JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

وصفنا بروتوكولا لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة من منطقة ما تحت المهاد (أو هياكل الدماغ الصغيرة المكافئة) باستخدام فرز الخلايا المنشط مغناطيسيا (MACS) ، في وقت قصير نسبيا. يمكن استخدام الخلايا الدبقية الصغيرة تحت المهاد المصنفة بواسطة MACS للتحليل خارج الجسم الحي ويمكن طلاءها لإجراء فحوصات في المختبر .

Abstract

الخلايا الدبقية الصغيرة ، باعتبارها الضامة المقيمة في الدماغ ، ضرورية للحفاظ على توازن الدماغ. إنها تشكل الدوائر العصبية أثناء التطور ، وتمسح بيئتها بحثا عن الحطام أو الخلايا الميتة ، وكذلك تستجيب للعدوى والإصابة في الدماغ ، من بين العديد من الوظائف الأخرى. ومع ذلك ، لم يتم تحديد دورها المهم في النمو العصبي واللدونة المشبكية والفيزيولوجيا المرضية بشكل كامل ، مما يسلط الضوء على الحاجة إلى مزيد من التحقيق. للحصول على فهم أكثر شمولا لدور الخلايا الدبقية الصغيرة في هذه العمليات ، نحتاج إلى عزل الخلايا الدبقية الصغيرة وتوصيفها وراثيا واستقلابيا ووظيفيا. ومع ذلك ، فإن عزل الخلايا الدبقية الصغيرة من الفئران البالغة ، وخاصة من هياكل الدماغ الصغيرة ، يمثل تحديا لأنها تمثل نسبة صغيرة من إجمالي خلايا الدماغ ، وغالبا ما يكون إنتاج الخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة منخفضا جدا. هنا ، يسمح لنا العزل المغناطيسي للخلايا الدبقية الصغيرة باستخدام ميكروبيدات CD11b + بفرز الخلايا الدبقية الصغيرة من منطقة ما تحت المهاد لدماغ فأر بالغ حديث النفاذ. تسمح لنا الطريقة الحالية بتحقيق نقاء وعائد مرتفعين نسبيا في فترة قصيرة مع الحفاظ على صلاحية الخلية.

Introduction

تتوافق الخلايا الدبقية الصغيرة مع 5-20٪ من إجمالي الخلايا العصبية وهي الخلايا الدبقية الوحيدة التي تنشأ من أسلاف الكريات الحمر في كيس الصفار وتبدأ في استعمار الدماغ النامي حول اليوم الجنيني E9.5 1,2. إنها خلايا طويلة العمر مع القدرة على الخضوع للتجديد الذاتي ببطء ، بشكل مستقل عن الخلايا المشتقة من نخاع العظام3. باعتبارها بعض الخلايا الأكثر ديناميكية ، فهي قادرة على اكتساب أنماط ظاهرية متنوعة استجابة للإشارات السياقية والبيئية 2,4. من بين الإشارات القادرة على تعديل نشاطها ، فإن تلف الجهاز العصبي المركزي (CNS) ، والنشاط العصبي ، وكذلك العناصر الغذائية ، هي الأكثر فعالية. أظهرت مجموعة متزايدة من الأبحاث الدور المحوري للخلايا الدبقية الصغيرة في الإصابة والأمراض التنكسية العصبية والسمنة2،5،6. ومع ذلك ، فإن الدور الدقيق للخلايا الدبقية الصغيرة في كل من العمليات الفسيولوجية والفيزيولوجيا المرضية يتطلب مزيدا من الدراسة. لذلك ، فإن توصيفها النسخي والأيضي والوظيفي في ظل ظروف مختلفة له أهمية كبيرة ويتطلب عزلها ، لأن الدراسات في الموقع مناسبة لتوطين الحمض النووي والحمض النووي الريبي والبروتين والمقارنات النوعية ، وكذلك التوصيف المورفولوجي للخلايا الدبقية الصغيرة.

هناك العديد من التقنيات الموصوفة لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة ، من بينها طريقة التدرجPercoll 7 ، وفرز خلايا قياس التدفق الخلوي (FACS) 8 ، وفرز الخلايا المنشط مغناطيسيا (MACS). يعتمد اختيار الطريقة المناسبة على أهداف الدراسة ومستوى النقاء المطلوب للتطبيقات النهائية. إن عزل الخلايا الدبقية الصغيرة النقية عن دماغ الفأر البالغ ، وخاصة من هياكل الدماغ الصغيرة مثل منطقة ما تحت المهاد ، يمثل تحديا بسبب العدد المحدود من الخلايا الدبقية الصغيرة. يسمح التفكك اللطيف الآلي لمنطقة ما تحت المهاد باستخدام تقنية Miltenyi بتنقية محصول الخلايا الدبقية الصغيرة المرتفع نسبيا في وقت قصير مع القدرة على متابعة ما يصل إلى ثماني عينات في نفس الوقت باستخدام جهاز فك ارتباط OCTO لطيف MACS.

يتبع تجانس الأنسجة تنقية الخلايا الدبقية الصغيرة باستخدام تقنية MACS القائمة على العمود وحبات CD11b + فائقة المغناطيسية بحجم النانو. لذلك ، تتم معالجة جميع العينات بنفس الطريقة تماما مما ينتج عنه خلايا CD11b + سليمة. من الجدير بالذكر أن CD11b ليس موجودا حصريا في الخلايا الدبقية الصغيرة ولكن يتم التعبير عنه أيضا في خلايا النسب النخاعية الأخرى ، بما في ذلك الضامة والوحيدات9. للحد من ذلك ، يضمن تروية الدماغ بمحلول ملحي بارد قبل استخراج منطقة ما تحت المهاد (انظر خطوة البروتوكول 2.6) القضاء على معظم الخلايا النخاعية ، تاركا فقط جزءا صغيرا محتملا من الضامة المقيمة أو تلك الملتصقة بالأوعية الدموية. تشكل الضامة المقيمة والوحيدات في الجهاز العصبي المركزي المستقر السليم نسبة صغيرة من إجمالي الخلايا المناعية في الدماغ (~ 10٪ و <2٪ على التوالي)10,11. لذلك ، عندما يتم فرز خلايا الدماغ باستخدام حبات CD11b + ، يمكن عزل كل من الخلايا الدبقية الصغيرة والبلاعم ، على الرغم من أن الغالبية العظمى هي الخلايا الدبقية الصغيرة.

يتيح لنا العائد النهائي للخلايا الدبقية الصغيرة والحفاظ على صلاحيتها إجراء فحوصات خارج الجسم الحي ، وكذلك في المقايسات المختبرية ، مع ميزة تحليل مناطق معينة من الدماغ ذات الأهمية. أظهرت أحدث الأدلة أن مجموعة الخلايا الدبقية الصغيرة غير متجانسة للغاية ، وتمثل التعبير الجيني الخاص بالمنطقة والخصائص المورفولوجية والوظيفة2،12،13. لذلك ، يهدف البروتوكول الحالي إلى عزل وتحليل الخلايا الدبقية الصغيرة البالغة بطريقة خاصة بالمنطقة. في الواقع ، يمكننا توصيف الملامح الجينية والنسخية والانتقالية للخلايا الدبقية الصغيرة تحت المهاد للبالغين باستخدام طرق مثل RT-qPCR وتسلسل الحمض النووي الريبي ، بالإضافة إلى إجراء التحليل الوظيفي في المختبر .

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

أجريت جميع التجارب على الموصوفة في امتثال صارم لتوصيات الاتحاد الأوروبي (2013/63 / EU) وتمت الموافقة عليها من قبل اللجنة الأخلاقية المحلية لجامعة بوردو (CEEA50) ووزارة التعليم العالي والبحث والابتكار الفرنسية (ملخص غير تقني للمشروع المعتمد NTS-FR-619193 v.1 ، 23-12-2022).

يتم تنفيذ البروتوكول التالي على الفئران البالغة C57BL / 6 بمتوسط عمر 2-4 أشهر. ومع ذلك ، يمكن إجراؤه في جميع أعمار الفئران وظروفها مع الأخذ في الاعتبار أن مشهد الخلايا المناعية للجهاز العصبي المركزي قد يتغير ويمكن زيادة النسبة المئوية للبلاعم المقيمة والوحيدات (على سبيل المثال في الشيخوخة والتنكس العصبي).

1. إعداد الحلول

ملاحظة: تتم الإشارة بدقة إلى وحدات التخزين والحلول التالية إلى عزل خلايا Cd11b +.

  1. حدد الحجم الإجمالي ل D-PBS / 0.5٪ مصل البقر الزلال (BSA) المطلوب بناء على عدد العينات. قم بإعداد المحلول باستخدام D-PBS المتاح تجاريا مع الكالسيوم والمغنيسيوم ومسحوق BSA (انظر جدول المواد).
  2. قم بإعداد أنابيب التفكك الموسومة (C-Tubes) واملأ كل منها ب 1900 ميكرولتر من المخزن المؤقت Z ، المتوفر في مجموعة تفكك أنسجة المخ البالغة (انظر جدول المواد). قم بإذابة الإنزيمات واحتفظ بها على الجليد ، جنبا إلى جنب مع جميع المخازن المؤقتة المطلوبة في الخطوات التالية.
  3. قم بإعداد ووضع الحجم المناسب من 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) (انظر جدول المواد) اللازم للتروية (الخطوة 2.6) على الجليد. احسب 10 مل لكل بالإضافة إلى 10٪ زائدة.
  4. لتحليل RT-qPCR ، قم بإعداد المخزن المؤقت qPCR لكل عينة: 2.5 ميكرولتر من ثيوجلسرين + 250 ميكرولتر من محلول التحلل ، باستخدام مجموعة متاحة تجاريا لتنقية الحمض النووي الريبي (انظر جدول المواد).
  5. لتحديد كمية البروتين ، قم بإعداد محلول التحلل عن طريق تخفيف كوكتيل مثبطات الفوسفاتيز وكوكتيل مثبط الأنزيم البروتيني 1: 100 في مخزن مؤقت لاستخراج الثدييات (انظر جدول المواد).
  6. للكشف عن أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ومقايسة البلعمة ، قم بإعداد 1x HBSS من 10x HBSS المتاح تجاريا (انظر جدول المواد). بعد ذلك ، قم بإعداد المخزن المؤقت FACS عن طريق إضافة 0.2٪ BSA إلى 1x HBSS.

2. إزالة الدماغ

  1. تخدير بجرعة 20 مغ/كغ من الزيلازين؛ ثم ، القتل الرحيم للفأر بجرعة زائدة من 400 مجم / كجم من بنتوباربيتال ووضعه في صينية تشريح.
    ملاحظة: يمكن أن تعمل أيضا تركيبات مخدرة أخرى للقتل الرحيم للحيوان.
  2. املأ حقنة سعة 10 مل ب 10 مل من الثلج البارد 1x PBS وأرفقها بإبرة فراشة 21 جرام.
  3. بمجرد تخدير الفأر تماما (تحقق عن طريق قرص الكفوف لضمان عدم الاستجابة) ، توقف التنفس ، والقلب في حالة رجفان ، خيمة الجلد بالملقط وفتح التجويف الصدري بالمقص ، على مستوى الأضلاع الأخيرة والقص.
  4. استخدم المقص لعمل قطع عميق على طول جانبي القفص الصدري باتجاه الجزء العلوي من القفص الصدري لكشف القلب.
  5. أدخل إبرة 21 G في الجزء البعيد من البطين الأيسر (تأكد من أن ما يقرب من 1/3 من الإبرة داخل البطين). قم على الفور بعمل شق من خلال الأذين الأيمن باستخدام المقص.
  6. قم ببث 10 مل من الثلج البارد 1x PBS لتنظيف الدماغ من أي خلايا مناعية منتشرة.
    ملاحظة: افحص الدماغ بصريا للتأكد من نظافته وأدائه جيدا.
  7. قطع رأس الماوس ، واستخراج الدماغ بعناية ، ووضعه على طبق بتري مملوء بالثلج ومغطى بورق الألمنيوم.
    ملاحظة: يساعد طبق بتري والرقائق في رؤية قطع الدماغ. من المفيد الحفاظ على بيئة باردة أثناء تقطيع قطع الدماغ للحد من الأنشطة الأيضية.
  8. عزل ما تحت المهاد باستخدام ملقط وتقطيعه إلى قطع صغيرة مع شفرات الحلاقة.
    1. لتحديد وتشريح منطقة ما تحت المهاد ، ضع الدماغ رأسا على عقب بحيث تكون القشرة بطنية وتكون منطقة ما تحت المهاد مرئية ظهريا على السطح العلوي. افصل منطقة ما تحت المهاد ، التي تقع في الجزء السفلي من الدماغ على جانبي البطين الثالث ، باستخدام ملقط منحني. متوسط وزن ما تحت المهاد من الفئران البالغة C57BL / 6 هو 15 ملغ.
      ملاحظة: يجب أن تكون قطع الدماغ صغيرة قدر الإمكان (<0.5 مم). يعد التقطيع إلى قطع صغيرة خطوة حاسمة لأنه يسمح بتفكك أفضل وإنتاجية أعلى للخلايا.
  9. اجمع قطع منطقة ما تحت المهاد في أنابيب التفكك (C-Tubes) المملوءة مسبقا ب 1900 ميكرولتر من Buffer Z (الخطوة 1.2).
    ملاحظة: للحصول على عائد جيد من الخلايا الدبقية الصغيرة يكفي لإجراء المقايسات ، قم بتجميع ما لا يقل عن اثنين (لتحديد كمية البروتين) أو ثلاثة (ل qPCR و RNAseq) تحت المهاد لكل أنبوب.

3. تفكك الأنسجة

ملاحظة: يجب تنفيذ جميع الخطوات على الجليد. لا دوامة تعليق الخلية في أي خطوة ؛ امزج بعناية فقط مع ماصة سعة 1000 ميكرولتر.

  1. تحضير مزيج الإنزيم 2 وفقا للجدول 1 (حساب الحجم الكلي لجميع الأنابيب + 10 ٪ الزائدة). في كل أنبوب C ، أضف 50 ميكرولتر من الإنزيم الموجود في المزيج 1 (انظر الجدول 1) و 30 ميكرولتر من مزيج الإنزيم 2. يتم توفير جميع الإنزيمات في مجموعة تفكك أنسجة المخ البالغة (انظر جدول المواد).
  2. أغلق الأنابيب C وضعها رأسا على عقب في جهاز التفكك باستخدام أقواس التسخين وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. قم بتشغيل البرنامج 37C_ABDK_02.
  3. قم بإعداد أنابيب مفاجئة سعة 15 مل (انظر جدول المواد) مع مصافي 70 ميكرومتر فوقها. بلل المصفاة ب 2 مل من D-PBS.
  4. عند انتهاء برنامج التفكك / الهضم ، أفرغ الأنبوب C على المصفاة وخدشه بطرف 200 ميكرولتر لتقليل فقد الخلايا عن طريق زيادة ترشيح الخلايا وتقليل التصاق تجانس الأنسجة على الفلتر.
  5. اغسل الأنبوب ب 2 × 5 مل من D-PBS ، وأفرغ الغسلات على المصفاة ، وخدشها بطرف 200 ميكرولتر بين الغسالات.
  6. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية ونضح المادة الطافية تماما. أعد تعليق حبيبات الخلية بعناية بالحجم المناسب من D-PBS البارد وفقا للجدول 1.
  7. امزج على الفور بعناية مع 450 ميكرولتر من كاشف تدرج الكثافة (محلول إزالة الحطام ، انظر جدول المواد) وقم بالتراكب برفق شديد مع 2 مل من D-PBS البارد (انظر الجدول 1).
    ملاحظة: للحصول على طبقات تدرج الكثافة المختلفة ، يجب تراكب D-PBS برفق قطرة قطرة ، بأقل "إزعاج" ممكن ، 1 مل في المرة الواحدة باستخدام ماصة 1 مل.
  8. جهاز طرد مركزي عند 3000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية مع تسارع بطيء وفرامل بطيئة (إذا كان 9 يعادل ممتلئا ، فاستخدم 5).
  9. يتم تشكيل ثلاث مراحل. نضح المرحلتين العلويتين تماما وتجاهلهما. تأكد من عدم نضح المرحلة السفلية الثالثة.
  10. املأ 1800 ميكرولتر من D-PBS البارد واقلب الأنبوب برفق 3 مرات.
  11. جهاز طرد مركزي عند 1000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية مع تسارع كامل وفرامل كاملة ونضح المادة الطافية تماما. أعد تعليق حبيبات الخلية بعناية عن طريق السحب ببطء لأعلى ولأسفل باستخدام 2 مل من D-PBS / BSA.

4. العزل المغناطيسي لخلايا CD11b +

  1. أجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية ونضح المادة الطافية تماما. أعد تعليق حبيبات الخلية بعناية في 90 ميكرولتر من المخزن المؤقت D-PBS / BSA.
  2. أضف 10 ميكرولتر من خليط الميكروبيدات CD11b واخلطه جيدا مع الماصة.
  3. احتضان لمدة 15 دقيقة في 2-8 درجة مئوية في الثلاجة ، وليس على الجليد ؛ غسل الخلايا بإضافة 1 مل من D-PBS / BSA وأجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية ؛ نضح الطافي تماما. أعد التعليق بعناية في 500 ميكرولتر من D-PBS / BSA.
  4. قم بتشغيل برنامج POSSEL2 على الفاصل باتباع الإرشادات التي تظهر على الشاشة. ضع الأعمدة الصغيرة (انظر جدول المواد) في المجال المغناطيسي.
    ملاحظة: يمكن اختيار أعمدة صغيرة أو كبيرة لفرز الخلايا المغناطيسية ، وفقا لمتوسط عدد الخلايا المتوقعة. الأعمدة الصغيرة لها سعة تصل إلى 1 × 107 خلايا مسماة وأعمدة كبيرة تصل إلى 1 × 108. عند عزل الخلايا عن الهياكل الصغيرة ، مثل منطقة ما تحت المهاد ، ينصح باستخدام أعمدة صغيرة. تختلف أحجام الكواشف عند استخدام أعمدة كبيرة (انظر تعليمات الشركة المصنعة).
  5. بلل الأعمدة (انظر جدول المواد) ب 500 ميكرولتر من D-PBS / BSA. إذا كانت هناك حاجة إلى الكسر السالب للخلايا (CD11b-) لمزيد من التحليل ، فضع لوحة تجميع أسفل الأعمدة ثم ضع تعليق الخلية في الأعمدة.
  6. نفذ ثلاث خطوات غسيل عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من D-PBS / BSA في وقت واحد في العمود ، في كل مرة تنتظر مرور المخزن المؤقت عبر العمود.
    ملاحظة: من المهم منع جفاف الجزء العلوي من العمود ، لذلك ينصح بعدم الانتظار حتى يمر كل المخزن المؤقت.
  7. نقل إجمالي النفايات السائلة لجزء CD11b من آبار لوحة التجميع إلى أنابيب سعة 15 ملليلتر.
  8. قم بإزالة العمود من الفاصل ، وضعه على أنبوب سعة 5 مل ، وماصة 1 مل من D-PBS / BSA في العمود.
  9. اغسل على الفور جزء الخلية المسمى مغناطيسيا عن طريق تطبيق المكبس المرفق مع العمود بإحكام.
  10. في النهاية ، عد خلايا CD11b + باستخدام مقياس الدم أو أي طريقة أخرى ؛ نتوقع ~ 15000 خلية لكل منطقة تحت المهاد.
  11. قم بطرد مركزي تعليق الخلية عند 300 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية وتخلص من المادة الطافية.

5. التحليلات

  1. لتحليل RT-qPCR ، أعد تعليق كريات الخلية باستخدام المخزن المؤقت qPCR (للتحضير ، انظر الخطوة 1.3) وقم بتخزين الأنابيب عند - 80 درجة مئوية حتى استخراج mRNA. عزل إجمالي الحمض النووي الريبي ، ثم معالجته وتحليله باتباع إرشادات MIQE14. أخيرا ، قم بتوليف cDNA وإجراء qPCR باستخدام جهاز RT-PCR. انظر جدول المواد لجميع المجموعات المتاحة تجاريا المستخدمة.
  2. لتحديد كمية البروتين ، اغسل كريات الخلية باستخدام D-PBS (بدون BSA) على الأقل 2x للتخلص من BSA. ثم ، أعد تعليق كريات الخلية من اثنين من منطقة ما تحت المهاد مع 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل. تابع القياس الكمي للبروتين باستخدام مجموعة فحص البروتين (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: لقد اتبعنا تعليمات الشركة المصنعة15 لتحديد البروتينات لإجراء فحص نشاط كينازات سيرين / ثريونين.
  3. للكشف عن أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) في الخلايا الدبقية الصغيرة ، أعد تعليق الحبيبات في 1x HBSS. عالج الخلايا باتباع بروتوكول الشركة المصنعة لمجموعة فحص قياس التدفق الخلوي (انظر جدول المواد). بعد ذلك ، أعد تعليق الخلايا المعالجة في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS (للتحضير ، انظر الخطوة 1.5) وقم بإجراء FACS للكشف عن الخلايا المجهدة بالتأكسد.
  4. لمقايسة البلعمة ، احتضان الخلايا المصنفة في D-PBS / BSA مع حبات اللاتكس الفلورية (انظر جدول المواد) لمدة 30 دقيقة. اضبط عدد الخرزات ليحتوي على 4 حبات لكل خلية في المتوسط. ثم أجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 7 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وإعادة التعليق في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS ، وقراءة انبعاث التألق بواسطة FACS (λex 575 nm ؛ λem 610 nm).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

يعتمد تقييم العائد النهائي على مستوى النقاء وكمية الخلايا المعزولة ويمكن تحديده بواسطة RT-qPCR ، وعد الخلايا ، وتحديد كمية البروتين. تم تأكيد نقاء الخلايا المغناطيسية المعزولة من منطقة ما تحت المهاد من خلال تحليل التعبير الجيني ل CD11b و C1qa و Gad1 و GFAP باستخدام RT-qPCR (الشكل 1). يتم ال...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

يقدم البروتوكول الحالي عزل الخلايا الدبقية الصغيرة تحت المهاد من دماغ الفأر البالغ الذي تم اختراقه حديثا عن طريق فرز الخلايا المنشط مغناطيسيا. تؤكد النتائج المعروضة أعلاه نقاء الخلايا المعزولة وقابليتها للحياة ، فضلا عن فعالية هذه الطريقة في توصيف الخلايا الدبقية الصغيرة خارج الجسم

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.

Acknowledgements

يتم دعم AN من قبل المعهد الجامعي الفرنسي (IUF) ، وجامعة بوردو ، والمؤسسة الفرنسية لأبحاث الدماغ (FRC) ، و GLN (مجموعة تغذية الدهون) ، والوكالة الوطنية للبحوث (ANR ، PRC 2023-MicroNRJ). وحظيت الزراعة المحافظة على الموارد بدعم من مؤسسة البحوث الطبية (FRM-ARF201809006962). تلقى هذا المشروع تمويلا من برنامج Horizon Europe للبحث والابتكار التابع للاتحاد الأوروبي في إطار شبكات الدكتوراه MSCA 2021 ، رقم 101072759 (FuElThEbRaiNIn healtThYaging والأمراض المرتبطة بالعمر ، الخلود.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Adult Brain Dissociation KitMiltenyi130-107-677The kit contains buffer Z, buffer Y, enzymes A and P, Debris Removal Solution, buffer A (to dissolve enzyme A).
Albumin Bovine FrV BSAEuroMedex04-100-812-C
CD11b (Microglia) MicroBeads, human and mouse - small sizeMiltenyi130-093-636
CellROX Green Flow Cytometry Assay KitInvitrogenC10492
Centrifuge Tube, Snap-Pop Lid 15 mLCellTreat978449
DPBS, calcium, magnesium, glucose, pyruvateGibco14287-072
gentleMACS C TubesMiltenyi130-093-237
gentleMACS Octo Dissociator with HeatersMiltenyi130-096-427
Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail (100x)Thermofisher78420
Halt Protease Inhibitor Cocktail, EDTA free (100x)Thermofisher78437
HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol redThermofisher14065056
Latex beads, carboxylate-modified polystyrene, fluorescent redSigma-AldrichL3280
LightCycler 480 SYBR Green I MasterRoche 4707516001This reagent was used to perform PCR. 
MACS SmartStrainers (70 µm)Miltenyi130-110-916
Micro BCA Protein Assay KitThermofisher23235
M-PER Mammalian Extraction BufferThermofisher78503
MS ColumnsMiltenyi130-042-201Referred as small columns in the protocol. 
MultiMACS Cell24 Separator PlusMiltenyi130-098-637
PBSS, pH 7.4 Thermofisher10010023
qScript XLT cDNA SuperMixQuanta biosciences733-1177The kit was used to syntesize cDNA.
ReliaPrep RNA Miniprep SystemsPromegaZ6011The kit contains 1-Thioglycerol and BL buffer (referred as lysis buffer in the protocol) and it was used to isolate total RNA.
Vacutainer safety-lok 21 GBecton Dickinson367282

References

  1. Ginhoux, F., Lim, S., Hoeffel, G., Low, D., Huber, T. Origin and differentiation of microglia. Front Cell Neurosci. 7, 45(2013).
  2. Paolicelli, R. C., et al. Microglia states and nomenclature: A field at its crossroads. Neuron. 110 (21), 3458-3483 (2022).
  3. Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., Tetzlaff, W., Rossi, F. M. V. Local self-renewal can sustain CNS microglia maintenance and function throughout adult life. Nat Neurosci. 10 (12), 1538-1543 (2007).
  4. Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
  5. Alexaki, V. I. The impact of obesity on microglial function: immune, metabolic and endocrine perspectives. Cells. 10 (7), 1584(2021).
  6. Gao, C., Jiang, J., Tan, Y., Chen, S. Microglia in neurodegenerative diseases: mechanism and potential therapeutic targets. Sig Transduct Target Ther. 8 (1), 359(2023).
  7. Lee, J. -K., Tansey, M. G. Microglia isolation from adult mouse brain. Microglia: Methods Mol Biol. 1041, 17-23 (2013).
  8. Schwarz, J. Using fluorescence activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue. J Vis Exp. (2015), (2015).
  9. Lee, E., Eo, J. -C., Lee, C., Yu, J. -W. Distinct features of brain-resident macrophages: microglia and non-parenchymal brain macrophages. Mol Cells. 44 (5), 281-291 (2021).
  10. Korin, B., et al. single-cell characterization of the brain's immune compartment. Nat Neurosci. 20 (9), 1300-1309 (2017).
  11. Mrdjen, D., et al. High-dimensional single-cell mapping of central nervous system immune cells reveals distinct myeloid subsets in health, aging, and disease. Immunity. 48 (2), 380-395 (2018).
  12. Grabert, K., et al. Microglial brain region−dependent diversity and selective regional sensitivities to aging. Nat Neurosci. 19 (3), 504-516 (2016).
  13. Tan, Y. -L., Yuan, Y., Tian, L. Microglial regional heterogeneity and its role in the brain. Mol Psychiatry. 25 (2), 351-367 (2020).
  14. Bustin, S. A., et al. The MIQE Guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
  15. PamGene International B. V. 1160-Preparation-Lysates-of-Cell-Lines-or-Purified-Cells.pdf. PamGene International B. V. , (2022).
  16. Fonseca, M. I., et al. Cell-specific deletion of C1qa identifies microglia as the dominant source of C1q in mouse brain. J Neuroinflamm. 14 (1), 48(2017).
  17. Simpson, D. S. A., Oliver, P. L. ROS generation in microglia: understanding oxidative stress and inflammation in neurodegenerative disease. Antioxidants. 9 (8), 743(2020).
  18. Galloway, D. A., Phillips, A. E. M., Owen, D. R. J., Moore, C. S. Phagocytosis in the brain: homeostasis and disease. Front Immunol. 10, 790(2019).
  19. Marsh, S. E., et al. Dissection of artifactual and confounding glial signatures by single-cell sequencing of mouse and human brain. Nat Neurosci. 25 (3), 306-316 (2022).
  20. DePaula-Silva, A. B., et al. Differential transcriptional profiles identify microglial- and macrophage-specific gene markers expressed during virus-induced neuroinflammation. J Neuroinflammation. 16 (1), 152(2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 211

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved