes momentos de la cinética enzimática introduce una variabilidad de datos que no se puede tener en cuenta ni corregir y afecta al cálculo del flujo total (fotones/segundo) o de la radiación (fotones/segundo/cm2/esteradiano). Además, la infección por T. cruzi muestra un posicionamiento espacial dinámico en ratones (diferentes áreas y tejidos, profundidad y carga parasitaria). Por lo tanto, establecer un valor de los recuentos a adquirir podría pasar por alto las fuentes de señal más débiles (bajo número de parásitos en un determinado punto más profundo del tejido) si la fuente de otra señal más fuerte cumple con los criterios de autoexposición definidos.

Una característica complicada del software Living Image es mostrar la imagen adquirida en una escala de color automática. No existe la opción de preajustar la escala para exhibir automáticamente una imagen adquirida completamente nueva de acuerdo con los valores de escala seleccionados (consulte el paso del protocolo 6.2). Esta situación obliga al investigador a cambiar manualmente las imágenes una por una a los valores máximo y mínimo elegidos. Como consecuencia, los usuarios sin experiencia y no bien entrenados no tienen la lectura adecuada durante la sesión de adquisición, y podrían inducir a error a los datos o perder información importante en ese momento. Para eso, el experimento piloto es beneficioso.

Una de las preguntas más comunes sobre el diseño del experimento de prueba de concepto es cómo elegir la duración del tratamiento y la dosis. En el caso de las nuevas entidades químicas, estos parámetros suelen definirse por la potencia y la selectividad del compuesto in vitro, en combinación con los datos generados por el metabolismo y la farmacocinética del fármaco (DMPK) y los estudios de tolerabilidad realizados antes de las pruebas de eficacia in vivo. En resumen, una vez identificados los compuestos capaces de matar selectivamente al parásito en el interior de las células, se realizan in vitro los primeros experimentos ADME (absorción, distribución, metabolismo y excreción) para estimar la solubilidad acuosa, la permeabilidad celular y la estabilidad metabólica de los compuestos, entre otros parámetros. Si los compuestos muestran un buen equilibrio de propiedades in vitro (generalmente definidas en los perfiles de candidatos objetivo), entonces estos candidatos progresan a estudios de farmacocinética (PK) in vivo en ratones sanos, que describen la exposición al compuesto en la sangre (y posiblemente también en los tejidos) y proporcionan una idea general de la tolerabilidad a diferentes niveles de dosis17. 34,43. Idealmente, el objetivo de la evaluación de la farmacocinética en la mayoría de las enfermedades infecciosas es determinar la viabilidad de alcanzar concentraciones plasmáticas libres (corregidas por la unión a proteínas plasmáticas) que estén por encima de las concentraciones EC50/EC90 44 -la concentración efectiva que mata o al menos inhibe el crecimiento del 50% o el 90% de los parásitos, respectivamente- durante un período de tiempo suficientemente largo. Si se logra una exposición suficiente a un cierto nivel de dosis, entonces este régimen se puede utilizar durante los estudios de eficacia utilizando el modelo BLI de Chagas. En el caso de los estudios de reposicionamiento de fármacos, se debe disponer de datos farmacocinéticos in vitro e in vivo. Un buen comienzo para el reperfilado de fármacos son las bases de datos químicas como PubChem45, que proporcionan datos reconocidos que se pueden convertir en ratones utilizando el escalado alométrico46 para estimar los regímenes de tratamiento seguros y no tóxicos que se van a probar. Sin embargo, no siempre es así. Los estudios de PK siguen siendo un campo pasado por alto en la ciencia académica, y pocas empresas farmacéuticas publican sus resultados de PK. La comunidad científica del descubrimiento de fármacos recomienda incluir la evaluación farmacocinética in vivo junto con los ensayos de eficacia de los fármacos (farmacodinamia)47. Por lo tanto, las imágenes preclínicas son compatibles con las mediciones de compuestos simultáneamente, y este enfoque asociado mejora la solidez de los datos.

Además, se controla la manipulación, el peso y las condiciones de salud de los ratones durante todo el experimento. Los signos de toxicidad y los efectos secundarios, como encorvamiento, temblores, pérdida del equilibrio, falta de voluntad para moverse, renuencia a comer o beber, postración o cualquier otra anomalía presente en el grupo o por condiciones individuales del ratón, deben registrarse e informarse en estudios preclínicos. Uno de los objetivos de las imágenes ópticas es garantizar el bienestar de los animales. Por lo tanto, los criterios de valoración humanitarios deben aplicarse en ratones con signos de dolor descritos en la escala 'Grimace48. Además, los ratones se pesaron semanalmente durante la adquisición de BLI y, con mayor frecuencia, durante la dosificación del fármaco y el tratamiento con CTX. Siguiendo las normas de bienestar animal, los ratones que pierden más del 20% de su peso corporal deben ser sacrificados humanitariamente de inmediato.

El modelo bioluminiscente de T. cruzi es ahora el modelo experimental de última generación para el descubrimiento y desarrollo de nuevos tratamientos para la enfermedad de Chagas. Un modelo que replica las características clave de la infección por T. cruzi y la enfermedad de Chagas49, permitiendo el monitoreo en tiempo real de la parasitemia y la diferenciación de compuestos con variados perfiles de eficacia asociados a modos de acción conocidos. El BLI es una técnica que mejora la asertividad en la identificación de tejidos infectados. Permite la selección precisa de los tejidos infectados para ser utilizada en una amplia gama de enfoques, incluyendo todos los métodos clásicos ya aplicados en la investigación de T. cruzi 50,51. Además, permite a los investigadores explorar tecnologías de vanguardia y desarrollar otras nuevas33. Además, BLI proporciona una mejora del bienestar animal y un uso más racional de acuerdo con los principios de las 3R10,35, todo a la vez.

Varios grupos de investigación centrados en las enfermedades tropicales desatendidas se encuentran en países donde no se dispone de dispositivos de imagen in vivo. Para superar el escenario actual, nuevas redes internacionales como Global BioImaging y sus consorcios asociados promueven acciones para proporcionar acceso abierto a las instalaciones centrales de imagen y mejorar la formación del personal y de los científicos de imagen52,53. Estas iniciativas, junto con protocolos de usuario amigables como este, pueden proporcionar condiciones que democraticen las tecnologías de alta gama para todos los investigadores. La implementación de este método en el descubrimiento preclínico de fármacos ofreció una sólida lectura de eficacia y un valor predictivo de los resultados clínicos, facilitando el descubrimiento de fármacos para la enfermedad de Chagas.

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Agradecimientos

Los autores agradecen a Amanda Franscisco, John Kelly y Fanny Escudié por proporcionar capacitación y apoyo en BLI en ensayos de eficacia de medicamentos, John Kelly y Simone Calderano por proporcionar parásitos, y Gabriel Padilla por apoyar con los estudios en animales. A.C.S recibió una beca CAPES PSDE para formarse en la London School of Hygiene and Tropical Medicine (Reino Unido). Los autores también desean agradecer a la Plataforma de Citometría de Flujo e Investigación en Imágenes (FLUIR) del Centro de Investigación Científica de la Universidad de São Paulo (CEFAP-USP) por el apoyo técnico en el análisis de los equipos IVIS Spectrum, y al Laboratorio de Genética y Control Sanitario ICB-USP por los ensayos de posexperimentación para el control de calidad de ratones como libres de patógenos específicos. Este proyecto fue financiado por DNDi. DNDi agradece a sus donantes, públicos y privados, que han proporcionado fondos para todas las actividades de DNDi desde su creación en 2003. Una lista completa de los donantes de DNDi se puede encontrar en https://dndi.org/about/donors/.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
BD LSRFortessa™ X-20 Cell AnalyzerBD Biosciences
Weighing Balance (animal facility)Available from several suppliers
IVIS Spectrum In Vivo Imaging SystemRevvity (former PerkinElmer)
FlowJ Software v10.7.1BD Biosciences
Living Image Software for Spectrum v4.7.1Revvity (former PerkinElmer)License Free Analysis Software called 'Aura Imaging' could be used for the most basic features provided by Spectral Instruments Imaging (Bruker company) (https://spectralinvivo.com/software/)
Microsoft Office softwareMicrosoft
GraphPad Prism v8.4.0GraphPad Software Inc.
DMEM Low GlucoseVitrocellD0025
Sodium bicarbonateSigma-AldrichS5761-500G
Foetal Bovine Serum (FBS)Gibco16000-044
Penicillin-StreptomycinGibco15140-122
Trypsin 0.5% EDTAGibco25300-062
LIT mediumIn house
Hygromycin B (50 mg/mL)Gibco10687010
Grace′s Insect MediumSigma-Aldrich G9771
HEPESSigma-Aldrich 54457
IVISBrite d-luciferin potassium saltRevvity (former PerkinElmer)122799Also could be used: VivoGlo Luciferin, in vivo grade (Promega/P1043); D-Luciferin, Monopotassium Salt (Thermo Scientific/88293) or PierceD-Luciferin, Monosodium* Salt (Thermo Scientific/88291); D-Luciferin, Potassium Salt (GoldBio/LUCK or eLUCK); D-Luciferin, Sodium* Salt (GoldBio/LUCNA or eLUCNA) *Sodium or potassium salt differences relies minimal chances on solubility, however do not affect in vivo performance. 
DPBSGibco21600-044
Cyclophosphamide (CTX)Sigma-AldrichC0768-5g
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD5879
(Hydroxypropyl)methyl cellulose (HPMC)Sigma-Aldrich09963-25G
Benzyl alcoholSigma-Aldrich402834
Tween 80Sigma-Aldrich P1754-1L
BenznidazoleELEA
Posaconazole (Noxafil commercial formulation)Schering-Phough
GiemsaAvailable from several suppliers
gavage needle (stainless-steel straight) - 22GAAton CA2003
1 mL Syringe and 31G needleAvailable from several suppliers
1 mL Syringe and removable 26G needleAvailable from several suppliers
1 mL Syringe and removable 24G X¾ needleAvailable from several suppliers
Sterile Syringe Filter 0.2 µmAvailable from several suppliers
A4 Matte Black paper 120gr or thickerPaper Color/ Canson (Available from several suppliers)
aluminum foilAvailable from several suppliers
Neubauer chamberAvailable from several suppliers

Referencias

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