Isolamento della microglia ipotalamica dal cervello di topo adulto appena perfuso mediante smistamento cellulare attivato magneticamente

Riepilogo

Descriviamo un protocollo per isolare le cellule microgliali dall'ipotalamo del topo (o piccole strutture cerebrali equivalenti) utilizzando il cell sorting attivato magneticamente (MACS), in un tempo relativamente breve. La microglia ipotalamica selezionata con MACS può essere utilizzata per analisi ex vivo e può essere piastrata per eseguire saggi in vitro .

Abstract

Le microglia, in quanto macrofagi residenti nel cervello, sono essenziali per il mantenimento dell'omeostasi cerebrale. Modellano i circuiti neuronali durante lo sviluppo, esaminano il loro ambiente alla ricerca di detriti o cellule morte, oltre a rispondere a infezioni e lesioni nel cervello, tra molte altre funzioni. Tuttavia, il loro ruolo importante nello sviluppo neurologico e nella plasticità sinaptica e fisiopatologica non è stato completamente definito, evidenziando la necessità di ulteriori indagini. Per ottenere una comprensione più completa del ruolo delle microglia in questi processi, dobbiamo isolare le microglia e caratterizzarle geneticamente, metabolicamente e funzionalmente. Tuttavia, l'isolamento delle microglia da topi adulti, in particolare da piccole strutture cerebrali, è impegnativo in quanto rappresentano una piccola percentuale delle cellule cerebrali totali e la resa delle microglia isolate è spesso troppo bassa. Qui, l'isolamento magnetico della microglia utilizzando microsfere CD11b⁺ ci consente di selezionare le cellule microgliali dall'ipotalamo di un cervello di topo adulto appena perfuso. Il metodo attuale ci consente di ottenere una purezza e una resa relativamente elevate in un breve periodo, mantenendo la vitalità cellulare.

Introduzione

Le microglia corrispondono al 5-20% del totale delle cellule neurali e sono le uniche cellule gliali che originano dai progenitori eritromieloidi nel sacco vitellino e iniziano a colonizzare il cervello in via di sviluppo intorno al giorno embrionale E9.5 ^1,2. Sono cellule longeve con la capacità di autorinnovarsi lentamente, indipendentemente dalle cellule derivate dal midollo osseo³. Essendo alcune delle cellule più altamente dinamiche, sono in grado di acquisire diversi fenotipi in risposta a segnali contestuali e ambientali ^2,4. Tra i segnali in grado di modulare la loro attività, il danno al sistema nervoso centrale (SNC), l'attività neuronale, così come i nutrienti, sono i più potenti. Un numero crescente di ricerche ha dimostrato il ruolo fondamentale della microglia nelle lesioni, nelle malattie neurodegenerative e nell'obesità ^2,5,6. Tuttavia, il ruolo preciso della microglia sia nei processi fisiologici che nella fisiopatologia richiede ulteriori studi. Pertanto, la loro caratterizzazione trascrizionale, metabolica e funzionale in diverse condizioni è di grande importanza e richiede il loro isolamento, poiché gli studi in situ sono appropriati per la localizzazione di DNA, RNA e proteine e per i confronti qualitativi, nonché per la caratterizzazione morfologica delle microglia.

Esistono varie tecniche descritte per l'isolamento delle microglia, tra cui il metodo del gradiente di Percoll⁷, la selezione cellulare con citometria a flusso (FACS)⁸ e la selezione cellulare attivata magneticamente (MACS). La scelta del metodo appropriato dipende dagli obiettivi dello studio e dal livello di purezza richiesto per le applicazioni a valle. L'isolamento della microglia pura dal cervello del topo adulto, in particolare da piccole strutture cerebrali come l'ipotalamo, è difficile a causa del numero limitato di cellule microgliali. La delicata dissociazione automatizzata dell'ipotalamo utilizzando la tecnologia Miltenyi consente la purificazione di una resa di microglia relativamente elevata in breve tempo, con la possibilità di procedere fino a otto campioni contemporaneamente con un dissociatore octo delicato MACS.

L'omogeneizzazione dei tessuti è seguita dalla purificazione della microglia utilizzando la tecnologia MACS basata su colonna e le microsfere CD11b⁺ supermagnetiche di dimensioni nanometriche. Pertanto, tutti i campioni vengono processati esattamente allo stesso modo, producendo cellule CD11b⁺ intatte. È interessante notare che CD11b non è presente esclusivamente nelle microglia, ma è espresso anche su altre cellule della linea mieloide, inclusi macrofagi e monociti⁹. Per limitare questo, la perfusione cerebrale con soluzione salina ghiacciata prima dell'estrazione dell'ipotalamo (vedi fase 2.6 del protocollo) garantisce l'eliminazione della maggior parte delle cellule mieloidi, lasciando solo una frazione potenzialmente piccola dei macrofagi residenti o di quelli aderiti ai vasi sanguigni. I macrofagi e i monociti residenti in un sistema nervoso centrale sano allo stato stazionario costituiscono una percentuale minore del totale delle cellule immunitarie cerebrali (rispettivamente ~10% e <2%^)10,11. Pertanto, quando le cellule cerebrali vengono selezionate con perle CD11b⁺, sia la microglia che i macrofagi possono essere isolati, sebbene la stragrande maggioranza siano microglia.

La resa finale delle microglia e il mantenimento della loro vitalità ci permettono di eseguire saggi ex vivo, così come in vitro, con il vantaggio di analizzare specifiche regioni cerebrali di interesse. Le ultime evidenze hanno dimostrato che la popolazione di microglia è altamente eterogenea, rappresentando l'espressione genica specifica della regione e le caratteristiche morfologiche e la funzione ^2,12,13. Pertanto, l'attuale protocollo mira a isolare e analizzare la microglia adulta in modo region-specific. Infatti, siamo in grado di caratterizzare i profili genetici, trascrizionali e traduzionali della microglia ipotalamica adulta utilizzando metodi come la RT-qPCR e il sequenziamento dell'RNA, oltre a eseguire analisi funzionali in vitro.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali descritti sono stati condotti nel rigoroso rispetto delle raccomandazioni dell'Unione Europea (2013/63/UE) e sono stati approvati dal comitato etico locale dell'Università di Bordeaux (CEEA50) e dal Ministero francese dell'istruzione superiore, della ricerca e dell'innovazione (sintesi non tecnica del progetto approvato NTS-FR-619193 v.1, 23-12-2022).

Il seguente protocollo viene eseguito su topi adulti C57BL/6 con un'età media di 2-4 mesi. Tuttavia, potrebbe essere eseguito in tutte le età e condizioni dei topi, tenendo in considerazione che il panorama delle cellule immunitarie del SNC può essere alterato e la percentuale di macrofagi e monociti residenti può essere aumentata (ad esempio nell'invecchiamento e nella neurodegenerazione).

1. Preparazione delle soluzioni

NOTA: I seguenti volumi e soluzioni sono strettamente riferiti all'isolamento delle cellule Cd11b+.

1. Determinare il volume totale di D-PBS/0,5% di albumina sierica bovina (BSA) richiesta in base al numero di campioni. Preparare la soluzione utilizzando il D-PBS disponibile in commercio con calcio e magnesio e BSA in polvere (vedere la Tabella dei materiali).
2. Preparare le provette di dissociazione marcate (C-Tubes) e riempire ciascuna di esse con 1.900 μl di tampone Z, fornito nel kit di dissociazione del tessuto cerebrale adulto (vedere la Tabella dei materiali). Scongelare gli enzimi e mantenerli in ghiaccio, insieme a tutti i tamponi necessari nei passaggi successivi.
3. Preparare e posizionare su ghiaccio il volume appropriato di 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) (vedere la Tabella dei materiali) necessaria per la perfusione (passaggio 2.6). Calcola 10 ml per ogni animale più il 10% in eccesso.
4. Per l'analisi RT-qPCR, preparare un tampone qPCR per campione: 2,5 μL di tioglicerina + 250 μL di tampone di lisi, utilizzando un kit disponibile in commercio per purificare l'RNA (vedere la Tabella dei materiali).
5. Per la quantificazione delle proteine, preparare il tampone di lisi diluendo il cocktail di inibitori della fosfatasi e il cocktail di inibitori della proteasi 1:100 in un tampone di estrazione di mammiferi (vedere la Tabella dei materiali).
6. Per la rilevazione delle specie reattive dell'ossigeno (ROS) e il test della fagocitosi, preparare 1x HBSS dal 10x HBSS disponibile in commercio (vedere la Tabella dei materiali). Quindi, preparare il buffer FACS aggiungendo lo 0,2% di BSA a 1x HBSS.

2. Rimozione del cervello

1. Sedare l'animale con una dose di 20 mg/kg di xilazina; Quindi, sopprimere il topo con un sovradosaggio di 400 mg/kg di pentobarbital e metterlo supino in un vassoio da dissezione.
   NOTA: Anche altre combinazioni di anestetici per l'eutanasia dell'animale possono funzionare.
2. Riempire una siringa da 10 ml con 10 ml di 1x PBS ghiacciato e collegarla a un ago a farfalla da 21 G.
3. Una volta che il topo è completamente anestetizzato (verificare pizzicando le zampe per assicurarsi di una mancanza di risposta), la respirazione si è fermata e il cuore è in fibrillazione, tendere la pelle con una pinza e aprire la cavità toracica con le forbici, a livello delle ultime costole e dello sterno.
4. Usa le forbici per fare un taglio profondo lungo i lati della gabbia toracica verso la parte superiore della gabbia toracica per esporre il cuore.
5. Inserire l'ago da 21 G nella parte distale del ventricolo sinistro (assicurarsi che circa 1/3 dell'ago sia all'interno del ventricolo). Praticare immediatamente un'incisione attraverso l'atrio destro utilizzando le forbici.
6. Infondere 10 ml di 1x PBS ghiacciato per pulire il cervello da eventuali cellule immunitarie circolanti.
   NOTA: Controllare visivamente il cervello per assicurarsi che sia pulito e ben perfuso.
7. Taglia la testa del topo, estrai con cura il cervello e posizionalo su una capsula di Petri riempita di ghiaccio e coperta con un foglio di alluminio.
   NOTA: La capsula di Petri e la pellicola aiutano a vedere i pezzi del cervello. È utile mantenere un ambiente fresco durante il taglio dei pezzi del cervello per limitare le attività metaboliche.
8. Isolare l'ipotalamo con una pinza e tagliarlo a pezzetti con le lamette da barba.
   1. Per identificare e sezionare l'ipotalamo, posizionare il cervello capovolto in modo che la corteccia sia ventrale e l'ipotalamo sia visibile dorsalmente sulla superficie superiore. Separare l'ipotalamo, che si trova nella parte inferiore del cervello su entrambi i lati del terzo ventricolo, usando una pinza curva. Il peso medio dell'ipotalamo nei topi adulti C57BL/6 è di 15 mg.
      NOTA: I pezzi di cervello devono essere il più piccoli possibile (<0,5 mm). Il taglio in piccoli pezzi è un passaggio critico poiché consente una migliore dissociazione e una maggiore resa delle cellule.
9. Raccogliere i pezzi dell'ipotalamo in provette di dissociazione (C-Tubes) precedentemente riempite con 1.900 μL di tampone Z (fase 1.2).
   NOTA: Per avere una buona resa di cellule microgliali sufficiente per eseguire i saggi, raggruppare un minimo di due (per la quantificazione delle proteine) o tre (per qPCR e RNAseq) ipotalami per provetta.

3. Dissociazione tissutale

NOTA: Tutti i passaggi devono essere eseguiti su ghiaccio. Non agitare la sospensione cellulare in nessun passaggio; Mescolare accuratamente solo con una pipetta da 1.000 μl.

1. Preparare la miscela enzimatica 2 secondo la Tabella 1 (calcolando il volume totale per tutte le provette + 10% in eccesso). In ogni provetta C, aggiungere 50 μl dell'enzima contenuto nella miscela 1 (vedere la tabella 1) e 30 μl della miscela enzimatica 2. Tutti gli enzimi sono forniti nel kit di dissociazione del tessuto cerebrale adulto (vedi la Tabella dei Materiali).
2. Chiudere i tubi a C e posizionarli capovolti nel dissociatore con le staffe riscaldanti secondo le istruzioni del produttore. Esegui il programma 37C_ABDK_02.
3. Preparare provette a scatto da 15 ml (vedere la Tabella dei materiali) con filtri da 70 μm su di esse. Inumidire il colino con 2 mL di D-PBS.
4. Al termine del programma di dissociazione/digestione, svuotare la provetta C sul filtro e grattare con una punta da 200 μl per ridurre la perdita cellulare aumentando la filtrazione cellulare e riducendo l'aderenza dell'omogeneizzato tissutale sul filtro.
5. Lavare la provetta con 2 x 5 mL di D-PBS, svuotare i lavaggi sul colino e grattare con un puntale da 200 μL tra un lavaggio e l'altro.
6. Centrifugare a 300 × g per 10 minuti a 4 °C e aspirare completamente il surnatante. Risospendere con cautela il pellet della cella con il volume appropriato di D-PBS freddo secondo la Tabella 1.
7. Miscelare immediatamente con cura con 450 μL di reagente a gradiente di densità (Soluzione per la rimozione dei detriti, vedere la Tabella dei materiali) e sovrapporre molto delicatamente con 2 mL di D-PBS freddo (vedere la Tabella 1).
   NOTA: Per ottenere i diversi strati di gradiente di densità, il D-PBS deve essere sovrapposto delicatamente goccia a goccia, con il minor "disturbo" possibile, 1 mL alla volta con una pipetta da 1 mL.
8. Centrifugare a 3.000 × g per 10 min a 4 °C con accelerazione lenta e freno lento (se 9 equivale a pieno, utilizzare 5).
9. Si formano tre fasi. Aspirare completamente le due fasi superiori e scartarle. Assicurarsi di non aspirare la terza fase inferiore.
10. Riempire con 1800 μL di D-PBS freddo e capovolgere delicatamente la provetta 3 volte.
11. Centrifugare a 1.000 × g per 10 minuti a 4 °C con accelerazione e freno a fondo e aspirare completamente il surnatante. Risospendere con cautela il pellet cellulare pipettandolo lentamente su e giù con 2 mL di D-PBS/BSA.

4. Isolamento magnetico delle cellule CD11b⁺

1. Centrifugare a 300 × g per 10 minuti a 4 °C e aspirare completamente il surnatante. Risospendere con cautela il pellet di cella in 90 μl di tampone D-PBS/BSA.
2. Aggiungere 10 μl della miscela di microsfere CD11b e mescolare bene con la pipetta.
3. Incubare per 15 minuti a 2-8 °C in frigorifero, non con ghiaccio; lavare le celle aggiungendo 1 mL di D-PBS/BSA e centrifugare a 300 × g per 10 min a 4 °C; Aspirare completamente il surnatante. Risospendere con cautela in 500 μL di D-PBS/BSA.
4. Avviare il programma POSSEL2 sul separatore seguendo le istruzioni sullo schermo. Posizionare le colonnine (vedi Tabella dei materiali) nel campo magnetico.
   NOTA: Per l'ordinamento delle celle magnetiche è possibile scegliere colonne piccole o grandi, in base al numero medio di celle previste. Le colonne piccole hanno una capacità fino a 1 × 10⁷ celle etichettate e le colonne grandi fino a 1 × 10⁸. Quando si isolano cellule da piccole strutture, come l'ipotalamo, si consigliano piccole colonne. I volumi dei reagenti sono diversi quando si utilizzano colonne di grandi dimensioni (vedere le istruzioni del produttore).
5. Bagnare le colonne (vedere la Tabella dei materiali) con 500 μL di D-PBS/BSA. Se la frazione negativa di cellule (CD11b^-) è necessaria per ulteriori analisi, posizionare una piastra di raccolta sotto le colonne e quindi applicare la sospensione cellulare nelle colonne.
6. Eseguire tre fasi di lavaggio aggiungendo 500 μl di D-PBS/BSA alla volta nella colonna, ogni volta attendendo che il tampone passi attraverso la colonna.
   NOTA: è importante evitare che la parte superiore della colonna si secchi, quindi si consiglia di non attendere il passaggio di tutto il tampone.
7. Trasferire l'effluente totale della frazione CD11b^- dai pozzetti della piastra di raccolta a provette da 15 millilitri.
8. Rimuovere la colonna dal separatore, posizionarla su una provetta da 5 mL e pipettare 1 mL di D-PBS/BSA nella colonna.
9. Eliminare immediatamente la frazione di cella marcata magneticamente applicando saldamente lo stantuffo fornito con la colonna.
10. Eventualmente, contare le cellule CD11b⁺ con un ematocitometro o qualsiasi altro metodo; Aspettatevi ~15.000 cellule per ipotalamo.
11. Centrifugare la sospensione cellulare a 300 ×g per 10 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante.

5. Analisi

1. Per l'analisi RT-qPCR, risospendere i pellet cellulari con il tampone qPCR (per la preparazione, vedere il passaggio 1.3) e conservare le provette a - 80 °C fino all'estrazione dell'mRNA. Isolare l'RNA totale, quindi elaborarlo e analizzarlo seguendo le linee guida MIQE¹⁴. Infine, sintetizzare il cDNA ed eseguire la qPCR utilizzando un dispositivo RT-PCR. Consulta la Tabella dei Materiali per tutti i kit utilizzati disponibili in commercio.
2. Per la quantificazione delle proteine, lavare i pellet cellulari con D-PBS (senza BSA) almeno 2 volte per eliminare la BSA. Quindi, risospendere i pellet cellulari da due ipotalami con 20 μL di tampone di lisi. Procedere con la quantificazione delle proteine con un kit per il dosaggio delle proteine (vedere la Tabella dei materiali).
   NOTA: Abbiamo seguito le istruzioni del produttore¹⁵ per quantificare le proteine per eseguire il test di attività serina/treonina chinasi.
3. Per la rilevazione delle specie reattive dell'ossigeno (ROS) nelle cellule microgliali, risospendere il pellet in 1x HBSS. Trattare le cellule seguendo il protocollo del produttore del kit per il test di citometria a flusso (vedere la Tabella dei materiali). Quindi, risospendere le cellule trattate in 200 μL di tampone FACS (per la preparazione, vedere il passaggio 1.5) ed eseguire il FACS per rilevare le cellule stressate ossidativamente.
4. Per il test di fagocitosi, incubare le cellule selezionate in D-PBS/BSA con perle di lattice fluorescenti (vedere la Tabella dei materiali) per 30 minuti. Adatta il numero di perline per avere in media 4 perline per cella. Quindi centrifugare a 300 × g per 7 minuti a 4 °C, risospendere in 200 μL di tampone FACS e leggere l'emissione di fluorescenza da parte del FACS (λ_ex 575 nm; λ_em 610 nm).

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Risultati

La valutazione della resa finale si basa sul livello di purezza e sulla quantità di cellule isolate e può essere determinata mediante RT-qPCR, conteggio delle cellule e quantificazione delle proteine. La purezza delle cellule magnetiche isolate dall'ipotalamo è stata confermata dall'analisi dell'espressione genica di CD11b, C1qa, Gad1 e GFAP con RT-qPCR (Figura 1). CD11b e C1qa sono espressi prevalentemente dalle microglia in uno stato stazionario, CNS¹⁶ e Gad1 e G...

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Discussione

L'attuale protocollo prevede l'isolamento di microglia ipotalamiche da cervello di topo adulto appena perfuso mediante Magnetic-Activated Cell Sorting. I risultati presentati sopra confermano la purezza e la vitalità delle cellule isolate, nonché l'efficacia di questo metodo per caratterizzare funzionalmente le microglia ex vivo, ad esempio attraverso l'attività fagocitaria e la quantificazione della produzione di ROS. I metodi classici per l'isolamento di una specifica popolazione cellulare potrebbero essere...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adult Brain Dissociation Kit	Miltenyi	130-107-677	The kit contains buffer Z, buffer Y, enzymes A and P, Debris Removal Solution, buffer A (to dissolve enzyme A).
Albumin Bovine FrV BSA	EuroMedex	04-100-812-C
CD11b (Microglia) MicroBeads, human and mouse - small size	Miltenyi	130-093-636
CellROX Green Flow Cytometry Assay Kit	Invitrogen	C10492
Centrifuge Tube, Snap-Pop Lid 15 mL	CellTreat	978449
DPBS, calcium, magnesium, glucose, pyruvate	Gibco	14287-072
gentleMACS C Tubes	Miltenyi	130-093-237
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters	Miltenyi	130-096-427
Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail (100x)	Thermofisher	78420
Halt Protease Inhibitor Cocktail, EDTA free (100x)	Thermofisher	78437
HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red	Thermofisher	14065056
Latex beads, carboxylate-modified polystyrene, fluorescent red	Sigma-Aldrich	L3280
LightCycler 480 SYBR Green I Master	Roche	4707516001	This reagent was used to perform PCR.
MACS SmartStrainers (70 µm)	Miltenyi	130-110-916
Micro BCA Protein Assay Kit	Thermofisher	23235
M-PER Mammalian Extraction Buffer	Thermofisher	78503
MS Columns	Miltenyi	130-042-201	Referred as small columns in the protocol.
MultiMACS Cell24 Separator Plus	Miltenyi	130-098-637
PBSS, pH 7.4	Thermofisher	10010023
qScript XLT cDNA SuperMix	Quanta biosciences	733-1177	The kit was used to syntesize cDNA.
ReliaPrep RNA Miniprep Systems	Promega	Z6011	The kit contains 1-Thioglycerol and BL buffer (referred as lysis buffer in the protocol) and it was used to isolate total RNA.
Vacutainer safety-lok 21 G	Becton Dickinson	367282