Isolement de la microglie hypothalamique à partir du cerveau d’une souris adulte fraîchement perfusée par tri cellulaire activé par magnétisme

Résumé

Nous décrivons un protocole permettant d’isoler les cellules microgliales de l’hypothalamus de souris (ou de petites structures cérébrales équivalentes) en utilisant le tri cellulaire activé magnétiquement (MACS), dans un délai relativement court. La microglie hypothalamique triée par MACS peut être utilisée pour l’analyse ex vivo et peut être utilisée pour effectuer des essais in vitro .

Résumé

Les microglies, en tant que macrophages résidents du cerveau, sont essentielles au maintien de l’homéostasie du cerveau. Ils façonnent les circuits neuronaux au cours du développement, surveillent leur environnement à la recherche de débris ou de cellules mortes, et réagissent aux infections et aux lésions cérébrales, parmi de nombreuses autres fonctions. Cependant, leur rôle important dans le neurodéveloppement, la plasticité synaptique et la physiopathologie n’a pas été entièrement défini, ce qui souligne la nécessité d’études plus approfondies. Pour obtenir une compréhension plus complète du rôle de la microglie dans ces processus, nous devons isoler la microglie et la caractériser génétiquement, métaboliquement et fonctionnellement. Cependant, l’isolement des microglies chez les souris adultes, en particulier dans les petites structures cérébrales, est difficile car elles représentent un petit pourcentage de l’ensemble des cellules cérébrales et le rendement des microglies isolées est souvent trop faible. Ici, l’isolement magnétique de la microglie à l’aide de microbilles CD11b⁺ nous permet de trier les cellules microgliales de l’hypothalamus d’un cerveau de souris adulte fraîchement perfusé. La méthode actuelle nous permet d’obtenir une pureté et un rendement relativement élevés dans un court laps de temps tout en maintenant la viabilité cellulaire.

Introduction

Les microglies correspondent à 5 à 20% des cellules neurales totales et sont les seules cellules gliales qui proviennent de progéniteurs érythromyéloïdes dans le sac vitellin et commencent à coloniser le cerveau en développement vers le jour embryonnaire E9.5 ^1,2. Ce sont des cellules à longue durée de vie avec la capacité de s’auto-renouveler lentement, indépendamment des cellules dérivées de la moelle osseuse³. En tant que cellules parmi les plus dynamiques, elles sont capables d’acquérir divers phénotypes en réponse à des signaux contextuels et environnementaux ^2,4. Parmi les signaux capables de moduler leur activité, les lésions du système nerveux central (SNC), l’activité neuronale, ainsi que les nutriments, sont les plus puissants. De plus en plus de recherches ont démontré le rôle central de la microglie dans les blessures, les maladies neurodégénératives et l’obésité2,5,6. Néanmoins, le rôle précis de la microglie dans les processus physiologiques et la physiopathologie nécessite des études plus approfondies. Par conséquent, leur caractérisation transcriptionnelle, métabolique et fonctionnelle dans différentes conditions est d’une grande importance et nécessite leur isolement, car les études in situ sont appropriées pour la localisation de l’ADN, de l’ARN et des protéines et les comparaisons qualitatives, ainsi que pour la caractérisation morphologique de la microglie.

Il existe diverses techniques décrites pour l’isolement de la microglie, parmi lesquelles la méthode du gradient de Percoll⁷, le tri cellulaire par cytométrie en flux (FACS)⁸ et le tri cellulaire activé magnétiquement (MACS). Le choix de la méthode appropriée dépend des objectifs de l’étude et du niveau de pureté requis pour les applications en aval. L’isolement de la microglie pure du cerveau de la souris adulte, en particulier des petites structures cérébrales comme l’hypothalamus, est difficile en raison du nombre limité de cellules microgliales. La dissociation douce automatisée de l’hypothalamus à l’aide de la technologie Miltenyi permet de purifier un rendement microglial relativement élevé en peu de temps, avec la possibilité de procéder jusqu’à huit échantillons en même temps avec un Octo Dissociator gentleMACS.

L’homogénéisation des tissus est suivie d’une purification de la microglie à l’aide de la technologie MACS basée sur la colonne et des billes supermagnétiques de taille nanométrique CD11b⁺. Par conséquent, tous les échantillons sont traités exactement de la même manière, ce qui permet d’obtenir des cellules CD11b⁺ intactes. Il convient de noter que CD11b n’est pas exclusivement présent dans la microglie, mais qu’il est également exprimé sur d’autres cellules de la lignée myéloïde, notamment les macrophages et les monocytes⁹. Pour limiter cela, la perfusion cérébrale avec une solution saline glacée avant l’extraction de l’hypothalamus (voir l’étape 2.6 du protocole) assure l’élimination de la plupart des cellules myéloïdes, ne laissant qu’une fraction potentiellement faible des macrophages résidents ou de ceux qui adhèrent aux vaisseaux sanguins. Les macrophages et les monocytes résidents d’un SNC sain à l’état d’équilibre constituent un pourcentage mineur de l’ensemble des cellules immunitaires cérébrales (~10% et <2% respectivement)^10,11. Par conséquent, lorsque les cellules cérébrales sont triées avec des billes CD11b⁺, les microglies et les macrophages peuvent être isolés, bien que la grande majorité soient des microglies.

Le rendement final des microglies et le maintien de leur viabilité nous ont permis d’effectuer des essais ex vivo, ainsi que des essais in vitro, avec l’avantage d’analyser des régions cérébrales spécifiques d’intérêt. Les dernières preuves ont montré que la population de microglies est très hétérogène, représentant l’expression génique spécifique à une région et les caractéristiques morphologiques et la fonction ^2,12,13. Par conséquent, le protocole actuel vise à isoler et à analyser la microglie adulte d’une manière spécifique à la région. En effet, nous pouvons caractériser les profils génétiques, transcriptionnels et translationnels de la microglie hypothalamique adulte en utilisant des méthodes telles que la RT-qPCR et le séquençage de l’ARN, ainsi qu’en effectuant des analyses fonctionnelles in vitro.

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux décrites ont été menées dans le strict respect des recommandations de l’Union européenne (2013/63/UE) et ont été approuvées par le comité d’éthique local de l’Université de Bordeaux (CEEA50) et le ministère français de l’Enseignement supérieur, de la Recherche et de l’Innovation (résumé non technique du projet approuvé NTS-FR-619193 v.1, 23-12-2022).

Le protocole suivant est réalisé sur des souris C57BL/6 adultes âgées en moyenne de 2 à 4 mois. Cependant, elle pourrait être réalisée chez tous les âges et toutes les conditions de souris en tenant compte du fait que le paysage cellulaire immunitaire du SNC peut être altéré et que le pourcentage de macrophages et de monocytes résidents peut être augmenté (par exemple dans le vieillissement et la neurodégénérescence).

1. Préparation des solutions

REMARQUE : Les volumes et solutions suivants se rapportent strictement à l’isolement des cellules Cd11b+.

1. Déterminer le volume total de D-PBS/0,5 % d’albumine sérique bovine (BSA) requis en fonction du nombre d’échantillons. Préparez la solution à l’aide du D-PBS avec du calcium et du magnésium disponible dans le commerce et de la poudre de BSA (voir le tableau des matériaux).
2. Préparez des tubes de dissociation étiquetés (C-Tubes) et remplissez-les avec 1 900 μL de tampon Z, fourni dans la trousse de dissociation du tissu cérébral adulte (voir le tableau des matières). Décongelez les enzymes et conservez-les sur de la glace, ainsi que tous les tampons nécessaires dans les étapes suivantes.
3. Préparez et placez le volume approprié de 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (voir le tableau des matériaux) nécessaire à la perfusion (étape 2.6) sur de la glace. Calculez 10 ml pour chaque animal plus 10 % en excès.
4. Pour l’analyse RT-qPCR, préparez un tampon qPCR par échantillon : 2,5 μL de thioglycérol + 250 μL de tampon de lyse, à l’aide d’un kit disponible dans le commerce pour purifier l’ARN (voir le tableau des matériaux).
5. Pour la quantification des protéines, préparer le tampon de lyse en diluant le cocktail d’inhibiteurs de la phosphatase et le cocktail d’inhibiteurs de la protéase 1:100 dans un tampon d’extraction de mammifères (voir le tableau des matériaux).
6. Pour la détection des espèces réactives de l’oxygène (ROS) et le dosage de la phagocytose, préparer 1x HBSS à partir du 10x HBSS disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux). Ensuite, préparez le tampon FACS en ajoutant 0,2 % de BSA à 1x HBSS.

2. Ablation du cerveau

1. Endormir l’animal avec une dose de 20 mg/kg de xylazine ; Ensuite, euthanasiez la souris avec une surdose de 400 mg/kg de pentobarbital et placez-la en décubitus dorsal dans un plateau de dissection.
   REMARQUE : D’autres combinaisons d’anesthésiques pour euthanasier l’animal peuvent également fonctionner.
2. Remplissez une seringue de 10 ml avec 10 ml de PBS 1x glacé et fixez-la à une aiguille papillon de 21 g.
3. Une fois la souris complètement anesthésiée (vérifier en pinçant les pattes pour s’assurer d’une absence de réponse), la respiration arrêtée, et le cœur est en fibrillation, tentez la peau avec des pinces et ouvrez la cavité thoracique avec des ciseaux, au niveau des dernières côtes et du sternum.
4. Utilisez les ciseaux pour faire une coupe profonde le long des côtés de la cage thoracique vers le haut de la cage thoracique pour exposer le cœur.
5. Insérez l’aiguille 21 G dans la partie distale du ventricule gauche (assurez-vous qu’environ 1/3 de l’aiguille se trouve à l’intérieur du ventricule). Faites immédiatement une incision à travers l’oreillette droite à l’aide des ciseaux.
6. Infusez 10 ml de PBS 1x glacé pour nettoyer le cerveau de toutes les cellules immunitaires circulantes.
   REMARQUE : Vérifiez visuellement le cerveau pour vous assurer qu’il est propre et bien irrigué.
7. Coupez la tête de la souris, extrayez soigneusement le cerveau et placez-la sur une boîte de Pétri remplie de glace et recouverte de papier d’aluminium.
   REMARQUE : La boîte de Pétri et la feuille aident à voir les morceaux de cerveau. Il est bénéfique de maintenir un environnement frais pendant le hachage des morceaux de cerveau pour limiter les activités métaboliques.
8. Isolez l’hypothalamus à l’aide d’une pince et coupez-le en petits morceaux avec des lames de rasoir.
   1. Pour identifier et disséquer l’hypothalamus, placez le cerveau à l’envers de sorte que le cortex soit ventral et que l’hypothalamus soit visible dorsalement sur la surface supérieure. Séparez l’hypothalamus, qui est situé au bas du cerveau des deux côtés du troisième ventricule, à l’aide d’une pince incurvée. Le poids moyen de l’hypothalamus des souris C57BL/6 adultes est de 15 mg.
      REMARQUE : Les morceaux de cerveau doivent être aussi petits que possible (<0,5 mm). La découpe en petits morceaux est une étape critique puisqu’elle permet une meilleure dissociation et un rendement cellulaire plus élevé.
9. Recueillir les morceaux de l’hypothalamus dans des tubes de dissociation (tubes C) préalablement remplis de 1 900 μL de tampon Z (étape 1.2).
   REMARQUE : Pour avoir un bon rendement de cellules microgliales suffisant pour effectuer des tests, regroupez un minimum de deux (pour la quantification des protéines) ou trois (pour la qPCR et le RNAseq) hypothalami par tube.

3. Dissociation tissulaire

REMARQUE : Toutes les étapes doivent être effectuées sur de la glace. Ne vortex pas la suspension cellulaire dans aucune étape ; Mélangez uniquement soigneusement avec une pipette de 1 000 μL.

1. Préparez le mélange d’enzymes 2 selon le tableau 1 (en calculant le volume total de tous les tubes + 10% en excès). Dans chaque tube C, ajoutez 50 μL de l’enzyme contenue dans le mélange 1 (voir tableau 1) et 30 μL du mélange d’enzymes 2. Toutes les enzymes sont fournies dans le kit de dissociation des tissus cérébraux adultes (voir le tableau des matériaux).
2. Fermez les tubes C et placez-les à l’envers dans le dissociateur avec les supports chauffants selon les instructions du fabricant. Exécutez le programme 37C_ABDK_02.
3. Préparez des tubes à ressort de 15 ml (voir le tableau des matériaux) avec des crépines de 70 μm dessus. Mouillez la passoire avec 2 mL de D-PBS.
4. Lorsque le programme de dissociation/digestion est terminé, videz le tube C sur la crépine et grattez avec un embout de 200 μL pour réduire la perte de cellules en augmentant la filtration des cellules et en réduisant l’adhérence de l’homogénat de tissu sur le filtre.
5. Lavez le tube avec 2 x 5 mL de D-PBS, videz les lavages sur la passoire et grattez avec une pointe de 200 μL entre les lavages.
6. Centrifuger à 300 × g pendant 10 min à 4 °C et aspirer complètement le surnageant. Remettez soigneusement la pastille cellulaire en suspension avec le volume approprié de D-PBS froid conformément au tableau 1.
7. Mélanger immédiatement avec précaution 450 μL de réactif à gradient de densité (solution d’élimination des débris, voir le tableau des matériaux) et recouvrir très doucement de 2 mL de D-PBS froid (voir le tableau 1).
   REMARQUE : Pour obtenir les différentes couches de gradient de densité, le D-PBS doit être superposé doucement goutte à goutte, avec le moins de « perturbation » possible, 1 mL à la fois avec une pipette de 1 mL.
8. Centrifugeuse à 3 000 × g pendant 10 min à 4 °C avec accélération lente et freinage lent (si 9 équivaut à plein, utilisez 5).
9. Trois phases se forment. Aspirez complètement les deux phases supérieures et jetez-les. Assurez-vous de ne pas aspirer la troisième phase inférieure.
10. Remplissez avec 1800 μL de D-PBS froid et retournez doucement le tube 3 fois.
11. Centrifuger à 1 000 × g pendant 10 min à 4 °C avec une accélération maximale et un freinage complet et aspirer complètement le surnageant. Remettez soigneusement la pastille en suspension en le pipetant lentement de haut en bas avec 2 mL de D-PBS/BSA.

4. Isolement magnétique des cellules CD11b⁺

1. Centrifuger à 300 × g pendant 10 min à 4 °C et aspirer complètement le surnageant. Remettez soigneusement la pastille cellulaire en suspension dans 90 μL de tampon D-PBS/BSA.
2. Ajouter 10 μL du mélange CD11b-microbilles et bien mélanger avec la pipette.
3. Incuber pendant 15 min à 2-8 °C au réfrigérateur, pas sur de la glace ; laver les cellules en ajoutant 1 mL de D-PBS/BSA et centrifuger à 300 × g pendant 10 min à 4 °C ; aspirer complètement le surnageant. Remettre en suspension avec précaution dans 500 μL de D-PBS/BSA.
4. Lancez le programme POSSEL2 sur le séparateur en suivant les instructions à l’écran. Placez les petites colonnes (voir le tableau des matériaux) dans le champ magnétique.
   REMARQUE : Des colonnes petites ou grandes peuvent être choisies pour le tri des cellules magnétiques, en fonction du nombre moyen de cellules attendues. Les petites colonnes ont une capacité allant jusqu’à 1 × 10⁷ cellules étiquetées et les grandes colonnes jusqu’à 1 × 10⁸. Lors de l’isolement de cellules de petites structures, telles que l’hypothalamus, de petites colonnes sont conseillées. Les volumes de réactifs sont différents lors de l’utilisation de grandes colonnes (voir les instructions du fabricant).
5. Mouillez les colonnes (voir le tableau des matériaux) avec 500 μL de D-PBS/BSA. Si la fraction négative des cellules (CD11b^-) est nécessaire pour une analyse plus approfondie, placez une plaque collectrice sous les colonnes, puis appliquez une suspension cellulaire dans les colonnes.
6. Effectuez trois étapes de lavage en ajoutant 500 μL de D-PBS/BSA à la fois dans la colonne, en attendant à chaque fois que la mémoire tampon passe à travers la colonne.
   REMARQUE : il est important d’éviter que la partie supérieure de la colonne ne se dessèche, il est donc conseillé de ne pas attendre que tout le tampon soit passé.
7. Transvaser ^{la totalité de} l’effluent de la fraction CD11b des puits de la plaque collectrice dans des tubes de 15 millilitres.
8. Retirez la colonne du séparateur, placez-la sur un tube de 5 ml et pipetez 1 ml de D-PBS/BSA dans la colonne.
9. Rincez immédiatement la fraction cellulaire marquée magnétiquement en appliquant fermement le piston fourni avec la colonne.
10. Éventuellement, comptez les cellules CD11b⁺ à l’aide d’un hémacytomètre ou de toute autre méthode ; attendez-vous à ~15 000 cellules par hypothalamus.
11. Centrifuger la suspension cellulaire à 300 ×g pendant 10 min à 4 °C et jeter le surnageant.

5. Analyses

1. Pour l’analyse RT-qPCR, remettre en suspension les pastilles cellulaires avec un tampon qPCR (pour la préparation, voir l’étape 1.3) et stocker les tubes à - 80 °C jusqu’à l’extraction de l’ARNm. Isolez l’ARN total, puis traitez-le et analysez-le conformément aux directives MIQE¹⁴. Enfin, synthétisez l’ADNc et effectuez une qPCR à l’aide d’un appareil RT-PCR. Voir le tableau des matériaux pour tous les kits disponibles dans le commerce utilisés.
2. Pour la quantification des protéines, lavez les pastilles cellulaires avec du D-PBS (sans BSA) au moins 2 fois pour éliminer les BSA. Ensuite, remettre en suspension les pastilles cellulaires de deux hypothalamus avec 20 μL de tampon de lyse. Procédez à la quantification des protéines à l’aide d’un kit de dosage des protéines (voir le tableau des matériaux).
   REMARQUE : Nous avons suivi les instructions du fabricant¹⁵ pour quantifier les protéines afin d’effectuer le test d’activité des kinases sérine/thréonine.
3. Pour la détection des espèces réactives de l’oxygène (ROS) dans les cellules microgliales, remettre la pastille en suspension dans 1x HBSS. Traitez les cellules en suivant le protocole du fabricant du kit pour le test de cytométrie en flux (voir le tableau des matériaux). Ensuite, remettez en suspension les cellules traitées dans 200 μL de tampon FACS (pour la préparation, voir l’étape 1.5) et effectuez un FACS pour détecter les cellules en stress oxydatif.
4. Pour le dosage de la phagocytose, incuber les cellules triées dans du D-PBS/BSA avec des billes de latex fluorescentes (voir le tableau des matériaux) pendant 30 min. Adaptez le nombre de billes pour avoir 4 billes par cellule en moyenne. Centrifuger ensuite à 300 × g pendant 7 min à 4 °C, remettre en suspension dans 200 μL de tampon FACS, et lire l’émission de fluorescence par FACS (λ_ex 575 nm ; λ_em 610 nm).

Résultats

L’évaluation du rendement final repose sur le niveau de pureté et la quantité de cellules isolées et pourrait être déterminée par RT-qPCR, comptage cellulaire et quantification des protéines. La pureté des cellules magnétiques isolées de l’hypothalamus a été confirmée par l’analyse de l’expression génique de CD11b, C1qa, Gad1 et GFAP avec RT-qPCR (Figure 1). CD11b et C1qa sont principalement exprimés par la microglie à l’état d’équilibre, le SNC

Discussion

Le protocole actuel présente l’isolement de la microglie hypothalamique à partir du cerveau de souris adulte fraîchement perfusé par tri cellulaire activé magnétiquement. Les résultats présentés ci-dessus confirment la pureté et la viabilité des cellules isolées, ainsi que l’efficacité de cette méthode pour caractériser fonctionnellement la microglie ex vivo, par exemple par l’activité phagocytaire et la quantification de la production de ROS. Les méthodes classiques d’isolement d’une ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adult Brain Dissociation Kit	Miltenyi	130-107-677	The kit contains buffer Z, buffer Y, enzymes A and P, Debris Removal Solution, buffer A (to dissolve enzyme A).
Albumin Bovine FrV BSA	EuroMedex	04-100-812-C
CD11b (Microglia) MicroBeads, human and mouse - small size	Miltenyi	130-093-636
CellROX Green Flow Cytometry Assay Kit	Invitrogen	C10492
Centrifuge Tube, Snap-Pop Lid 15 mL	CellTreat	978449
DPBS, calcium, magnesium, glucose, pyruvate	Gibco	14287-072
gentleMACS C Tubes	Miltenyi	130-093-237
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters	Miltenyi	130-096-427
Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail (100x)	Thermofisher	78420
Halt Protease Inhibitor Cocktail, EDTA free (100x)	Thermofisher	78437
HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red	Thermofisher	14065056
Latex beads, carboxylate-modified polystyrene, fluorescent red	Sigma-Aldrich	L3280
LightCycler 480 SYBR Green I Master	Roche	4707516001	This reagent was used to perform PCR.
MACS SmartStrainers (70 µm)	Miltenyi	130-110-916
Micro BCA Protein Assay Kit	Thermofisher	23235
M-PER Mammalian Extraction Buffer	Thermofisher	78503
MS Columns	Miltenyi	130-042-201	Referred as small columns in the protocol.
MultiMACS Cell24 Separator Plus	Miltenyi	130-098-637
PBSS, pH 7.4	Thermofisher	10010023
qScript XLT cDNA SuperMix	Quanta biosciences	733-1177	The kit was used to syntesize cDNA.
ReliaPrep RNA Miniprep Systems	Promega	Z6011	The kit contains 1-Thioglycerol and BL buffer (referred as lysis buffer in the protocol) and it was used to isolate total RNA.
Vacutainer safety-lok 21 G	Becton Dickinson	367282