Aislamiento de microglía hipotalámica a partir de cerebro de ratón adulto recién perfundido mediante clasificación de células activadas magnéticamente

Resumen

Describimos un protocolo para aislar células microgliales del hipotálamo del ratón (o pequeñas estructuras cerebrales equivalentes) utilizando la clasificación de células activadas magnéticamente (MACS), en un tiempo relativamente corto. La microglía hipotalámica clasificada por MACS se puede utilizar para análisis ex vivo y se puede sembrar para realizar ensayos in vitro .

Resumen

La microglía, como macrófagos residentes del cerebro, son esenciales para mantener la homeostasis cerebral. Dan forma a los circuitos neuronales durante el desarrollo, examinan su entorno en busca de desechos o células muertas, y responden a infecciones y lesiones en el cerebro, entre muchas otras funciones. Sin embargo, su importante papel en el neurodesarrollo y la plasticidad sináptica y fisiopatología no se ha definido completamente, lo que pone de manifiesto la necesidad de seguir investigando. Para obtener una comprensión más completa del papel de la microglía en estos procesos, necesitamos aislar la microglía y caracterizarla genética, metabólica y funcionalmente. Sin embargo, el aislamiento de la microglía de ratones adultos, especialmente de estructuras cerebrales pequeñas, es un desafío, ya que representan un pequeño porcentaje del total de células cerebrales y el rendimiento de la microglía aislada suele ser demasiado bajo. En este caso, el aislamiento magnético de la microglía mediante microesferas CD11b⁺ nos permite separar las células microgliales del hipotálamo de un cerebro de ratón adulto recién perfundido. El método actual nos permite lograr una pureza y un rendimiento relativamente altos en un corto período de tiempo, manteniendo la viabilidad de la célula.

Introducción

La microglía corresponde al 5-20% del total de células neurales y son las únicas células gliales que se originan a partir de progenitores eritromieloides en el saco vitelino y comienzan a colonizar el cerebro en desarrollo alrededor del día embrionario E9.5 ^1,2. Son células longevas con la capacidad de auto-renovarse lentamente, independientemente de las células derivadas de la médula ósea³. Como algunas de las células más dinámicas, son capaces de adquirir diversos fenotipos en respuesta a señales contextuales y ambientales ^2,4. Entre las señales capaces de modular su actividad, el daño del sistema nervioso central (SNC), la actividad neuronal, así como los nutrientes, son los más potentes. Cada vez son más las investigaciones que demuestran el papel fundamental de la microglía en las lesiones, las enfermedades neurodegenerativas y la obesidad ^2,5,6. Sin embargo, el papel preciso de la microglía tanto en los procesos fisiológicos como en la fisiopatología requiere más estudio. Por lo tanto, su caracterización transcripcional, metabólica y funcional en diferentes condiciones es de gran importancia y requiere su aislamiento, ya que los estudios in situ son apropiados para la localización de ADN, ARN y proteínas y comparaciones cualitativas, así como para la caracterización morfológica de la microglía.

Existen diversas técnicas descritas para el aislamiento de microglía, entre las que se encuentran el método de gradiente de Percoll⁷, la clasificación celular por citometría de flujo (FACS)⁸ y la clasificación por células activadas magnéticamente (MACS). La selección del método apropiado depende de los objetivos del estudio y del nivel de pureza requerido para las aplicaciones posteriores. El aislamiento de la microglía pura del cerebro del ratón adulto, especialmente de pequeñas estructuras cerebrales como el hipotálamo, es un desafío debido al número limitado de células microgliales. La disociación suave y automatizada del hipotálamo mediante la tecnología Miltenyi permite la purificación de un rendimiento de microglía relativamente alto en poco tiempo con la capacidad de procesar hasta ocho muestras al mismo tiempo con un suave disociador Octo de MACS.

A la homogeneización de los tejidos le sigue la purificación de la microglía mediante la tecnología basada en columna MACS y las perlas supermagnéticas de tamaño nanométrico CD11b⁺. Por lo tanto, todas las muestras se procesan exactamente de la misma manera, produciendo células CD11b⁺ intactas. Cabe destacar que CD11b no está presente exclusivamente en la microglía, sino que también se expresa en otras células de linaje mieloide, incluidos los macrófagos y los monocitos⁹. Para limitar esto, la perfusión cerebral con solución salina helada antes de la extracción del hipotálamo (ver paso 2.6 del protocolo) asegura la eliminación de la mayoría de las células mieloides, dejando solo una fracción potencialmente pequeña de macrófagos residentes o adheridos a los vasos sanguíneos. Los macrófagos y monocitos residentes de un SNC en estado estacionario saludable constituyen un porcentaje menor del total de células inmunitarias cerebrales (~10% y <2% respectivamente)^10,11. Por lo tanto, cuando las células cerebrales se clasifican con perlas CD11b⁺, tanto la microglía como los macrófagos se pueden aislar, aunque la gran mayoría son microglía.

El rendimiento final de la microglía y el mantenimiento de su viabilidad nos permiten realizar ensayos ex vivo, así como in vitro, con la ventaja de analizar regiones cerebrales específicas de interés. La evidencia más reciente ha demostrado que la población de microglía es altamente heterogénea, representando la expresión génica específica de la región y las características morfológicas y funcionales ^2,12,13. Por lo tanto, el protocolo actual tiene como objetivo aislar y analizar la microglía adulta de una manera específica para cada región. De hecho, podemos caracterizar los perfiles genéticos, transcripcionales y traslacionales de la microglía hipotalámica adulta utilizando métodos como la RT-qPCR y la secuenciación de ARN, así como realizar análisis funcionales in vitro.

Protocolo

Todos los experimentos con animales descritos se llevaron a cabo en estricto cumplimiento de las recomendaciones de la Unión Europea (2013/63/UE) y fueron aprobados por el comité ético local de la Universidad de Burdeos (CEEA50) y el Ministerio de Educación Superior, Investigación e Innovación de Francia (resumen no técnico del proyecto aprobado NTS-FR-619193 v.1, 23-12-2022).

El siguiente protocolo se realiza en ratones C57BL/6 adultos con una edad media de 2-4 meses. Sin embargo, podría realizarse en todas las edades y condiciones de los ratones, teniendo en cuenta que el paisaje de las células inmunitarias del SNC puede estar alterado y el porcentaje de macrófagos y monocitos residentes puede aumentar (por ejemplo, en el envejecimiento y la neurodegeneración).

1. Preparación de soluciones

NOTA: Los siguientes volúmenes y soluciones se refieren estrictamente al aislamiento de células Cd11b+.

1. Determine el volumen total de D-PBS/0,5% de albúmina sérica bovina (BSA) requerido en función del número de muestras. Prepare la solución utilizando el D-PBS disponible en el mercado con calcio y magnesio y polvo de BSA (consulte la tabla de materiales).
2. Prepare los tubos de disociación etiquetados (tubos C) y llénelos con 1.900 μL de tampón Z, proporcionado en el kit de disociación de tejido cerebral adulto (consulte la Tabla de materiales). Descongele las enzimas y manténgalas en hielo, junto con todos los tampones necesarios en los siguientes pasos.
3. Prepare y coloque el volumen adecuado de solución salina tamponada con fosfato (PBS) (consulte la Tabla de materiales) necesaria para la perfusión (paso 2.6) en hielo. Calcular 10 mL para cada animal más un 10% de exceso.
4. Para el análisis de RT-qPCR, prepare un tampón de qPCR por muestra: 2,5 μL de tioglicerol + 250 μL de tampón de lisis, utilizando un kit disponible en el mercado para purificar el ARN (consulte la Tabla de materiales).
5. Para la cuantificación de proteínas, prepare el tampón de lisis diluyendo el cóctel de inhibidores de la fosfatasa y el cóctel de inhibidores de la proteasa 1:100 en un tampón de extracción de mamíferos (consulte la Tabla de materiales).
6. Para la detección de especies reactivas de oxígeno (ROS) y el ensayo de fagocitosis, prepare 1x HBSS a partir de los 10x HBSS disponibles comercialmente (consulte la Tabla de materiales). A continuación, prepare el búfer FACS añadiendo un 0,2% de BSA a 1x HBSS.

2. Extirpación del cerebro

1. Sedar al animal con una dosis de 20 mg/kg de xilacina; A continuación, sacrificar al ratón con una sobredosis de 400 mg/kg de pentobarbital y colocarlo en decúbito supino en una bandeja de disección.
   NOTA: Otras combinaciones de anestésicos para eutanasiar al animal también pueden funcionar.
2. Llene una jeringa de 10 ml con 10 ml de PBS 1x helado y conéctela a una aguja de mariposa de 21 g.
3. Una vez que el ratón esté completamente anestesiado (verificar pellizcando las patas para asegurar la falta de respuesta), la respiración se detuvo, y el corazón está en fibrilación, cubrir la piel con pinzas y abrir la cavidad torácica con unas tijeras, a la altura de las últimas costillas y el esternón.
4. Usa las tijeras para hacer un corte profundo a lo largo de los lados de la caja torácica hacia la parte superior de la caja torácica para exponer el corazón.
5. Inserte la aguja de 21 G en la parte distal del ventrículo izquierdo (asegúrese de que aproximadamente 1/3 de la aguja esté dentro del ventrículo). Inmediatamente haga una incisión a través de la aurícula derecha con las tijeras.
6. Infunda 10 ml de PBS 1x helado para limpiar el cerebro de cualquier célula inmunitaria circulante.
   NOTA: Revise visualmente el cerebro para asegurarse de que esté limpio y bien perfundido.
7. Corta la cabeza del ratón, extrae con cuidado el cerebro y colócalo en una placa de Petri llena de hielo y cubierta con papel de aluminio.
   NOTA: La placa de Petri y el papel de aluminio ayudan a ver las piezas del cerebro. Es beneficioso mantener un ambiente fresco durante el corte de las piezas del cerebro para limitar las actividades metabólicas.
8. Aísla el hipotálamo con pinzas y córtalo en trozos pequeños con cuchillas de afeitar.
   1. Para identificar y diseccionar el hipotálamo, coloque el cerebro boca abajo de modo que la corteza sea ventral y el hipotálamo sea visible dorsalmente en la superficie superior. Separe el hipotálamo, que se encuentra en la parte inferior del cerebro a ambos lados del tercer ventrículo, usando pinzas curvas. El peso medio del hipotálamo de ratones C57BL/6 adultos es de 15 mg.
      NOTA: Las piezas del cerebro deben ser lo más pequeñas posible (<0,5 mm). El corte en trozos pequeños es un paso crítico ya que permite una mejor disociación y un mayor rendimiento de células.
9. Recoger los trozos del hipotálamo en tubos de disociación (C-Tubes) previamente rellenados con 1.900 μL de tampón Z (paso 1.2).
   NOTA: Para tener un buen rendimiento de células microgliales que sea suficiente para realizar ensayos, agrupe un mínimo de dos (para la cuantificación de proteínas) o tres (para qPCR y RNAseq) hipotálamis por tubo.

3. Disociación tisular

NOTA: Todos los pasos deben realizarse con hielo. No haga vórtice de la suspensión celular en ningún paso; mezclar cuidadosamente con una pipeta de 1.000 μL.

1. Prepare la mezcla de enzimas 2 de acuerdo con la Tabla 1 (calculando el volumen total de todos los tubos + 10% en exceso). En cada tubo C, agregue 50 μL de la enzima contenida en la mezcla 1 (ver Tabla 1) y 30 μL de la mezcla de enzimas 2. Todas las enzimas se proporcionan en el kit de disociación del tejido cerebral adulto (ver la Tabla de Materiales).
2. Cierre los tubos C y colóquelos boca abajo en el disociador con los soportes calefactores de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Ejecute el programa 37C_ABDK_02.
3. Prepare tubos de presión de 15 ml (consulte la tabla de materiales) con filtros de 70 μm encima de ellos. Humedece el colador con 2 mL de D-PBS.
4. Cuando finalice el programa de disociación/digestión, vacíe el tubo C en el filtro y rasque con una punta de 200 μL para reducir la pérdida celular al aumentar la filtración celular y reducir la adherencia del homogeneizado de tejido en el filtro.
5. Lave el tubo con 2 x 5 mL de D-PBS, vacíe los lavados en el colador y rasque con una punta de 200 μL entre los lavados.
6. Centrifugar a 300 × g durante 10 min a 4 °C y aspirar completamente el sobrenadante. Vuelva a suspender cuidadosamente el pellet de celda con el volumen adecuado de D-PBS frío de acuerdo con la Tabla 1.
7. Mezclar inmediatamente cuidadosamente con 450 μL de reactivo de gradiente de densidad (Solución de eliminación de residuos, ver la Tabla de Materiales) y cubrir muy suavemente con 2 mL de D-PBS frío (ver Tabla 1).
   NOTA: Para obtener las diferentes capas de gradiente de densidad, el D-PBS debe superponerse suavemente gota a gota, con la menor "perturbación" posible, 1 mL a la vez con una pipeta de 1 mL.
8. Centrifugar a 3.000 × g durante 10 min a 4 °C con aceleración lenta y freno lento (si 9 es equivalente a lleno, use 5).
9. Se forman tres fases. Aspire las dos fases superiores por completo y deséchelas. Asegúrese de no aspirar la tercera fase inferior.
10. Llene con 1800 μL de D-PBS frío e invierta suavemente el tubo 3 veces.
11. Centrifugar a 1.000 × g durante 10 min a 4 °C con aceleración máxima y freno a fondo y aspirar completamente el sobrenadante. Vuelva a suspender con cuidado el pellet celular pipeteando lentamente hacia arriba y hacia abajo con 2 mL de D-PBS/BSA.

4. Aislamiento magnético de células CD11b⁺

1. Centrifugar a 300 × g durante 10 min a 4 °C y aspirar completamente el sobrenadante. Vuelva a suspender con cuidado el pellet celular en 90 μL de tampón D-PBS/BSA.
2. Añadir 10 μL de la mezcla de microperlas CD11b y mezclar bien con la pipeta.
3. Incubar durante 15 min a 2-8 °C en la nevera, no con hielo; lavar las células añadiendo 1 mL de D-PBS/BSA y centrifugar a 300 × g durante 10 min a 4 °C; Aspire el sobrenadante por completo. Vuelva a suspender cuidadosamente en 500 μL de D-PBS/BSA.
4. Inicie el programa POSSEL2 en el separador siguiendo las instrucciones en pantalla. Coloque las pequeñas columnas (ver la Tabla de Materiales) en el campo magnético.
   NOTA: Se pueden elegir columnas pequeñas o grandes para la clasificación de celdas magnéticas, de acuerdo con el número promedio de celdas esperadas. Las columnas pequeñas tienen una capacidad de hasta 1 × 10⁷ celdas etiquetadas y las columnas grandes de hasta 1 × 10⁸. Al aislar células de estructuras pequeñas, como el hipotálamo, se aconsejan pequeñas columnas. Los volúmenes de los reactivos son diferentes cuando se utilizan columnas grandes (consulte las instrucciones del fabricante).
5. Humedecer las columnas (ver la Tabla de Materiales) con 500 μL de D-PBS/BSA. Si se necesita la fracción negativa de las células (CD11b^-) para un análisis posterior, coloque una placa de recolección debajo de las columnas y luego aplique suspensión celular en las columnas.
6. Realice tres pasos de lavado añadiendo 500 μL de D-PBS/BSA a la vez en la columna, esperando cada vez a que el tampón pase a través de la columna.
   NOTA: es importante evitar que la parte superior de la columna se seque, por lo que se aconseja no esperar a que haya pasado todo el tampón.
7. Transfiera el efluente total de la fracción CD11b^- de los pocillos de la placa colectora a tubos de 15 mililitros.
8. Retire la columna del separador, colóquela en un tubo de 5 ml y pipetee 1 ml de D-PBS/BSA en la columna.
9. Enjuague inmediatamente la fracción de celda marcada magnéticamente aplicando firmemente el émbolo suministrado con la columna.
10. Eventualmente, cuente las células CD11b⁺ con un hemacitómetro o cualquier otro método; Espere ~ 15,000 células por hipotálamo.
11. Centrifugar la suspensión celular a 300 ×g durante 10 min a 4 °C y desechar el sobrenadante.

5. Análisis

1. Para el análisis de RT-qPCR, vuelva a suspender los gránulos celulares con tampón qPCR (para la preparación, consulte el paso 1.3) y almacene los tubos a -80 °C hasta la extracción del ARNm. Aísle el ARN total, luego procéselo y analícelo siguiendo las pautas del MIQE¹⁴. Por último, sintetizar el ADNc y realizar una qPCR utilizando un dispositivo RT-PCR. Consulte la Tabla de Materiales para ver todos los kits disponibles comercialmente utilizados.
2. Para la cuantificación de proteínas, lave los gránulos celulares con D-PBS (sin BSA) al menos 2 veces para eliminar BSA. A continuación, vuelva a suspender los gránulos celulares de dos hipotálamis con 20 μL de tampón de lisis. Proceda con la cuantificación de proteínas con un kit de ensayo de proteínas (consulte la Tabla de materiales).
   NOTA: Seguimos las instrucciones del fabricante¹⁵ para cuantificar las proteínas y realizar el ensayo de actividad de serina/treonina quinasas.
3. Para la detección de especies reactivas de oxígeno (ROS) en células microgliales, vuelva a suspender el pellet en 1x HBSS. Tratar las células siguiendo el protocolo del fabricante del kit para el ensayo de citometría de flujo (ver la Tabla de Materiales). A continuación, vuelva a suspender las células tratadas en 200 μL de tampón FACS (para la preparación, consulte el paso 1.5) y realice FACS para detectar las células estresadas oxidativamente.
4. Para el ensayo de fagocitosis, incube las células clasificadas en D-PBS/BSA con perlas de látex fluorescentes (consulte la Tabla de materiales) durante 30 minutos. Adapte el número de cuentas para que tenga 4 cuentas por celda en promedio. A continuación, centrifugar a 300 × g durante 7 min a 4 °C, volver a suspender en 200 μL de tampón FACS y leer la emisión de fluorescencia por FACS (λ_ex 575 nm; λ_em 610 nm).

Resultados

La evaluación del rendimiento final se basa en el nivel de pureza y la cantidad de células aisladas y podría determinarse mediante RT-qPCR, recuento de células y cuantificación de proteínas. La pureza de las células magnéticas aisladas del hipotálamo se confirmó mediante el análisis de expresión génica de CD11b, C1qa, Gad1 y GFAP con RT-qPCR (Figura 1). CD11b y C1qa se expresan predominantemente por la microglía en un estado estacionario, CNS¹⁶ y Gad1 y ...

Discusión

El protocolo actual presenta el aislamiento de microglía hipotalámica a partir de cerebro de ratón adulto recién perfundido mediante clasificación de células activadas magnéticamente. Los resultados presentados anteriormente confirman la pureza y viabilidad de las células aisladas, así como la eficacia de este método para caracterizar funcionalmente la microglía ex vivo, por ejemplo, a través de la actividad fagocítica y la cuantificación de la producción de ROS. Los métodos clásicos para el ais...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adult Brain Dissociation Kit	Miltenyi	130-107-677	The kit contains buffer Z, buffer Y, enzymes A and P, Debris Removal Solution, buffer A (to dissolve enzyme A).
Albumin Bovine FrV BSA	EuroMedex	04-100-812-C
CD11b (Microglia) MicroBeads, human and mouse - small size	Miltenyi	130-093-636
CellROX Green Flow Cytometry Assay Kit	Invitrogen	C10492
Centrifuge Tube, Snap-Pop Lid 15 mL	CellTreat	978449
DPBS, calcium, magnesium, glucose, pyruvate	Gibco	14287-072
gentleMACS C Tubes	Miltenyi	130-093-237
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters	Miltenyi	130-096-427
Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail (100x)	Thermofisher	78420
Halt Protease Inhibitor Cocktail, EDTA free (100x)	Thermofisher	78437
HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red	Thermofisher	14065056
Latex beads, carboxylate-modified polystyrene, fluorescent red	Sigma-Aldrich	L3280
LightCycler 480 SYBR Green I Master	Roche	4707516001	This reagent was used to perform PCR.
MACS SmartStrainers (70 µm)	Miltenyi	130-110-916
Micro BCA Protein Assay Kit	Thermofisher	23235
M-PER Mammalian Extraction Buffer	Thermofisher	78503
MS Columns	Miltenyi	130-042-201	Referred as small columns in the protocol.
MultiMACS Cell24 Separator Plus	Miltenyi	130-098-637
PBSS, pH 7.4	Thermofisher	10010023
qScript XLT cDNA SuperMix	Quanta biosciences	733-1177	The kit was used to syntesize cDNA.
ReliaPrep RNA Miniprep Systems	Promega	Z6011	The kit contains 1-Thioglycerol and BL buffer (referred as lysis buffer in the protocol) and it was used to isolate total RNA.
Vacutainer safety-lok 21 G	Becton Dickinson	367282