通过磁激活细胞分选从新鲜灌注的成年小鼠脑中分离下丘脑小胶质细胞

摘要

我们描述了一种使用磁激活细胞分选 （MACS） 在相对较短的时间内从小鼠下丘脑（或等效的小脑结构）中分离小胶质细胞的方案。MACS 分选的下丘脑小胶质细胞可用于 离体 分析，并可以接种以进行 体外 测定。

摘要

小胶质细胞作为大脑的常驻巨噬细胞，对于维持大脑稳态至关重要。它们在发育过程中塑造神经元回路，调查环境中的碎片或死细胞，以及对大脑中的感染和损伤做出反应，以及许多其他功能。然而，它们在神经发育和突触可塑性和病理生理学中的重要作用尚未完全定义，这突出了进一步研究的必要性。为了更全面地了解小胶质细胞在这些过程中的作用，我们需要分离小胶质细胞并从遗传、代谢和功能上表征它们。然而，从成年小鼠中分离小胶质细胞，尤其是从小脑结构中分离小胶质细胞是具有挑战性的，因为它们只占总脑细胞的一小部分，而且分离的小胶质细胞的产量通常太低。在这里，使用 CD11b ⁺ 微珠对小胶质细胞进行磁性分离使我们能够从新鲜灌注的成年小鼠大脑的下丘脑中分选小胶质细胞。目前的方法使我们能够在短时间内获得相对较高的纯度和产量，同时保持细胞活力。

引言

小胶质细胞相当于总神经细胞的 5-20%，是唯一起源于卵黄囊中红髓样祖细胞并在胚胎第 E9.5 天左右开始在发育中的大脑中定植的神经胶质细胞 ^1,2。它们是长寿细胞，能够独立于骨髓来源的细胞缓慢地进行自我更新³。作为一些最具活力的细胞，它们能够响应环境和环境线索获得不同的表型 ^2,4。在能够调节其活动的信号中，中枢神经系统 （CNS） 损伤、神经元活动以及营养物质最有效。越来越多的研究表明，小胶质细胞在损伤、神经退行性疾病和肥胖中起着关键作用 ^2,5,6。然而，小胶质细胞在生理过程和病理生理学中的确切作用需要进一步研究。因此，它们在不同条件下的转录、代谢和功能表征非常重要，需要分离它们，因为原位研究适用于 DNA、RNA 和蛋白质的定位和定性比较，以及小胶质细胞的形态学表征。

小胶质细胞分离的技术多种多样，其中包括 Percoll 梯度法⁷、流式细胞术细胞分选 （FACS）⁸ 和磁激活细胞分选 （MACS）。选择合适的方法取决于研究目标和下游应用所需的纯度水平。由于小胶质细胞的数量有限，从成年小鼠大脑中分离纯小胶质细胞，尤其是从下丘脑等小脑结构中分离纯小胶质细胞是具有挑战性的。使用 Miltenyi 技术对下丘脑进行自动温和解离，可在短时间内纯化出相对较高的小胶质细胞产量，并且能够使用 gentleMACS Octo 解离器同时处理多达 8 个样品。

组织匀浆后，使用基于 MACS 柱的技术和超磁性纳米级 CD11b⁺ 珠子纯化小胶质细胞。因此，所有样品都以完全相同的方式处理，产生完整的 CD11b⁺ 细胞。值得注意的是，CD11b 不仅存在于小胶质细胞中，还在其他髓系细胞（包括巨噬细胞和单核细胞）上表达⁹。为了限制这种情况，在下丘脑提取之前用冰冷的盐水溶液进行脑灌注（参见方案步骤 2.6）可确保消除大多数骨髓细胞，只留下可能只留下一小部分常驻巨噬细胞或粘附在血管上的巨噬细胞。健康稳态 CNS 的常驻巨噬细胞和单核细胞占总脑免疫细胞的一小部分（分别为 ~10% 和 <2%）^10,11。因此，当用 CD11b⁺ 珠子对脑细胞进行分选时，可以分离出小胶质细胞和巨噬细胞，尽管绝大多数是小胶质细胞。

小胶质细胞的最终产量及其活力的维持使我们能够进行离体和体外检测，具有分析感兴趣的特定大脑区域的优势。最新证据表明，小胶质细胞种群具有高度异质性，代表区域特异性基因表达和形态特征和功能 ^2,12,13。因此，目前的方案旨在以区域特异性的方式分离和分析成人小胶质细胞。事实上，我们可以使用 RT-qPCR 和 RNA 测序等方法表征成人下丘脑小胶质细胞的遗传、转录和翻译谱，以及进行体外功能分析。

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研究方案

所描述的所有动物实验均严格按照欧盟建议 （2013/63/EU） 进行，并获得了波尔多大学当地伦理委员会 （CEEA50） 和法国高等教育、研究和创新部的批准（已批准项目 NTS-FR-619193 v.1 的非技术摘要，2022 年 12 月 23 日）。

以下方案在平均年龄为 2-4 个月的成年 C57BL/6 小鼠上进行。然而，考虑到 CNS 的免疫细胞景观可能会改变并且常驻巨噬细胞和单核细胞的百分比可能会增加（例如，在衰老和神经退行性变中），它可以在所有年龄和条件下进行。

1. 溶液的制备

注:以下体积和溶液严格是指 Cd11b + 细胞的分离。

1. 根据样品数量确定所需的 D-PBS/0.5% 牛血清白蛋白 （BSA） 的总体积。使用市售的含钙、镁和 BSA 粉末的 D-PBS 制备溶液（参见 材料表）。
2. 准备标记的解离管 （C 管），并在每个管中填充 1,900 μL 缓冲液 Z，如成人脑组织解离试剂盒中提供（参见 材料表）。解冻酶并将其与以下步骤中所需的所有缓冲液一起保存在冰上。
3. 准备并将灌注（步骤 2.6）所需的适当体积的 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS）（参见 材料表）置于冰上。计算每只动物 10 mL 加上 10% 的过量。
4. 对于 RT-qPCR 分析，每个样品制备 qPCR 缓冲液:2.5 μL 硫代甘油 + 250 μL 裂解缓冲液，使用市售试剂盒纯化 RNA（参见 材料表）。
5. 对于蛋白质定量，通过在哺乳动物提取缓冲液中以 1:100 稀释磷酸酶抑制剂混合物和蛋白酶抑制剂混合物来制备裂解缓冲液（参见 材料表）。
6. 对于活性氧 （ROS） 的检测和吞噬作用测定，从市售的 10x HBSS 中制备 1x HBSS（参见 材料表）。然后，通过向 1x HBSS 中加入 0.2% BSA 来制备 FACS 缓冲液。

2. 去除大脑

1. 用 20 mg/kg 的甲苯噻嗪剂量镇静动物;然后，用过量的 400 mg/kg 戊巴比妥对小鼠实施安乐死，并将其仰卧在解剖盘中。
   注意:其他用于对动物实施安乐死的麻醉剂组合也可以起作用。
2. 在 10 mL 注射器中加入 10 mL 冰冷的 1x PBS，并将其连接到蝶形 21 G 针头上。
3. 一旦小鼠完全麻醉（通过捏爪子进行验证以确保没有反应），呼吸停止，心脏处于颤动状态，用镊子帐篷覆盖皮肤，并用剪刀打开胸腔，在最后一根肋骨和胸骨的水平。
4. 用剪刀沿着胸腔的侧面朝胸腔顶部做一个深切，露出心脏。
5. 将 21 G 针头插入左心室的远端部分（确保大约 1/3 的针头在心室内）。立即用剪刀在右心房切开一个切口。
6. 注入 10 mL 冰冷的 1x PBS 以清除大脑中任何循环免疫细胞。
   注意:目视检查大脑，确保其清洁且灌注良好。
7. 切开老鼠头，小心地取出大脑，然后将其放在装满冰块并覆盖有铝箔的培养皿上。
   注意:培养皿和箔有助于看到大脑碎片。在脑碎片切割期间保持凉爽的环境以限制新陈代谢活动是有益的。
8. 用镊子分离下丘脑，并用剃须刀片将其切成小块。
   1. 为了识别和解剖下丘脑，将大脑倒置，使皮层位于腹侧，下丘脑在上表面的背侧可见。使用弯曲的镊子分离位于大脑底部第三脑室两侧的下丘脑。成年 C57BL/6 小鼠的下丘脑平均重量为 15 毫克。
      注意:脑片必须尽可能小 （<0.5 mm）。切成小块是一个关键步骤，因为它可以更好地解离和更高的细胞产量。
9. 将下丘脑碎片收集在先前填充有 1,900 μL 缓冲液 Z 的解离管 （C 管） 中（步骤 1.2）。
   注:为了获得足以进行检测的小胶质细胞的良好产量，每管至少混合两个（用于蛋白质定量）或三个（用于 qPCR 和 RNAseq）下丘脑。

3. 组织解离

注意:所有步骤都必须在冰上进行。在任何步骤中都不要涡旋细胞悬液;只能用 1,000 μL 移液器小心混匀。

1. 根据 表 1 准备酶混合物 2（计算所有试管的总体积 + 10% 过量）。在每个 C 管中，加入 50 μL 混合物 1 中所含的酶（见 表 1）和 30 μL 酶混合物 2。所有酶均在成人脑组织解离试剂盒中提供（参见 材料表）。
2. 根据制造商的说明，关闭 C 管并将它们倒置在带有加热支架的分离器中。 37C_ABDK_02运行程序。
3. 准备 15 mL 卡口管（参见 材料表），上面有 70 μm 过滤器。用 2 mL D-PBS 润湿过滤器。
4. 解离/酶解程序完成后，将 C 管清空到过滤器上，并用 200 μL 吸头刮擦，通过增加细胞过滤和减少组织匀浆在过滤器上的粘附来减少细胞损失。
5. 用 2 x 5 mL D-PBS 洗涤试管，将洗涤液倒空到过滤器上，并在两次洗涤之间用 200 μL 吸头刮擦。
6. 在 4 °C 下以 300 × g 离心 10 分钟并完全吸出上清液。根据 表 1，用适当体积的冷 D-PBS 小心地重悬细胞沉淀。
7. 立即用 450 μL 密度梯度试剂（碎屑去除溶液，见 材料表）小心混合，并用 2 mL 冷 D-PBS 非常轻柔地覆盖（见 表 1）。
   注:为了获得不同的密度梯度层，必须用 1 mL 移液器一次 1 mL，以尽可能少的"干扰"，逐滴轻轻覆盖 D-PBS。
8. 在 4 °C 下以 3,000 × g 离心 10 分钟，缓慢加速和慢速制动（如果 9 相当于满，则使用 5）。
9. 形成三个阶段。完全吸出两个顶部相并丢弃它们。确保不要吸出第三个底部相。
10. 装满 1800 μL 的冷 D-PBS，然后轻轻倒置试管 3 次。
11. 在 4 °C 下以 1,000 × g 离心 10 分钟，全加速和全制动，并完全吸出上清液。用 2 mL D-PBS/BSA 缓慢上下移液，小心地重悬细胞沉淀。

4. CD11b⁺ 细胞的磁性分离

1. 在 4 °C 下以 300 × g 离心 10 分钟，并完全吸出上清液。小心地将细胞沉淀重悬于 90 μL 缓冲液 D-PBS/BSA 中。
2. 加入 10 μL CD11b-微珠混合物，并与移液管充分混合。
3. 在 2-8 °C 的冰箱中孵育 15 分钟，而不是在冰上孵育;加入 1 mL D-PBS/BSA 洗涤细胞，并在 4 °C 下以 300 × g 离心 10 分钟;完全吸出上清液。小心重悬于 500 μL D-PBS/BSA 中。
4. 按照屏幕上的说明在分离器上启动 POSSEL2 程序。将小柱（参见 材料表）置于磁场中。
   注:根据预期的平均细胞数，可以选择小柱或大柱进行磁性细胞分选。小柱的容量高达 1 × 10⁷ 个标记细胞，大柱的容量高达 1 × 10⁸。从小结构（如下丘脑）中分离细胞时，建议使用小柱。使用大柱时，试剂的体积不同（参见制造商的说明）。
5. 用 500 μL D-PBS/BSA 润湿色谱柱（参见 材料表）。如果需要进一步分析细胞的阴性部分 （CD11b^-），请在柱下放置收集板，然后在柱中涂上细胞悬液。
6. 通过在色谱柱中一次添加 500 μL D-PBS/BSA 来执行三个洗涤步骤，每次等待缓冲液通过色谱柱。
   注意:防止色谱柱上部变干很重要，因此建议不要等到所有缓冲液都通过。
7. 将 CD11b ^- 馏分的总流出物从收集板的孔转移到 15 毫升试管中。
8. 从分离器中取出色谱柱，将其放在 5 mL 试管上，然后将 1 mL D-PBS/BSA 移液到色谱柱中。
9. 用力应用色谱柱随附的柱塞，立即冲洗掉磁性标记的细胞组分。
10. 最后，用血细胞计数器或任何其他方法对 CD11b ⁺ 细胞进行计数;预计每个下丘脑有 ~15,000 个细胞。
11. 将细胞悬液在 4 °C 下以 300 × g 离心 10 分钟，并弃去上清液。

5. 分析

1. 对于RT-qPCR分析，用qPCR缓冲液重悬细胞沉淀（用于制备，参见步骤1.3），并将试管储存在-80°C直至mRNA提取。分离总 RNA，然后按照 MIQE 指南¹⁴ 对其进行处理和分析。最后，合成 cDNA 并使用 RT-PCR 设备进行 qPCR。有关使用的所有市售试剂盒，请参阅 材料表 。
2. 对于蛋白质定量，用 D-PBS（不含 BSA）洗涤细胞沉淀至少 2 次以消除 BSA。然后，用 20 μL 裂解缓冲液重悬来自两个下丘脑的细胞沉淀。使用蛋白质检测试剂盒进行蛋白质定量（参见 材料表）。
   注:我们按照制造商的说明¹⁵ 定量蛋白质以进行丝氨酸/苏氨酸激酶活性测定。
3. 为了检测小胶质细胞中的活性氧 （ROS），将沉淀重悬于 1x HBSS 中。按照流式细胞术测定试剂盒的制造商方案处理细胞（参见 材料表）。然后，将处理过的细胞重悬于 200 μL FACS 缓冲液中（用于制备，参见步骤 1.5）并进行 FACS 以检测氧化应激细胞。
4. 对于吞噬作用测定，将分选的细胞在带有荧光乳胶珠的 D-PBS/BSA 中孵育 30 分钟（参见 材料表）。调整磁珠的数量，平均每个细胞有 4 个磁珠。然后在 4 °C 下以 300 × g 离心 7 分钟，重悬于 200 μL FACS 缓冲液中，并通过 FACS 读取荧光发射（λ_ex 575 nm;λ_em 610 nm）。

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结果

最终产量的评估取决于纯度水平和分离细胞的数量，可以通过 RT-qPCR、细胞计数和蛋白质定量来确定。通过 RT-qPCR 对 CD11b 、 C1qa 、 Gad1 和 GFAP 进行基因表达分析，证实了从下丘脑分离的磁性细胞的纯度 （图 1）。CD11b 和 C1qa 主要由稳态小胶质细胞表达，CNS¹⁶ 和 Gad1 和 GFAP 分别作为神经元和星形胶质细胞标志物。来自一个下丘脑的总 cDNA 范围为 55 至 98 ng。值...

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讨论

目前的方案提出了通过磁激活细胞分选从新鲜灌注的成年小鼠脑中分离下丘脑小胶质细胞。上述结果证实了分离细胞的纯度和活力，以及该方法在 体外功能表征小胶质细胞的有效性，例如通过吞噬活性和 ROS 生产定量。分离特定细胞群的经典方法也可用于小胶质细胞。密度梯度分级法是一种众所周知的方法，用于根据细胞的大小和/或密度分离不同的细胞及其颗粒。该技术可应用于原代小胶...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adult Brain Dissociation Kit	Miltenyi	130-107-677	The kit contains buffer Z, buffer Y, enzymes A and P, Debris Removal Solution, buffer A (to dissolve enzyme A).
Albumin Bovine FrV BSA	EuroMedex	04-100-812-C
CD11b (Microglia) MicroBeads, human and mouse - small size	Miltenyi	130-093-636
CellROX Green Flow Cytometry Assay Kit	Invitrogen	C10492
Centrifuge Tube, Snap-Pop Lid 15 mL	CellTreat	978449
DPBS, calcium, magnesium, glucose, pyruvate	Gibco	14287-072
gentleMACS C Tubes	Miltenyi	130-093-237
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters	Miltenyi	130-096-427
Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail (100x)	Thermofisher	78420
Halt Protease Inhibitor Cocktail, EDTA free (100x)	Thermofisher	78437
HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red	Thermofisher	14065056
Latex beads, carboxylate-modified polystyrene, fluorescent red	Sigma-Aldrich	L3280
LightCycler 480 SYBR Green I Master	Roche	4707516001	This reagent was used to perform PCR.
MACS SmartStrainers (70 µm)	Miltenyi	130-110-916
Micro BCA Protein Assay Kit	Thermofisher	23235
M-PER Mammalian Extraction Buffer	Thermofisher	78503
MS Columns	Miltenyi	130-042-201	Referred as small columns in the protocol.
MultiMACS Cell24 Separator Plus	Miltenyi	130-098-637
PBSS, pH 7.4	Thermofisher	10010023
qScript XLT cDNA SuperMix	Quanta biosciences	733-1177	The kit was used to syntesize cDNA.
ReliaPrep RNA Miniprep Systems	Promega	Z6011	The kit contains 1-Thioglycerol and BL buffer (referred as lysis buffer in the protocol) and it was used to isolate total RNA.
Vacutainer safety-lok 21 G	Becton Dickinson	367282