בידוד של תאי מיקרוגליה היפותלמיים ממוח עכבר בוגר שזה עתה מחורר על ידי מיון תאים המופעלים על ידי מגנטית

Summary

אנו מתארים פרוטוקול לבידוד תאי מיקרוגליאה מההיפותלמוס של העכבר (או מבני מוח קטנים מקבילים) באמצעות מיון תאים מופעל מגנטית (MACS), בזמן קצר יחסית. מיקרוגליה היפותלמית ממוינת MACS יכולה לשמש לניתוח ex vivo וניתן לצפות אותה לביצוע בדיקות חוץ גופיות .

Abstract

מיקרוגליה, כמקרופאגים השוכנים במוח, חיוניים לשמירה על הומאוסטזיס במוח. הם מעצבים מעגלים עצביים במהלך ההתפתחות, סוקרים את סביבתם לאיתור פסולת או תאים מתים, כמו גם מגיבים לזיהום ופציעה במוח, בין פונקציות רבות אחרות. עם זאת, תפקידם החשוב בפיתוח עצבי ופלסטיות סינפטית ופתופיזיולוגיה לא הוגדר במלואו, מה שמדגיש את הצורך בחקירה נוספת. כדי לקבל הבנה מקיפה יותר של תפקיד תאי המיקרוגליה בתהליכים האלה, עלינו לבודד תאי מיקרוגליה ולאפיין אותם גנטית, מטבולית ותפקודית. אולם הבידוד של תאי מיקרוגליה מעכברים בוגרים, במיוחד ממבני מוח קטנים, הוא מאתגר מכיוון שהם מייצגים אחוז קטן מכלל תאי המוח, והתשואה של תאי מיקרוגליה מבודדים היא לעתים קרובות נמוכה מדי. כאן, הבידוד המגנטי של תאי מיקרוגליה באמצעות מיקרו-כדוריות CD11b⁺ מאפשר לנו למיין תאי מיקרוגליאה מההיפותלמוס של מוח עכבר בוגר שזה עתה נוקב. השיטה הנוכחית מאפשרת לנו להגיע לטוהר ותנובה גבוהים יחסית בתקופה קצרה תוך שמירה על כדאיות התא.

Introduction

מיקרוגליה מהווים 5-20% מכלל התאים העצביים והם תאי הגליה היחידים שמקורם באבות אריתרומיאלואידים בשק החלמון ומתחילים ליישב את המוח המתפתח סביב היום העוברי E9.5 ^1,2. מדובר בתאים מאריכי חיים בעלי יכולת התחדשות עצמית איטית, ללא תלות בתאים שמקורם במח עצם³. כחלק מהתאים הדינמיים ביותר, הם מסוגלים לרכוש פנוטיפים מגוונים בתגובה לרמזים הקשריים וסביבתיים ^2,4. בין האותות המסוגלים לווסת את פעילותם, נזק למערכת העצבים המרכזית (CNS), פעילות עצבית, כמו גם חומרים מזינים, הם החזקים ביותר. גוף הולך וגדל של מחקרים הוכיח את התפקיד המרכזי של תאי מיקרוגליה בפציעות, מחלות נוירודגנרטיביות והשמנת יתר ^2,5,6. עם זאת, התפקיד המדויק של מיקרוגליה הן בתהליכים פיזיולוגיים והן בפתופיזיולוגיה דורש מחקר נוסף. לכן, אפיון השעתוק, חילוף החומרים והתפקוד שלהם בתנאים שונים הוא בעל חשיבות רבה ומחייב את בידודם, שכן מחקרים באתרם מתאימים ללוקליזציה של DNA, RNA וחלבונים והשוואות איכותניות, כמו גם אפיון מורפולוגי של מיקרוגליה.

ישנן טכניקות שונות המתוארות לבידוד מיקרוגליה, ביניהן שיטת שיפוע פרקול⁷, מיון תאי ציטומטריה זרימה (FACS)⁸, ומיון תאים מופעלים מגנטית (MACS). בחירת השיטה המתאימה תלויה במטרות המחקר וברמת הטוהר הנדרשת ליישומים במורד הזרם. הבידוד של תאי מיקרוגליה טהורים ממוחו של עכבר בוגר, במיוחד ממבני מוח קטנים כמו ההיפותלמוס, הוא מאתגר בשל המספר המוגבל של תאי מיקרוגליה. הדיסוציאציה האוטומטית והעדינה של ההיפותלמוס באמצעות טכנולוגיית Miltenyi מאפשרת טיהור של תפוקת מיקרוגליה גבוהה יחסית בזמן קצר עם היכולת להמשיך עד שמונה דגימות בו זמנית עם דיסוציאטור Octo עדין של MACS.

הומוגניזציה של רקמות מלווה בטיהור מיקרוגליה באמצעות טכנולוגיה מבוססת עמודות MACS וחרוזי CD11b⁺ בגודל ננומטרי סופר-מגנטי. לכן, כל הדגימות מעובדות בדיוק באותו אופן ומניבות תאי CD11b ⁺ שלמים. ראוי לציין כי CD11b אינו קיים באופן בלעדי במיקרוגליה, אלא מתבטא גם בתאי שושלת מיאלואידים אחרים, כולל מקרופאגים ומונוציטים⁹. כדי להגביל זאת, זילוח המוח עם תמיסת מלח קרה כקרח לפני מיצוי ההיפותלמוס (ראה פרוטוקול שלב 2.6) מבטיח חיסול של רוב התאים המיאלואידים, משאיר רק חלק קטן פוטנציאלית של מקרופאגים תושבים או אלה שנצמדו לכלי הדם. המקרופאגים והמונוציטים של מערכת העצבים המרכזית במצב יציב ובריא מהווים אחוז קטן מכלל תאי החיסון במוח (~10% ו-<2% בהתאמה)^10,11. לכן, כאשר תאי המוח ממוינים עם חרוזי CD11b⁺, ניתן לבודד גם מיקרוגליה וגם מקרופאגים, אם כי רובם המכריע הם מיקרוגליה.

התשואה הסופית של תאי מיקרוגליה ושמירה על יכולת הקיום שלהם מאפשרים לנו לבצע ex vivo, כמו גם בדיקות במבחנה, עם היתרון של ניתוח אזורי עניין ספציפיים במוח. הראיות האחרונות הראו כי אוכלוסיית תאי המיקרוגליה הטרוגנית מאוד, ומייצגת ביטוי גנים ספציפיים לאזור ומאפיינים מורפולוגיים ותפקוד ^2,12,13. לכן, הפרוטוקול הנוכחי נועד לבודד ולנתח מיקרוגליה בוגרים באופן ספציפי לאזור. ואכן, אנו יכולים לאפיין את הפרופילים הגנטיים, השעתוק והתרגומים של מיקרוגליה היפותלמית בוגרת באמצעות שיטות כמו RT-qPCR וריצוף RNA, כמו גם ביצוע ניתוח פונקציונלי במבחנה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים שתוארו נערכו תוך ציות קפדני להמלצות האיחוד האירופי (2013/63/EU) ואושרו על ידי הוועדה האתית המקומית של אוניברסיטת בורדו (CEEA50) והמשרד הצרפתי להשכלה גבוהה, מחקר וחדשנות (סיכום לא טכני של הפרויקט המאושר NTS-FR-619193 v.1, 23-12-2022).

הפרוטוקול הבא מבוצע על עכברי C57BL/6 בוגרים בגיל ממוצע של 2-4 חודשים. עם זאת, זה יכול להתבצע בכל הגילאים והתנאים של עכברים תוך התחשבות בכך שנוף תאי החיסון של מערכת העצבים המרכזית עשוי להשתנות ואחוז המקרופאגים והמונוציטים המקומיים עשוי להיות מוגבר (למשל בהזדקנות וניוון עצבי).

1. הכנת פתרונות

הערה: אמצעי האחסון והפתרונות הבאים מופנים אך ורק לבידוד של תאי Cd11b+.

1. קבע את הנפח הכולל של D-PBS/0.5% אלבומין בסרום בקר (BSA) הנדרש בהתבסס על מספר הדגימות. הכן את התמיסה באמצעות D-PBS הזמין מסחרית עם סידן ומגנזיום ואבקת BSA (ראה טבלת חומרים).
2. הכינו צינורות דיסוציאציה מסומנים (C-Tubes) ומלאו כל אחד מהם ב-1,900 מיקרוליטר של חיץ Z, המסופק בערכת הדיסוציאציה של רקמת המוח הבוגרת (ראו טבלת חומרים). הפשירו את האנזימים ושמרו אותם על קרח, יחד עם כל המאגרים הדרושים בשלבים הבאים.
3. הכינו והניחו על קרח את הנפח המתאים של 1x מלח חוצץ פוספט (PBS) (ראו טבלת חומרים) הדרוש לזילוח (שלב 2.6). חישוב 10 מ"ל עבור כל חיה בתוספת 10% עודף.
4. לניתוח RT-qPCR, הכינו חיץ qPCR לכל דגימה: 2.5 μL של thioglycerol + 250 μL של חיץ ליזיס, באמצעות ערכה זמינה מסחרית לטיהור RNA (ראה טבלת חומרים).
5. לכימות חלבונים, הכינו את חיץ הליזה על ידי דילול קוקטייל מעכבי פוספטאז וקוקטייל מעכבי פרוטאז ביחס 1:100 במאגר מיצוי יונקים (ראו טבלת חומרים).
6. לזיהוי מיני חמצן תגובתי (ROS) ובדיקת פגוציטוזה, הכינו HBSS 1x מ-10x HBSS הזמין מסחרית (ראו טבלת חומרים). לאחר מכן, הכן מאגר FACS על ידי הוספת 0.2% BSA ל- 1x HBSS.

2. הסרת המוח

1. להרגיע את החיה עם מינון של 20 מ"ג / ק"ג של Xylazine; לאחר מכן, להרדים את העכבר עם מנת יתר של 400 מ"ג / ק"ג של pentobarbital ומניחים אותו שכיבה במגש ניתוח.
   הערה: שילובי הרדמה אחרים כדי להרדים את בעל החיים יכול גם לעבוד.
2. ממלאים מזרק 10 מ"ל עם 10 מ"ל של PBS 1x קר כקרח ומחברים אותו למחט פרפר 21 גרם.
3. ברגע שהעכבר מורדם לחלוטין (יש לוודא על ידי צביטת הכפות כדי להבטיח חוסר תגובה), הנשימה נעצרת, והלב נמצא בפרפור, אוהל את העור במלקחיים ופותחים את חלל בית החזה במספריים, בגובה הצלעות האחרונות ועצם החזה.
4. השתמש במספריים כדי לבצע חתך עמוק לאורך הצדדים של כלוב הצלעות לכיוון החלק העליון של כלוב הצלעות כדי לחשוף את הלב.
5. הכנס את מחט 21 G לחלק הדיסטלי של החדר השמאלי (ודא כי כ 1/3 מהמחט נמצאת בתוך החדר). מיד לבצע חתך דרך אטריום ימין באמצעות מספריים.
6. יש להחדיר 10 מ"ל של PBS 1x קר כקרח כדי לנקות את המוח מכל תאי מערכת החיסון במחזור.
   הערה: בדקו ויזואלית את המוח כדי לוודא שהוא נקי ומחורר היטב.
7. חותכים את ראש העכבר, מוציאים בזהירות את המוח ומניחים אותו על צלחת פטרי מלאה בקרח ומכוסה ברדיד אלומיניום.
   הערה: צלחת הפטרי ונייר הכסף עוזרים לראות את חלקי המוח. כדאי לשמור על סביבה קרירה במהלך חיתוך חתיכות המוח כדי להגביל את הפעילות המטבולית.
8. בודד את ההיפותלמוס באמצעות מלקחיים לחתוך אותו לחתיכות קטנות עם סכיני גילוח.
   1. כדי לזהות ולנתח את ההיפותלמוס, מקמו את המוח הפוך כך שקליפת המוח תהיה גחונית וההיפותלמוס ייראה באופן דורסלי על פני השטח העליונים. להפריד את ההיפותלמוס, אשר ממוקם בחלק התחתון של המוח משני צידי החדר השלישי, באמצעות מלקחיים מעוקלים. המשקל הממוצע של ההיפותלמוס מעכברים בוגרים C57BL/6 הוא 15 מ"ג.
      הערה: חלקי המוח חייבים להיות קטנים ככל האפשר (<0.5 מ"מ). חיתוך לחתיכות קטנות הוא צעד קריטי מכיוון שהוא מאפשר דיסוציאציה טובה יותר ותשואה גבוהה יותר של תאים.
9. אספו את חתיכות ההיפותלמוס בצינורות דיסוציאציה (C-Tubes) שמולאו בעבר ב-1,900 מיקרוליטר של חיץ Z (שלב 1.2).
   הערה: כדי לקבל תפוקה טובה של תאי מיקרוגליאה שמספיקה לביצוע בדיקות, אגרו לפחות שניים (לכימות חלבונים) או שלושה (לכימות qPCR ו-RNAseq) היפותלמי לכל צינור.

3. דיסוציאציה של רקמות

הערה: יש לבצע את כל השלבים על קרח. אין לערבל את השעיית התא בכל שלב; יש לערבב בזהירות רק עם פיפטה של 1,000 מיקרוליטר.

1. הכינו תערובת אנזימים 2 לפי טבלה 1 (חישוב הנפח הכולל של כל הצינורות + 10% עודף). בכל צינור C, הוסף 50 μL של האנזים הכלול בתערובת 1 (ראה טבלה 1) ו- 30 μL של תערובת אנזימים 2. כל האנזימים מסופקים בערכת הדיסוציאציה של רקמת המוח הבוגרת (ראו טבלת חומרים).
2. סגרו את צינורות C והניחו אותם הפוכים בדיסוציאטור עם תושבות החימום בהתאם להוראות היצרן. הפעל את התוכנית 37C_ABDK_02.
3. הכינו שפופרות הצמדה של 15 מ"ל (ראו טבלת חומרים) ומעליהן מסננות של 70 מיקרומטר. להרטיב את המסננת עם 2 מ"ל של D-PBS.
4. כאשר תוכנית הדיסוציאציה/העיכול מסתיימת, רוקן את צינור C על המסננת ושרט עם קצה של 200 μL כדי להפחית את אובדן התאים על ידי הגברת סינון התאים והפחתת היצמדות הרקמה הומוגנית על המסנן.
5. יש לשטוף את הצינור עם 2 x 5 מ"ל של D-PBS, לרוקן את השטיפות על המסננת, ולגרד עם קצה 200 μL בין השטיפות.
6. צנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C ולשאוף את supernatant לחלוטין. בזהירות להשעות מחדש את גלולת התא עם נפח מתאים של D-PBS קר על פי טבלה 1.
7. יש לערבב מיד בזהירות עם 450 μL של מגיב שיפוע צפיפות (Debris Removal Solution, ראה טבלת חומרים) ולכסות בעדינות רבה עם 2 מ"ל של D-PBS קר (ראה טבלה 1).
   הערה: כדי לקבל את שכבות שיפוע הצפיפות השונות, יש לכסות את D-PBS בעדינות טיפה אחר טיפה, עם מינימום "הפרעה" אפשרית, 1 מ"ל בכל פעם עם פיפטה של 1 מ"ל.
8. צנטריפוגה ב-3,000 × גרם למשך 10 דקות ב-4°C עם האצה איטית ובלם איטי (אם 9 שווה ערך למלא, השתמש ב-5).
9. נוצרים שלושה שלבים. שאפו את שני השלבים העליונים לחלוטין והשליכו אותם. הקפידו לא לשאוף לשלב התחתון השלישי.
10. מלאו ב-1800 מיקרוליטר של D-PBS קר והפכו בעדינות את הצינור 3 פעמים.
11. צנטריפוגה ב-1,000 × גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס עם האצה מלאה ובלם מלא ושאפו את הסופרנאטנט לחלוטין. בזהירות להשהות מחדש את גלולת התא על ידי pipeting איטי למעלה ולמטה עם 2 מ"ל של D-PBS/BSA.

4. בידוד מגנטי של תאי CD11b⁺

1. צנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C ולשאוף את supernatant לחלוטין. בזהירות להשעות מחדש את גלולת התא ב 90 μL של חיץ D-PBS/BSA.
2. מוסיפים 10 μL של תערובת CD11b-microbead ומערבבים היטב עם פיפטה.
3. לדגור במשך 15 דקות ב 2-8 מעלות צלזיוס במקרר, לא על קרח; לשטוף את התאים על ידי הוספת 1 מ"ל של D-PBS/BSA וצנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C; שאפו את הסופרנאטנט לחלוטין. יש להשהות בזהירות ב-500 מיקרוליטר של D-PBS/BSA.
4. הפעל את תוכנית POSSEL2 במפריד בהתאם להוראות שעל המסך. מקמו את העמודות הקטנות (ראו טבלת חומרים) בשדה המגנטי.
   הערה: ניתן לבחור עמודות קטנות או גדולות למיון תאים מגנטיים, בהתאם למספר התאים הממוצע הצפוי. לעמודות קטנות יש קיבולת של עד 1 × 10⁷ תאים מסומנים ועמודות גדולות עד 1 × 10⁸. כאשר מבודדים תאים ממבנים קטנים, כגון ההיפותלמוס, עמודות קטנות מומלץ. אמצעי האחסון של ריאגנטים שונים בעת שימוש בעמודות גדולות (ראה הוראות יצרן).
5. הרטיבו את העמודות (ראו טבלת חומרים) ב-500 μL של D-PBS/BSA. אם החלק השלילי של התאים (CD11b^-) נחוץ לניתוח נוסף, מקם לוחית איסוף מתחת לעמודות ולאחר מכן החל את השעיית התאים בעמודות.
6. בצע שלושה שלבי כביסה על-ידי הוספת 500 μL של D-PBS/BSA בכל פעם בעמודה, ובכל פעם המתין עד שהמאגר יעבור דרך העמודה.
   הערה: חשוב למנוע התייבשות של החלק העליון של העמוד, ולכן מומלץ לא לחכות עד שכל החיץ יעבור.
7. להעביר את סך השפכים של CD11b ^- חלק מן הבארות של צלחת האיסוף צינורות 15 מיליליטר.
8. הסר את העמודה מהמפריד, הנח אותה על צינור 5 מ"ל, ופיפטה 1 מ"ל של D-PBS/BSA לתוך העמודה.
9. שטוף מיד את מקטע התא המסומן מגנטית על ידי יישום חזק של הבוכנה שסופקה עם העמודה.
10. בסופו של דבר, לספור תאי CD11b ⁺ עם hemacytometer או כל שיטה אחרת; צפו ~15,000 תאים להיפותלמוס.
11. צנטריפוגה את מתלה התא ב 300 × גרם למשך 10 דקות ב 4 ° C ו להשליך את supernatant.

5. ניתוחים

1. לניתוח RT-qPCR, השהה מחדש את כדורי התא עם מאגר qPCR (להכנה, ראה שלב 1.3) ואחסן את הצינורות ב - 80 ° C עד מיצוי mRNA. בודד את סך הרנ"א, ולאחר מכן עבד ונתח אותו בהתאם להנחיות MIQE¹⁴. לבסוף, לסנתז cDNA ולבצע qPCR באמצעות מכשיר RT-PCR. עיין בטבלת החומרים עבור כל הערכות המסחריות שבהן נעשה שימוש.
2. לכימות חלבונים, שטפו את כדורי התא עם D-PBS (ללא BSA) לפחות פי 2 כדי לסלק BSA. לאחר מכן, להשעות מחדש את כדורי התא משני היפותלאמי עם 20 μL של חיץ ליזיס. המשך בכימות חלבונים עם ערכת בדיקת חלבון (ראה טבלת חומרים).
   הערה: פעלנו לפי הוראות היצרן¹⁵ כדי לכמת חלבונים לביצוע בדיקת פעילות סרין/תראונין קינאזות.
3. לזיהוי מיני חמצן תגובתי (ROS) בתאי מיקרוגליה, יש להשהות מחדש את הגלולה ב-1x HBSS. טפל בתאים בהתאם לפרוטוקול היצרן של הערכה לבדיקת Flow Cytometry Assay (ראה טבלת חומרים). לאחר מכן, השהה מחדש תאים מטופלים ב -200 מיקרוליטר של חיץ FACS (להכנה, ראה שלב 1.5) ובצע FACS כדי לזהות תאים בסטרס חמצוני.
4. לבדיקת פאגוציטוזיס, יש לדגור על התאים הממוינים ב-D-PBS/BSA עם חרוזי לטקס פלואורסצנטיים (ראו טבלת חומרים) למשך 30 דקות. התאימו את מספר החרוזים כך שיהיו לכם 4 חרוזים לתא בממוצע. לאחר מכן צנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 7 דקות ב 4 ° C, להשהות מחדש ב 200 μL של מאגר FACS, ולקרוא את פליטת פלואורסצנטיות על ידי FACS (λ_ex 575 ננומטר; λ_em 610 ננומטר).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

הערכת התשואה הסופית מסתמכת על רמת הטוהר והכמות של תאים מבודדים והיא יכולה להיקבע על ידי RT-qPCR, ספירת תאים וכימות חלבונים. טוהר התאים המגנטיים המבודדים מההיפותלמוס אושר על-ידי ניתוח ביטוי גנים של CD11b, C1qa, Gad1 ו-GFAP עם RT-qPCR (איור 1). CD11b ו- C1qa מבוטאים בעיקר על ידי מיקרוגליה במצב יציב, ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

הפרוטוקול הנוכחי מציג את הבידוד של תאי מיקרוגליה היפותלמיים ממוח עכבר בוגר שזה עתה נוקב על ידי מיון תאים המופעל על ידי מגנטית. התוצאות שהוצגו לעיל מאשרות את הטוהר והכדאיות של תאים מבודדים, כמו גם את יעילותה של שיטה זו לאפיון פונקציונלי של מיקרוגליה ex vivo, למשל באמצעות פעילות פגוציטית ו...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adult Brain Dissociation Kit	Miltenyi	130-107-677	The kit contains buffer Z, buffer Y, enzymes A and P, Debris Removal Solution, buffer A (to dissolve enzyme A).
Albumin Bovine FrV BSA	EuroMedex	04-100-812-C
CD11b (Microglia) MicroBeads, human and mouse - small size	Miltenyi	130-093-636
CellROX Green Flow Cytometry Assay Kit	Invitrogen	C10492
Centrifuge Tube, Snap-Pop Lid 15 mL	CellTreat	978449
DPBS, calcium, magnesium, glucose, pyruvate	Gibco	14287-072
gentleMACS C Tubes	Miltenyi	130-093-237
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters	Miltenyi	130-096-427
Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail (100x)	Thermofisher	78420
Halt Protease Inhibitor Cocktail, EDTA free (100x)	Thermofisher	78437
HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red	Thermofisher	14065056
Latex beads, carboxylate-modified polystyrene, fluorescent red	Sigma-Aldrich	L3280
LightCycler 480 SYBR Green I Master	Roche	4707516001	This reagent was used to perform PCR.
MACS SmartStrainers (70 µm)	Miltenyi	130-110-916
Micro BCA Protein Assay Kit	Thermofisher	23235
M-PER Mammalian Extraction Buffer	Thermofisher	78503
MS Columns	Miltenyi	130-042-201	Referred as small columns in the protocol.
MultiMACS Cell24 Separator Plus	Miltenyi	130-098-637
PBSS, pH 7.4	Thermofisher	10010023
qScript XLT cDNA SuperMix	Quanta biosciences	733-1177	The kit was used to syntesize cDNA.
ReliaPrep RNA Miniprep Systems	Promega	Z6011	The kit contains 1-Thioglycerol and BL buffer (referred as lysis buffer in the protocol) and it was used to isolate total RNA.
Vacutainer safety-lok 21 G	Becton Dickinson	367282