Hipotalamik Mikroglia'nın Manyetik Olarak Aktive Edilmiş Hücre Ayıklama ile Yeni Perfüze Edilmiş Yetişkin Fare Beyninden İzolasyonu

Özet

Manyetik olarak aktive edilmiş hücre sınıflandırması (MACS) kullanarak fare hipotalamusundan (veya eşdeğer küçük beyin yapılarından) mikroglial hücreleri nispeten kısa sürede izole etmek için bir protokol açıklıyoruz. MACS ile sıralanan hipotalamik mikroglia, ex vivo analiz için kullanılabilir ve in vitro testler yapmak üzere kaplanabilir.

Özet

Beynin yerleşik makrofajları olan mikroglia, beyin homeostazını korumak için gereklidir. Gelişim sırasında nöronal devreleri şekillendirirler, çevrelerini enkaz veya ölü hücreler için incelerler ve diğer birçok işlevin yanı sıra beyindeki enfeksiyon ve yaralanmalara yanıt verirler. Bununla birlikte, nörogelişim ve sinaptik plastisite ve patofizyolojideki önemli rolleri tam olarak tanımlanmamıştır ve bu da daha fazla araştırmaya duyulan ihtiyacı vurgulamaktadır. Mikroglia'nın bu süreçlerdeki rolünü daha kapsamlı bir şekilde anlamak için, mikrogliaları izole etmemiz ve bunları genetik, metabolik ve fonksiyonel olarak karakterize etmemiz gerekir. Bununla birlikte, mikroglia'nın yetişkin farelerden, özellikle küçük beyin yapılarından izolasyonu, toplam beyin hücrelerinin küçük bir yüzdesini temsil ettikleri ve izole edilmiş mikroglia'nın verimi genellikle çok düşük olduğu için zordur. Burada, CD11b ⁺ mikro boncuklar kullanılarak mikroglia'nın manyetik izolasyonu, mikroglial hücreleri yeni perfüze edilmiş bir yetişkin fare beyninin hipotalamusundan ayırmamıza izin verir. Mevcut yöntem, hücre canlılığını korurken kısa sürede nispeten yüksek saflık ve verim elde etmemizi sağlar.

Giriş

Mikroglia, toplam nöral hücrelerin %5-20'sine karşılık gelir ve yolk kesesi içindeki eritromiyeloid progenitörlerden köken alan ve gelişmekte olan beyni embriyonik gün E9.5 ^1,2 civarında kolonize etmeye başlayan tek glial hücrelerdir. Kemik iliği kaynaklı hücrelerden bağımsız olarak yavaş yavaş kendini yenileme yeteneğine sahip uzun ömürlü hücrelerdir³. En yüksek dinamik hücrelerden bazıları olarak, bağlamsal ve çevresel ipuçlarına yanıt olarak çeşitli fenotipler elde edebilirler ^2,4. Aktivitelerini modüle edebilen sinyaller arasında, merkezi sinir sistemi (CNS) hasarı, nöronal aktivite ve besinler en güçlü olanıdır. Artan bir araştırma grubu, mikroglia'nın yaralanma, nörodejeneratif hastalıklar ve obezitede önemli rolünü göstermiştir ^2,5,6. Bununla birlikte, mikroglia'nın hem fizyolojik süreçlerde hem de patofizyolojideki kesin rolü daha fazla çalışma gerektirir. Bu nedenle, farklı koşullar altında transkripsiyonel, metabolik ve fonksiyonel karakterizasyonları büyük önem taşır ve izolasyonlarını gerektirir, çünkü in situ çalışmalar DNA, RNA ve protein lokalizasyonu ve kalitatif karşılaştırmaların yanı sıra mikroglia'nın morfolojik karakterizasyonu için uygundur.

Mikroglia izolasyonu için tanımlanmış çeşitli teknikler vardır, bunlar arasında Percoll gradyan yöntemi⁷, akış-sitometri hücre sıralaması (FACS)⁸ ve manyetik olarak aktive edilmiş hücre sıralaması (MACS) vardır. Uygun yöntemin seçimi, çalışmanın amaçlarına ve sonraki uygulamalar için gereken saflık seviyesine bağlıdır. Saf mikroglia'nın yetişkin fare beyninden, özellikle hipotalamus gibi küçük beyin yapılarından izolasyonu, sınırlı sayıda mikroglial hücre nedeniyle zordur. Miltenyi teknolojisi kullanılarak hipotalamusun otomatik olarak nazikçe ayrıştırılması, nazikMACS Octo Dissociator ile aynı anda sekiz numuneye kadar ilerleyebilme yeteneği ile kısa sürede nispeten yüksek bir mikroglia veriminin saflaştırılmasına olanak tanır.

Doku homojenizasyonunu, MACS kolon tabanlı teknoloji ve süper manyetik nano boyutlu CD11b⁺ boncuklar kullanılarak mikroglia saflaştırması takip eder. Bu nedenle, tüm numuneler tam olarak aynı şekilde işlenir ve bozulmamış CD11b⁺ hücreleri elde edilir. CD11b'nin sadece mikroglia'da bulunmadığı, aynı zamanda makrofajlar ve monositler⁹ dahil olmak üzere diğer miyeloid soy hücrelerinde de eksprese edildiği dikkat çekicidir. Bunu sınırlamak için, hipotalamus ekstraksiyonundan önce buz gibi soğuk tuzlu su çözeltisi ile beyin perfüzyonu (protokol adımı 2.6'ya bakınız), çoğu miyeloid hücrenin ortadan kaldırılmasını sağlar ve yerleşik makrofajların veya kan damarlarına yapışmış olanların potansiyel olarak küçük bir kısmını bırakır. Sağlıklı ve kararlı bir durum CNS'nin yerleşik makrofajları ve monositleri, toplam beyin bağışıklık hücrelerinin küçük bir yüzdesini oluşturur (sırasıyla ~%10 ve %<2)^10,11. Bu nedenle, beyin hücreleri CD11b ⁺ boncukları ile sıralandığında, hem mikroglia hem de makrofajlar izole edilebilir, ancak büyük çoğunluğu mikrogliadır.

Mikroglia'nın son verimi ve canlılıklarının korunması, ilgilenilen belirli beyin bölgelerini analiz etme avantajı ile in vitro testlerin yanı sıra ex vivo olarak da gerçekleştirmemize izin verir. En son kanıtlar, mikroglia popülasyonunun oldukça heterojen olduğunu, bölgeye özgü gen ekspresyonunu ve morfolojik özellikleri ve işlevi temsil ettiğini göstermiştir ^2,12,13. Bu nedenle, mevcut protokol yetişkin mikroglialarını bölgeye özgü bir şekilde izole etmeyi ve analiz etmeyi amaçlamaktadır. Gerçekten de, yetişkin hipotalamik mikroglia'nın genetik, transkripsiyonel ve translasyonel profillerini RT-qPCR ve RNA dizileme gibi yöntemler kullanarak ve ayrıca in vitro fonksiyonel analiz yaparak karakterize edebiliriz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Açıklanan tüm hayvan deneyleri, Avrupa Birliği tavsiyelerine (2013/63/EU) sıkı bir şekilde uygun olarak yürütülmüş ve Bordeaux Üniversitesi yerel etik komitesi (CEEA50) ve Fransa Yüksek Öğrenim, Araştırma ve Yenilik Bakanlığı tarafından onaylanmıştır (onaylanmış proje NTS-FR-619193 v.1, 23-12-2022'nin teknik olmayan özeti).

Aşağıdaki protokol, ortalama yaşı 2-4 ay olan yetişkin C57BL / 6 farelerinde gerçekleştirilir. Bununla birlikte, CNS'nin bağışıklık hücresi manzarasının değişebileceği ve yerleşik makrofajların ve monositlerin yüzdesinin artabileceği (örneğin yaşlanma ve nörodejenerasyonda) dikkate alınarak tüm farelerde, yaşlarda ve koşullarda gerçekleştirilebilir.

1. Çözeltilerin hazırlanması

NOT: Aşağıdaki hacimler ve çözeltiler kesinlikle Cd11b+ hücrelerinin izolasyonuna atıfta bulunulmuştur.

1. Numune sayısına bağlı olarak gereken toplam D-PBS /% 0.5 Sığır Serum Albümini (BSA) hacmini belirleyin. Çözeltiyi, piyasada bulunan Kalsiyum ve Magnezyum ve BSA tozu içeren D-PBS'yi kullanarak hazırlayın ( Malzeme Tablosuna bakın).
2. Etiketli ayrışma tüplerini (C-Tüpleri) hazırlayın ve her birini yetişkin beyin dokusu ayrışma kitinde sağlanan 1.900 μL tampon Z ile doldurun ( Malzeme Tablosuna bakınız). Enzimleri çözün ve aşağıdaki adımlarda gerekli olan tüm tamponlarla birlikte buz üzerinde tutun.
3. Perfüzyon (adım 2.6) için gerekli olan uygun hacimde 1x Fosfat Tamponlu Salin (PBS) ( Malzeme Tablosuna bakınız) hazırlayın ve buz üzerine yerleştirin. Her hayvan için 10 mL artı fazla% 10 hesaplayın.
4. RT-qPCR analizi için, numune başına qPCR tamponu hazırlayın: RNA'yı saflaştırmak için ticari olarak mevcut bir kit kullanarak 2,5 μL tiyokliserol + 250 μL lizis tamponu (Malzeme Tablosuna bakınız).
5. Protein miktar tayini için, fosfataz inhibitör kokteylini ve proteaz inhibitör kokteylini bir memeli ekstraksiyon tamponunda 1:100 oranında seyrelterek lizis tamponu hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakınız).
6. Reaktif Oksijen Türlerinin (ROS) tespiti ve fagositoz testi için, piyasada bulunan 10x HBSS'den 1x HBSS hazırlayın ( Malzeme Tablosuna bakınız). Ardından, 1x HBSS'ye %0,2 BSA ekleyerek FACS tamponunu hazırlayın.

2. Beynin çıkarılması

1. Hayvanı 20 mg / kg Ksilazin dozu ile sakinleştirin; Daha sonra, fareyi aşırı dozda 400 mg / kg pentobarbital ile ötenazi yapın ve sırtüstü bir diseksiyon tepsisine yerleştirin.
   NOT: Hayvanı ötenazi yapmak için diğer anestezik kombinasyonlar da işe yarayabilir.
2. 10 mL'lik bir şırıngayı 10 mL buz gibi soğuk 1x PBS ile doldurun ve bir kelebek 21 G iğnesine takın.
3. Fare tamamen uyuşturulduktan sonra (yanıt eksikliğini sağlamak için pençeleri sıkıştırarak doğrulayın), solunum durdu ve kalp fibrilasyona girdi, cildi forseps ile örtün ve göğüs boşluğunu makasla açın, son kaburgalar ve sternum seviyesinde.
4. Kalbi ortaya çıkarmak için göğüs kafesinin kenarları boyunca göğüs kafesinin üst kısmına doğru derin bir kesim yapmak için makası kullanın.
5. 21 G iğnesini sol ventrikülün distal kısmına yerleştirin (iğnenin yaklaşık 1 / 3'ünün ventrikülün içinde olduğundan emin olun). Makası kullanarak hemen sağ atriyumdan bir kesi yapın.
6. Beyni dolaşımdaki bağışıklık hücrelerinden temizlemek için 10 mL buz gibi soğuk 1x PBS demleyin.
   NOT: Temiz ve iyi perfüze edildiğinden emin olmak için beyni görsel olarak kontrol edin.
7. Fare kafasını kesin, beyni dikkatlice çıkarın ve buzla doldurulmuş ve alüminyum folyo ile kaplanmış bir Petri kabına yerleştirin.
   NOT: Petri kabı ve folyo beyin parçalarının görülmesine yardımcı olur. Metabolik aktiviteleri sınırlamak için beyin parçalarının doğranması sırasında serin bir ortamın korunmasında fayda vardır.
8. Hipotalamusu forseps kullanarak izole edin ve jiletle küçük parçalar halinde kesin.
   1. Hipotalamusu tanımlamak ve incelemek için, beyni baş aşağı yerleştirin, böylece korteks ventral olur ve hipotalamus üst yüzeyde dorsal olarak görünür hale gelir. Üçüncü ventrikülün her iki yanında beynin alt kısmında bulunan hipotalamusu kavisli forseps kullanarak ayırın. Yetişkin C57BL / 6 farelerden alınan hipotalamusun ortalama ağırlığı 15 mg'dır.
      NOT: Beyin parçaları mümkün olduğunca küçük olmalıdır (<0,5 mm). Küçük parçalara ayırmak, daha iyi bir ayrışma ve daha yüksek hücre verimi sağladığı için kritik bir adımdır.
9. Hipotalamus parçalarını, daha önce 1.900 μL Tampon Z ile doldurulmuş ayrışma tüplerinde (C-Tüpleri) toplayın (adım 1.2).
   NOT: Tahlilleri gerçekleştirmek için yeterli olan iyi bir mikroglial hücre verimine sahip olmak için, tüp başına en az iki (protein ölçümü için) veya üç (qPCR ve RNAseq için) hipotalami havuzlayın.

3. Doku ayrışması

NOT: Tüm adımlar buz üzerinde gerçekleştirilmelidir. Hücre süspansiyonunu herhangi bir adımda girdap yapmayın; sadece 1.000 μL'lik bir pipetle dikkatlice karıştırın.

1. Enzim karışımı 2'yi Tablo 1'e göre hazırlayın (tüm tüpler için toplam hacim + fazla% 10 hesaplanarak). Her bir C-tüpüne, karışım 1'de bulunan 50 μL enzim (bakınız Tablo 1) ve 30 μL enzim karışımı 2 ekleyin. Tüm enzimler yetişkin beyin dokusu ayrışma kitinde bulunur ( Materyal Tablosuna bakınız).
2. C-tüplerini kapatın ve üreticinin talimatlarına göre ısıtma braketleri ile ayırıcıya baş aşağı yerleştirin. Programı 37C_ABDK_02 çalıştırın.
3. Üzerlerinde 70 μm süzgeçler bulunan 15 mL'lik geçmeli tüpler hazırlayın ( Malzeme Tablosuna bakın). Süzgeci 2 mL D-PBS ile ıslatın.
4. Ayrışma/sindirim programı bittiğinde, C-Tüpünü süzgecin üzerine boşaltın ve hücre filtrasyonunu artırarak ve doku homojenatının filtreye yapışmasını azaltarak hücre kaybını azaltmak için 200 μL'lik bir uçla çizin.
5. Tüpü 2 x 5 mL D-PBS ile yıkayın, yıkamaları süzgecin üzerine boşaltın ve yıkamalar arasında 200 μL'lik bir uçla çizin.
6. 300 × g'da 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı tamamen aspire edin. Hücre peletini Tablo 1'e göre uygun hacimde soğuk D-PBS ile dikkatlice yeniden süspanse edin.
7. Hemen 450 μL yoğunluk gradyan reaktifi (Kalıntı Giderme Solüsyonu, Malzeme Tablosuna bakınız) ile dikkatlice karıştırın ve 2 mL soğuk D-PBS ile çok nazikçe kaplayın (bkz. Tablo 1).
   NOT: Farklı yoğunluk gradyan katmanlarını elde etmek için, D-PBS, 1 mL'lik bir pipetle bir seferde 1 mL olmak üzere, mümkün olan en az "rahatsızlık" ile yavaşça damla damla üst üste bindirilmelidir.
8. Yavaş hızlanma ve yavaş frenleme ile 4 ° C'de 10 dakika boyunca 3.000 × g'da santrifüjleyin (9 doluya eşdeğerse, 5 kullanın).
9. Üç faz oluşur. En üstteki iki fazı tamamen aspire edin ve atın. Üçüncü alt fazı aspire etmediğinizden emin olun.
10. 1800 μL soğuk D-PBS ile doldurun ve tüpü 3 kez nazikçe ters çevirin.
11. 1.000 × g'da 4 ° C'de 10 dakika boyunca tam hızlanma ve tam fren ile santrifüjleyin ve süpernatanı tamamen aspire edin. 2 mL D-PBS/BSA ile yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyerek hücre peletini dikkatlice yeniden süspanse edin.

4. CD11b ⁺ hücrelerinin manyetik izolasyonu

1. 300 × g'da 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı tamamen aspire edin. Hücre peletini 90 μL tampon D-PBS/BSA'da dikkatlice yeniden süspanse edin.
2. 10 μL CD11b-mikroboncuk karışımı ekleyin ve pipetle iyice karıştırın.
3. Buz üzerinde değil, buzdolabında 2-8 °C'de 15 dakika inkübe edin; hücreleri 1 mL D-PBS/BSA ekleyerek yıkayın ve 300 × g'da 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin; Süpernatanı tamamen aspire edin. 500 μL D-PBS/BSA içinde dikkatlice yeniden süspanse edin.
4. Ekrandaki talimatları izleyerek ayırıcı üzerindeki POSSEL2 programını başlatın. Küçük sütunları ( Malzeme Tablosuna bakın) manyetik alana yerleştirin.
   NOT: Beklenen ortalama hücre sayısına göre manyetik hücre sıralama için küçük veya büyük sütunlar seçilebilir. Küçük sütunlar 1 × 10⁷ etiketli hücrelere ve büyük sütunlar 1 × 10^8'e kadar kapasiteye sahiptir. Hücreleri hipotalamus gibi küçük yapılardan izole ederken, küçük sütunlar tavsiye edilir. Büyük sütunlar kullanıldığında reaktiflerin hacimleri farklıdır (üreticinin talimatlarına bakın).
5. Sütunları ( Malzeme Tablosuna bakın) 500 μL D-PBS/BSA ile ıslatın. Daha fazla analiz için hücrelerin negatif fraksiyonu (CD11b^-) gerekiyorsa, sütunların altına bir toplama plakası yerleştirin ve ardından sütunlara hücre süspansiyonu uygulayın.
6. Kolona bir seferde 500 μL D-PBS/BSA ekleyerek üç yıkama adımı gerçekleştirin ve her seferinde tamponun kolondan geçmesini bekleyin.
   NOT: Kolonun üst kısmının kurumasını önlemek önemlidir, bu nedenle tüm tamponun geçmesini beklememeniz önerilir.
7. CD11b-fraksiyonunun toplam atık suyunu toplama plakasının kuyularından 15 mililitrelik tüplere aktarın.
8. Kolonu separatörden çıkarın, 5 mL'lik bir tüpe yerleştirin ve kolona 1 mL D-PBS/BSA pipetleyin.
9. Kolonla birlikte verilen pistonu sıkıca uygulayarak manyetik olarak etiketlenmiş hücre fraksiyonunu hemen yıkayın.
10. Sonunda, CD11b ⁺ hücrelerini bir hematitometre veya başka bir yöntemle sayın; Hipotalamus başına ~ 15.000 hücre bekleyin.
11. Hücre süspansiyonunu 300 × g'da 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın.

5. Analizler

1. RT-qPCR analizi için, hücre peletlerini qPCR tamponu ile yeniden süspanse edin (hazırlık için bkz. adım 1.3) ve tüpleri mRNA ekstraksiyonuna kadar - 80 °C'de saklayın. Toplam RNA'yı izole edin, ardından MIQE yönergelerini izleyerek işleyin ve analiz edin¹⁴. Son olarak, cDNA'yı sentezleyin ve bir RT-PCR cihazı kullanarak qPCR gerçekleştirin. Kullanılan ticari olarak mevcut tüm kitler için Malzeme Tablosuna bakın.
2. Protein miktar tayini için, BSA'yı ortadan kaldırmak için hücre peletlerini D-PBS (BSA olmadan) ile en az 2 kez yıkayın. Daha sonra, hücre peletlerini 20 μL lizis tamponu ile iki hipotalamiden yeniden süspanse edin. Bir protein tahlil kiti ile protein miktar tayinine devam edin (Malzeme Tablosuna bakınız).
   NOT: Serin/treonin kinaz aktivite testini gerçekleştirmek için proteinleri ölçmek için üreticinin talimatlarını¹⁵ takip ettik.
3. Mikroglial hücrelerde Reaktif Oksijen Türlerinin (ROS) tespiti için peleti 1x HBSS'de yeniden süspanse edin. Hücreleri, Akış Sitometrisi Testi için kitin üreticisinin protokolünü izleyerek tedavi edin ( Malzeme Tablosuna bakın). Daha sonra, tedavi edilen hücreleri 200 μL FACS tamponunda yeniden süspanse edin (hazırlık için bkz. adım 1.5) ve oksidatif olarak stresli hücreleri tespit etmek için FACS gerçekleştirin.
4. Fagositoz tahlili için, D-PBS / BSA'da sıralanan hücreleri floresan lateks boncuklarla ( Malzeme Tablosuna bakınız) 30 dakika inkübe edin. Boncuk sayısını hücre başına ortalama 4 boncuk olacak şekilde ayarlayın. Daha sonra 4 ° C'de 7 dakika boyunca 300 × g'da santrifüjleyin, 200 μL FACS tamponunda yeniden süspanse edin ve FACS ile floresan emisyonunu okuyun (λ_ex 575 nm; λ_em 610 nm).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Nihai verimin değerlendirilmesi, saflık seviyesine ve izole edilen hücrelerin miktarına dayanır ve RT-qPCR, hücre sayımı ve protein miktar tayini ile belirlenebilir. Hipotalamustan izole edilen manyetik hücrelerin saflığı, RT-qPCR ile CD11b, C1qa, Gad1 ve GFAP'nin gen ekspresyon analizi ile doğrulandı (Şekil 1). CD11b ve C1qa ağırlıklı olarak kararlı bir durumda mikroglia tarafından eksprese edilir, CNS¹⁶ ve Gad1 ve GFAP sırasıyla nöronal ve as...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Mevcut protokol, Manyetik Aktive Hücre Sıralama ile yeni perfüze edilmiş yetişkin fare beyninden hipotalamik mikroglia izolasyonunu sunmaktadır. Yukarıda sunulan sonuçlar, izole edilmiş hücrelerin saflığını ve canlılığını ve ayrıca bu yöntemin, örneğin fagositik aktivite ve ROS üretim ölçümü yoluyla mikroglia'yı ex vivo işlevsel olarak karakterize etmek için etkinliğini doğrulamaktadır. Belirli bir hücre popülasyonunun izolasyonu için klasik yöntemler mikroglial hücreler i?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adult Brain Dissociation Kit	Miltenyi	130-107-677	The kit contains buffer Z, buffer Y, enzymes A and P, Debris Removal Solution, buffer A (to dissolve enzyme A).
Albumin Bovine FrV BSA	EuroMedex	04-100-812-C
CD11b (Microglia) MicroBeads, human and mouse - small size	Miltenyi	130-093-636
CellROX Green Flow Cytometry Assay Kit	Invitrogen	C10492
Centrifuge Tube, Snap-Pop Lid 15 mL	CellTreat	978449
DPBS, calcium, magnesium, glucose, pyruvate	Gibco	14287-072
gentleMACS C Tubes	Miltenyi	130-093-237
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters	Miltenyi	130-096-427
Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail (100x)	Thermofisher	78420
Halt Protease Inhibitor Cocktail, EDTA free (100x)	Thermofisher	78437
HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red	Thermofisher	14065056
Latex beads, carboxylate-modified polystyrene, fluorescent red	Sigma-Aldrich	L3280
LightCycler 480 SYBR Green I Master	Roche	4707516001	This reagent was used to perform PCR.
MACS SmartStrainers (70 µm)	Miltenyi	130-110-916
Micro BCA Protein Assay Kit	Thermofisher	23235
M-PER Mammalian Extraction Buffer	Thermofisher	78503
MS Columns	Miltenyi	130-042-201	Referred as small columns in the protocol.
MultiMACS Cell24 Separator Plus	Miltenyi	130-098-637
PBSS, pH 7.4	Thermofisher	10010023
qScript XLT cDNA SuperMix	Quanta biosciences	733-1177	The kit was used to syntesize cDNA.
ReliaPrep RNA Miniprep Systems	Promega	Z6011	The kit contains 1-Thioglycerol and BL buffer (referred as lysis buffer in the protocol) and it was used to isolate total RNA.
Vacutainer safety-lok 21 G	Becton Dickinson	367282