Isolamento da microglia hipotalâmica do cérebro de camundongo adulto recém-perfundido por classificação de células ativadas por magnetismo

Resumo

Descrevemos um protocolo para isolar células microgliais do hipotálamo de camundongo (ou pequenas estruturas cerebrais equivalentes) usando classificação de células ativadas magneticamente (MACS), em um tempo relativamente curto. A microglia hipotalâmica classificada por MACS pode ser usada para análise ex vivo e pode ser plaqueada para realizar ensaios in vitro .

Resumo

A microglia, como macrófagos residentes do cérebro, é essencial para manter a homeostase cerebral. Eles moldam os circuitos neuronais durante o desenvolvimento, pesquisam seu ambiente em busca de detritos ou células mortas, bem como respondem a infecções e lesões no cérebro, entre muitas outras funções. No entanto, seu importante papel no neurodesenvolvimento e na plasticidade e fisiopatologia sináptica não foi totalmente definido, destacando a necessidade de mais investigações. Para obter uma compreensão mais abrangente do papel da microglia nesses processos, precisamos isolar a microglia e caracterizá-la geneticamente, metabolicamente e funcionalmente. No entanto, o isolamento da microglia de camundongos adultos, especialmente de pequenas estruturas cerebrais, é um desafio, pois eles representam uma pequena porcentagem do total de células cerebrais, e o rendimento da microglia isolada costuma ser muito baixo. Aqui, o isolamento magnético da microglia usando microesferas CD11b ⁺ nos permite classificar as células microgliais do hipotálamo de um cérebro de camundongo adulto recém-perfundido. O método atual nos permite alcançar pureza e rendimento relativamente altos em um curto período, mantendo a viabilidade celular.

Introdução

A microglia corresponde a 5-20% do total de células neurais e são as únicas células gliais que se originam de progenitores eritromieloides no saco vitelino e começam a colonizar o cérebro em desenvolvimento por volta do dia embrionário E9.5 ^1,2. São células de vida longa com a capacidade de se auto-renovar lentamente, independentemente das células derivadas da medula óssea³. Como algumas das células mais altamente dinâmicas, elas são capazes de adquirir diversos fenótipos em resposta a pistas contextuais e ambientais ^2,4. Entre os sinais capazes de modular sua atividade, os danos ao sistema nervoso central (SNC), a atividade neuronal, bem como os nutrientes, são os mais potentes. Um crescente corpo de pesquisas demonstrou o papel fundamental da microglia em lesões, doenças neurodegenerativas e obesidade ^2,5,6. No entanto, o papel preciso da microglia nos processos fisiológicos e na fisiopatologia requer mais estudos. Portanto, sua caracterização transcricional, metabólica e funcional em diferentes condições é de grande importância e requer seu isolamento, uma vez que estudos in situ são apropriados para localização de DNA, RNA e proteínas e comparações qualitativas, bem como caracterização morfológica da microglia.

Existem várias técnicas descritas para o isolamento da microglia, entre as quais estão o método do gradiente de Percoll⁷, a classificação de células por citometria de fluxo (FACS) ⁸ e a classificação de células ativadas magneticamente (MACS). A seleção do método apropriado depende dos objetivos do estudo e do nível de pureza necessário para aplicações a jusante. O isolamento da microglia pura do cérebro de camundongos adultos, especialmente de pequenas estruturas cerebrais como o hipotálamo, é um desafio devido ao número limitado de células microgliais. A dissociação suave automatizada do hipotálamo usando a tecnologia Miltenyi permite a purificação de um rendimento relativamente alto da microglia em um curto espaço de tempo com a capacidade de processar até oito amostras ao mesmo tempo com um gentleMACS Octo Dissociator.

A homogeneização do tecido é seguida pela purificação da microglia usando a tecnologia baseada em coluna MACS e os grânulos CD11b ⁺ de tamanho nanomagnético supermagnético. Portanto, todas as amostras são processadas exatamente da mesma maneira, produzindo células CD11b ⁺ intactas. Vale ressaltar que o CD11b não está presente exclusivamente na microglia, mas também é expresso em outras células da linhagem mieloide, incluindo macrófagos e monócitos⁹. Para limitar isso, a perfusão cerebral com solução salina gelada antes da extração do hipotálamo (consulte a etapa 2.6 do protocolo) garante a eliminação da maioria das células mieloides, deixando apenas uma fração potencialmente pequena de macrófagos residentes ou aderidos aos vasos sanguíneos. Os macrófagos e monócitos residentes de um SNC saudável em estado estacionário constituem uma pequena porcentagem do total de células imunes cerebrais (~ 10% e <2%, respectivamente) ^{10 , 11} . Portanto, quando as células cerebrais são classificadas com esferas CD11b ⁺, tanto a microglia quanto os macrófagos podem ser isolados, embora a grande maioria seja microglia.

O rendimento final da microglia e a manutenção de sua viabilidade nos permitem realizar ensaios ex vivo, bem como in vitro, com a vantagem de analisar regiões cerebrais específicas de interesse. As evidências mais recentes mostraram que a população de micróglias é altamente heterogênea, representando a expressão gênica específica da região e características morfológicas e função ^2,12,13. Portanto, o protocolo atual visa isolar e analisar a micróglia adulta de maneira específica da região. De fato, podemos caracterizar os perfis genéticos, transcricionais e translacionais da microglia hipotalâmica adulta usando métodos como RT-qPCR e sequenciamento de RNA, bem como realizando análises funcionais in vitro.

Protocolo

Todos os experimentos em animais descritos foram conduzidos em estrita conformidade com as recomendações da União Europeia (2013/63/UE) e foram aprovados pelo comitê de ética local da Universidade de Bordeaux (CEEA50) e pelo Ministério Francês de Ensino Superior, Pesquisa e Inovação (resumo não técnico do projeto aprovado NTS-FR-619193 v.1, 23-12-2022).

O protocolo a seguir é realizado em camundongos C57BL/6 adultos com idade média de 2 a 4 meses. No entanto, pode ser realizado em todas as idades e condições de camundongos, levando em consideração que a paisagem celular imune do SNC pode ser alterada e a porcentagem de macrófagos e monócitos residentes pode ser aumentada (por exemplo, no envelhecimento e neurodegeneração).

1. Preparação das soluções

NOTA: Os seguintes volumes e soluções referem-se estritamente ao isolamento de células Cd11b+.

1. Determine o volume total de D-PBS/0,5% de albumina de soro bovino (BSA) necessário com base no número de amostras. Prepare a solução usando o D-PBS disponível comercialmente com cálcio e magnésio e pó de BSA (consulte a Tabela de Materiais).
2. Prepare os tubos de dissociação rotulados (C-Tubes) e encha cada um com 1.900 μL de tampão Z, fornecido no kit de dissociação do tecido cerebral adulto (consulte a Tabela de Materiais). Descongele as enzimas e mantenha-as no gelo, juntamente com todos os tampões necessários nas etapas a seguir.
3. Prepare e coloque o volume apropriado de 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS) (consulte a Tabela de Materiais) necessário para a perfusão (etapa 2.6) no gelo. Calcule 10 mL para cada animal mais 10% em excesso.
4. Para análise de RT-qPCR, prepare tampão qPCR por amostra: 2,5 μL de tioglicerol + 250 μL de tampão de lise, usando um kit disponível comercialmente para purificar o RNA (consulte a Tabela de Materiais).
5. Para quantificação de proteínas, prepare o tampão de lise diluindo o coquetel de inibidores de fosfatase e o coquetel de inibidores de protease 1:100 em um tampão de extração de mamíferos (consulte a Tabela de Materiais).
6. Para a detecção de Espécies Reativas de Oxigênio (ROS) e ensaio de fagocitose, prepare 1x HBSS a partir do 10x HBSS disponível comercialmente (consulte a Tabela de Materiais). Em seguida, prepare o buffer FACS adicionando 0,2% BSA a 1x HBSS.

2. Remoção do cérebro

1. Sedar o animal com uma dose de 20 mg/kg de xilazina; Em seguida, eutanasiar o camundongo com uma overdose de 400 mg / kg de pentobarbital e colocá-lo em decúbito dorsal em uma bandeja de dissecação.
   NOTA: Outras combinações anestésicas para sacrificar o animal também podem funcionar.
2. Encha uma seringa de 10 mL com 10 mL de 1x PBS gelado e coloque-a em uma agulha borboleta 21 G.
3. Uma vez que o camundongo esteja completamente anestesiado (verifique beliscando as patas para garantir a falta de resposta), a respiração interrompida e o coração esteja em fibrilação, cubra a pele com uma pinça e abra a cavidade torácica com uma tesoura, ao nível das últimas costelas e do esterno.
4. Use a tesoura para fazer um corte profundo ao longo das laterais da caixa torácica em direção ao topo da caixa torácica para expor o coração.
5. Insira a agulha 21 G na parte distal do ventrículo esquerdo (certifique-se de que aproximadamente 1/3 da agulha esteja dentro do ventrículo). Faça imediatamente uma incisão no átrio direito usando a tesoura.
6. Infunda 10 mL de 1x PBS gelado para limpar o cérebro de quaisquer células imunológicas circulantes.
   NOTA: Verifique visualmente o cérebro para garantir que esteja limpo e bem perfundido.
7. Corte a cabeça do rato, extraia cuidadosamente o cérebro e coloque-o em uma placa de Petri cheia de gelo e coberta com papel alumínio.
   NOTA: A placa de Petri e a folha ajudam a ver os pedaços do cérebro. É benéfico manter um ambiente fresco durante o corte das peças cerebrais para limitar as atividades metabólicas.
8. Isole o hipotálamo usando uma pinça e corte-o em pedaços pequenos com lâminas de barbear.
   1. Para identificar e dissecar o hipotálamo, coloque o cérebro de cabeça para baixo de modo que o córtex fique ventral e o hipotálamo visível dorsalmente na superfície superior. Separe o hipotálamo, que está localizado na parte inferior do cérebro em ambos os lados do terceiro ventrículo, usando uma pinça curva. O peso médio do hipotálamo de camundongos C57BL/6 adultos é de 15 mg.
      NOTA: Os pedaços de cérebro devem ser o menor possível (<0,5 mm). Cortar em pedaços pequenos é uma etapa crítica, pois permite uma melhor dissociação e um maior rendimento de células.
9. Colete os pedaços do hipotálamo em tubos de dissociação (tubos C) previamente preenchidos com 1.900 μL de tampão Z (etapa 1.2).
   NOTA: Para ter um bom rendimento de células microgliais suficiente para realizar ensaios, agrupe um mínimo de dois (para quantificação de proteínas) ou três (para qPCR e RNAseq) hipotálamos por tubo.

3. Dissociação tecidual

NOTA: Todas as etapas devem ser executadas no gelo. Não vórtice a suspensão celular em nenhuma etapa; misture cuidadosamente apenas com uma pipeta de 1.000 μL.

1. Preparar a mistura enzimática 2 de acordo com a Tabela 1 (calculando o volume total para todos os tubos + 10% em excesso). Em cada tubo C, adicione 50 μL da enzima contida na mistura 1 (ver Tabela 1) e 30 μL da mistura enzimática 2. Todas as enzimas são fornecidas no kit de dissociação do tecido cerebral adulto (consulte a Tabela de Materiais).
2. Feche os tubos C e coloque-os de cabeça para baixo no dissociador com os suportes de aquecimento de acordo com as instruções do fabricante. Execute o programa 37C_ABDK_02.
3. Prepare tubos de pressão de 15 mL (consulte a Tabela de Materiais) com filtros de 70 μm em cima deles. Molhe o filtro com 2 mL de D-PBS.
4. Quando o programa de dissociação/digestão terminar, esvazie o tubo C no filtro e raspe com uma ponta de 200 μL para reduzir a perda celular, aumentando a filtração celular e reduzindo a aderência do homogeneizado de tecido no filtro.
5. Lave o tubo com 2 x 5 mL de D-PBS, esvazie as lavagens no filtro e raspe com uma ponta de 200 μL entre as lavagens.
6. Centrifugar a 300 × g durante 10 min a 4 °C e aspirar completamente o sobrenadante. Ressuspenda cuidadosamente o pellet celular com o volume apropriado de D-PBS frio de acordo com a Tabela 1.
7. Misture imediatamente cuidadosamente com 450 μL de reagente de gradiente de densidade (Solução de Remoção de Detritos, consulte a Tabela de Materiais) e cubra muito suavemente com 2 mL de D-PBS frio (consulte a Tabela 1).
   NOTA: Para obter as diferentes camadas de gradiente de densidade, o D-PBS deve ser sobreposto suavemente gota a gota, com o mínimo de "perturbação" possível, 1 mL de cada vez com uma pipeta de 1 mL.
8. Centrifugue a 3.000 × g durante 10 min a 4 °C com aceleração lenta e travão lento (se 9 for equivalente a cheio, utilizar 5).
9. Três fases são formadas. Aspire as duas fases superiores completamente e descarte-as. Certifique-se de não aspirar a terceira fase inferior.
10. Encha com 1800 μL de D-PBS frio e inverta suavemente o tubo 3 vezes.
11. Centrifugar a 1.000 × g durante 10 min a 4 °C com aceleração total e travão total e aspirar completamente o sobrenadante. Ressuspenda cuidadosamente o pellet celular pipetando lentamente para cima e para baixo com 2 mL de D-PBS / BSA.

4. Isolamento magnético de células CD11b ⁺

1. Centrifugar a 300 × g durante 10 min a 4 °C e aspirar completamente o sobrenadante. Ressuspenda cuidadosamente o pellet celular em 90 μL de tampão D-PBS/BSA.
2. Adicione 10 μL da mistura de microesferas CD11b e misture bem com a pipeta.
3. Incubar durante 15 min a 2-8 °C no frigorífico, não no gelo; lavar as células adicionando 1 ml de D-PBS/BSA e centrifugar a 300 × g durante 10 min a 4 °C; aspirar completamente o sobrenadante. Ressuspenda cuidadosamente em 500 μL de D-PBS/BSA.
4. Inicie o programa POSSEL2 no separador seguindo as instruções na tela. Coloque as pequenas colunas (consulte a Tabela de Materiais) no campo magnético.
   NOTA: Colunas pequenas ou grandes podem ser escolhidas para classificação de células magnéticas, de acordo com o número médio de células esperado. Colunas pequenas têm capacidade de até 1 × 10⁷ células rotuladas e colunas grandes de até 1 × 10⁸. Ao isolar células de pequenas estruturas, como o hipotálamo, pequenas colunas são aconselhadas. Os volumes dos reagentes são diferentes quando se utilizam colunas grandes (ver instruções do fabricante).
5. Umedeça as colunas (consulte a Tabela de Materiais) com 500 μL de D-PBS/BSA. Se a fração negativa de células (CD11b^-) for necessária para análise posterior, coloque uma placa coletora sob as colunas e, em seguida, aplique a suspensão celular nas colunas.
6. Execute três etapas de lavagem adicionando 500 μL de D-PBS/BSA de cada vez na coluna, cada vez esperando que o tampão passe pela coluna.
   NOTA: é importante evitar que a parte superior da coluna seque, por isso é aconselhável não esperar até que todo o buffer tenha passado.
7. Transferir o efluente total da fração CD11b^- dos poços da placa coletora para tubos de 15 mililitros.
8. Remova a coluna do separador, coloque-a em um tubo de 5 mL e pipete 1 mL de D-PBS / BSA na coluna.
9. Lave imediatamente a fração de célula marcada magneticamente aplicando firmemente o êmbolo fornecido com a coluna.
10. Eventualmente, conte as células CD11b ⁺ com um hemacitômetro ou qualquer outro método; Espere ~ 15.000 células por hipotálamo.
11. Centrifugar a suspensão celular a 300 ×g durante 10 min a 4 °C e rejeitar o sobrenadante.

5. Análises

1. Para a análise de RT-qPCR, ressuspenda os grânulos celulares com tampão qPCR (para preparação, ver passo 1.3) e armazene os tubos a -80 °C até à extração do ARNm. Isole o RNA total, processe-o e analise-o seguindo as diretrizes do MIQE¹⁴. Finalmente, sintetize o cDNA e execute qPCR usando um dispositivo RT-PCR. Consulte a Tabela de Materiais para todos os kits usados disponíveis comercialmente.
2. Para quantificação de proteínas, lave os pellets celulares com D-PBS (sem BSA) pelo menos 2x para eliminar o BSA. Em seguida, ressuspenda os grânulos celulares de dois hipotálamos com 20 μL de tampão de lise. Prossiga com a quantificação de proteínas com um kit de ensaio de proteínas (consulte a Tabela de Materiais).
   NOTA: Seguimos as instruções do fabricante¹⁵ para quantificar proteínas para realizar o ensaio de atividade de serina/treonina quinases.
3. Para a detecção de Espécies Reativas de Oxigênio (ROS) em células microgliais, ressuspenda o pellet em 1x HBSS. Trate as células seguindo o protocolo do fabricante do kit para Ensaio de Citometria de Fluxo (consulte a Tabela de Materiais). Em seguida, ressuspenda as células tratadas em 200 μL de tampão FACS (para preparação, consulte a etapa 1.5) e execute o FACS para detectar células estressadas oxidativamente.
4. Para o ensaio de fagocitose, incube as células classificadas em D-PBS/BSA com esferas de látex fluorescentes (consulte a Tabela de Materiais) por 30 min. Adapte o número de contas para ter 4 contas por célula em média. Em seguida, centrifugar a 300 × g durante 7 min a 4 °C, ressuspender em 200 μl de tampão FACS e ler a emissão de fluorescência por FACS (λ_ex 575 nm; λ_em 610 nm).

Resultados

A avaliação do rendimento final depende do nível de pureza e da quantidade de células isoladas e pode ser determinada por RT-qPCR, contagem de células e quantificação de proteínas. A pureza das células magnéticas isoladas do hipotálamo foi confirmada pela análise da expressão gênica de CD11b, C1qa, Gad1 e GFAP com RT-qPCR (Figura 1). CD11b e C1qa são predominantemente expressos pela micróglia em um estado estacionário do SNC¹⁶ e Gad1 e GFAP servem com...

Discussão

O protocolo atual apresenta o isolamento da microglia hipotalâmica do cérebro de camundongos adultos recém-perfundidos por Magnetic-Activated Cell Sorting. Os resultados apresentados acima confirmam a pureza e viabilidade das células isoladas, bem como a eficácia deste método para caracterizar funcionalmente a microglia ex vivo, por exemplo, através da atividade fagocítica e quantificação da produção de ROS. Métodos clássicos para o isolamento de uma população de células específica também pode...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adult Brain Dissociation Kit	Miltenyi	130-107-677	The kit contains buffer Z, buffer Y, enzymes A and P, Debris Removal Solution, buffer A (to dissolve enzyme A).
Albumin Bovine FrV BSA	EuroMedex	04-100-812-C
CD11b (Microglia) MicroBeads, human and mouse - small size	Miltenyi	130-093-636
CellROX Green Flow Cytometry Assay Kit	Invitrogen	C10492
Centrifuge Tube, Snap-Pop Lid 15 mL	CellTreat	978449
DPBS, calcium, magnesium, glucose, pyruvate	Gibco	14287-072
gentleMACS C Tubes	Miltenyi	130-093-237
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters	Miltenyi	130-096-427
Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail (100x)	Thermofisher	78420
Halt Protease Inhibitor Cocktail, EDTA free (100x)	Thermofisher	78437
HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red	Thermofisher	14065056
Latex beads, carboxylate-modified polystyrene, fluorescent red	Sigma-Aldrich	L3280
LightCycler 480 SYBR Green I Master	Roche	4707516001	This reagent was used to perform PCR.
MACS SmartStrainers (70 µm)	Miltenyi	130-110-916
Micro BCA Protein Assay Kit	Thermofisher	23235
M-PER Mammalian Extraction Buffer	Thermofisher	78503
MS Columns	Miltenyi	130-042-201	Referred as small columns in the protocol.
MultiMACS Cell24 Separator Plus	Miltenyi	130-098-637
PBSS, pH 7.4	Thermofisher	10010023
qScript XLT cDNA SuperMix	Quanta biosciences	733-1177	The kit was used to syntesize cDNA.
ReliaPrep RNA Miniprep Systems	Promega	Z6011	The kit contains 1-Thioglycerol and BL buffer (referred as lysis buffer in the protocol) and it was used to isolate total RNA.
Vacutainer safety-lok 21 G	Becton Dickinson	367282