Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول نموذج الأغشية الحيوية متعددة الميكروبات ذات الصلة بالرئة ذات الصلة بأربعة أنواع من التليف الكيسي (CF) والتي يمكن استخدامها لاستكشاف تأثير التفاعلات البكتيرية بين الأنواع.

Abstract

تفتقر معظم النماذج المختبرية إلى القدرة على التحقيق الكامل في الأنماط الظاهرية البكتيرية الناشئة عن التفاعلات المعقدة التي لوحظت في بيئات الحياة الواقعية. هذا صحيح بشكل خاص في سياق الالتهابات القائمة على الأغشية الحيوية التي يصعب علاجها والمزمنة والمتعددة الميكروبات التي تم اكتشافها في الشعب الهوائية للأفراد المصابين بالتليف الكيسي (CF) ، وهو مرض وراثي متعدد الأعضاء. في حين أن العديد من دراسات الميكروبيوم قد حددت التركيبات الميكروبية المكتشفة في مجرى الهواء للأشخاص المصابين بالتليف الكيسي (pwCF) ، لم تدمج أي نماذج في المختبر حتى الآن ميزات الرئة الهامة ذات الصلة بالتليف الكيسي بشكل كامل. لذلك ، توجد فجوة معرفية كبيرة في القدرة على التحقيق في الآليات التي تؤدي إلى التسبب في عدوى الرئة من الأنواع المختلطة CF. هنا ، نصف نموذجا للمجتمع الميكروبي المكون من أربعة أنواع تم تطويره مؤخرا ، بما في ذلك Pseudomonas aeruginosa و Staphylococcus aureus و Streptococcus sanguinis و Prevotella melaninogenica المزروعة في ظروف شبيهة بالتليف الكيسي. من خلال استخدام هذا النظام ، لوحظت واستكشاف الأنماط الظاهرية ذات الصلة سريريا مثل التمرد المضاد للميكروبات للعديد من مسببات الأمراض واستكشافها على المستوى الجزيئي. تكمن فائدة هذا النموذج في المختبر في سير عمله الموحد الذي يمكن أن يسهل دراسة التفاعلات بين الأنواع في سياق التهابات الرئة المزمنة CF.

Introduction

غالبا ما تفشل الاستراتيجيات التي تهدف إلى القضاء على الميكروبات المسببة للأمراض مثل تلك المكتشفة في مجرى الهواء للتليف الكيسي (CF) ، وهو مرض وراثي متعدد الأعضاء، 1. أي أن وجود مجتمعات ميكروبية مرنة تشبه الأغشية الحيوية تنمو في بيئة رئة التليف الكيسي الغنية بالمخاط يمكن أن يسبب التهابات مزمنة تمتد لعدة عقود2. علاوة على ذلك ، على الرغم من أن استخدام مضادات الميكروبات في الخطوط الأمامية (Abx) والمغيرات قد أدى إلى تحسين النتائج لدى الأشخاص المصابين بالتليف الكيسي (pwCF) ، فإن النهج السريري "حشرة واحدة ، عدوى واحدة" المستخدم عادة ضد مسببات الأمراض الكيسية الكبرية مثل Pseudomonas aeruginosa و Staphylococcus aureus كان غير فعال في حل الالتهابات التي يصعب علاجها والتي تم اكتشافها في رئتي هؤلاءالأفراد 3،4 ، 5،6،7.

على مدى العقدين الماضيين ، غيرت دراسات متعددة فهمنا لمرض الرئة التليفية الكيسيالمزمن 8. أي أن التقارير تشير إلى أن العدوى المكتشفة في الشعب الهوائية لالتهاب الكبد المتلأل الوهريبي ليست ناجمة فقط عن ممرض واحد ولكنها متعددة الميكروباتبطبيعتها. علاوة على ذلك ، على الرغم من أن التسبب في التهابات الرئة من الأنواع المختلطة لا يزال غير مفهوم جيدا ، إلا أن الأدلة السريرية تظهر أن pwCF المصابة بالعدوى المشتركة بكل من المكورات العنقودية الذهبية و P. aeruginosa في مجرى الهواء قد أدت إلى تدهور وظائف الرئة مقارنة بالأفراد الذين استعمرهم أي من هذين المسببات9.

يفترض أن التفاعلات بين الأنواع بين مسببات أمراض التليف الكيسي هي سبب عدم استئصال العدوى القائمة على الأغشية الحيوية متعددة الميكروبات بسهولة من خلال استخدام علاجات التليف الكيسي ، مما يؤثر في النهاية على نتائج المريض3. ولدعم ذلك، أظهرت الدراسات المختبرية أن التفاعلات بين الميكروبات مثل المتصورة الزائفة الزنجارية، والمكورات العنقودية الذهبية وغيرها يمكن أن تؤثر على الأنماط الظاهرية ذات الصلة سريريا مثل استجابة Abx لأدوية التليف الكيسي في الخطوط الأمامية، بما في ذلك الفانكومايسين وتوبرامايسين6،10،11. ولذلك، لا يزال يتعين إعادة النظر في استراتيجيات العلاج الحالية الرامية إلى استئصال مسببات الأمراض المتلاطمة من التليف الكيسي في سياق حالات العدوى المختلطة الأنواع.

يعتمد المعيار الذهبي في إدارة التهابات الرئة الميكروبية الكيسية بشكل كبير على استخدام اختبار الحساسية لمضادات الميكروبات (AST) لتوجيه التدخلات السريرية12. ومع ذلك ، يتم إجراء AST عادة باستخدام الزراعة الأحادية البكتيرية المزروعة في الثقافات الغنية والمختلطة جيدا ، والتي لا تعكس ظروف النمو الميكروبي المكتشفة في مجرى الهواء CF3،13. نظرا للانفصال الكبير بين نتائج المريض ونجاح العلاج ، تدعو التقارير السريرية الآن إلى تطوير مناهج جديدة تدمج السمات الحاسمة لرئة التليف الكيسي12،14.

وقد طورت دراسات قليلة الأنواع البكتيرية ذات الصلة ب CF في أنظمة المختبر تحتوي على أكثر من اثنين من مسبباتالأمراض 15،16. ومع ذلك ، فإن هذه النماذج (1) لا تعكس تماما الطبيعة متعددة الميكروبات والشبيهة بالأغشية الحيوية لرئة التليف الكيسي و (2) لا تستخدم ظروفا غذائية وبيئية تقترب من تلك المكتشفة في مجرى الهواء التليف الكيسي15 ، 16. من خلال التعدين لمجموعات بيانات وحساب الجينات الكبيرة المشتقة من الرئة الكيسية 16S rRNA ، طور جان بيير وزملاؤه مؤخرا نموذجا للثقافة المشتركة في المختبر يدمج الميزات المذكورة أعلاه10. يشمل هذا النظام المتصورة الزنجارية ، المكورات العنقودية الذهبية ، العقدية النيابية و Prevotella spp. نمت في ظروف شبيهة بمجرى الهواء التليف الكيسي ومستقرة لمدة تصل إلى 14 يوما. أبلغ المؤلفون أيضا عن نمو خاص بالمجتمع ل Prevotella spp. والعديد من التغييرات في استجابة Abx لمسببات الأمراض CF هذه من خلال الآليات التي لا يزال يتعينتحديدها 10. يوفر هذا النظام المختبري القابل للتتبع أيضا إمكانية الخوض في الأسئلة المركزة ميكانيكيا المتعلقة بتعنت Abx من متغير شائع من P. aeruginosa الذي يتم اكتشافه بشكل متكرر في الشعب الهوائية ل pwCF10. لذلك ، فإن الهدف من هذا البروتوكول هو تزويد مجتمع أبحاث التليف الكيسي بسير عمل تجريبي موحد لتنمية غشاء حيوي في المختبر لديه القدرة على التوسع بشكل أكبر لمعالجة عدد من الأسئلة ذات الصلة بالتليف الكيسي.

Protocol

تفاصيل جميع الكواشف والمعدات مدرجة في جدول المواد.

1. تحضير وسط البلغم الاصطناعي

ملاحظة: في جميع أنحاء هذا البروتوكول ، يتم تعريف وسط البلغم الاصطناعي (ASM) على أنه الوسط ذي الصلة بالتليف الكيسي المعدل من SCFM2 ، الذي نشره تيرنر وزملاؤهسابقا 17. فيما يلي وصف لخطوات تحضير هذه الوسيلة. انظر جدول المواد لعمل حلول المخزون وظروف التخزين. يختلف هذا الإصدار من ASM عن Turner et al. ،17 لأن سعة التخزين المؤقت في الإصدار الأصلي لا تسمح بدرجة حموضة مستقرة بمرور الوقت. أي أن نشاط التخمير الذي تقوم به المكورات العقدية واللاهوائية مثل Prevotella spp. يؤدي إلى تحمض وسط النمو (ملاحظات غير منشورة). لذلك ، تم تعديل تركيز حمض 3-مورفولينوبروبان-1-سلفونيك (MOPS) من 10 ملي مولار إلى 100 مليمتر.

ملاحظة: يسهل تحضير محلول مخزون قاعدة ASM 2x (ASMb) إضافة مكونات مثل الميوسين والأجار والماء وما إلى ذلك ، دون التأثير على التركيز النهائي للجزيئات الموجودة في ASM10،18. يمكن تحضير 2x ASMb مسبقا وتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين في مكان مظلم. إذا تحول لون الوسط إلى اللون الأصفر ، فتخلص منه.

  1. لتحضير 2x ASM الأساسي ، في دورق نظيف يحتوي على 400 مل من diH2O ، أضف ما يلي أثناء التحريك:
    1. أضف 6.50 مل من 0.2 M NaH2PO4. H2O مخزون ؛ 6.25 مل من مخزون 0.2 M Na2HPO4 ؛ 348 ميكرولتر من مخزون 1 M KNO3 ؛ 1.084 مل من مخزون 0.25 M K2SO4 .
    2. أضف 4.0 غرام من الخميرة الاصطناعية المتسربة دون التربتوفان; 3.032 غرام من كلوريد الصوديوم ؛ 20.92 غرام من MOPS ؛ 1.116 جم من KCl و 0.124 جم من NH4Cl.
    3. أضف 9.30 مل من مخزون حمض اللاكتيك 1 م. 2.70 مل من مخزون الجلوكوز 1.1 M ؛ 1.75 مل من مخزون 1 M CaCl2.2H 2O ؛ 1.20 مل من مخزون 0.25 M N-acetylglucosamine و 1.00 مل من مخزون 3.6 ملي مولار FeSO 4.7H 2O.
    4. أضف 660 ميكرولتر من مخزون التربتوفان 0.1 م. 606 ميكرولتر من مخزون 1 م ملغنليزمكلوريد 2.6 ساعة2درجة ؛ 0.60 غرام من حمض الديوكسي ريبونوكلييك من المنوية الرنجة ؛ 400 ميكرولتر من مخزون 250 مجم / مل 1،2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC).
    5. بمجرد إضافة جميع المكونات ، اضبط الرقم الهيدروجيني على 6.80 باستخدام مخزون 5 M من هيدروكسيد الصوديوم. أكمل حتى 500 مل مع diH2O. تعقيم باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر ، وخزنها في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
  2. لتحضير مخزون الميوسين 10 ملغم/مل (2x)، استخدم زجاجة زجاجية نظيفة تحتوي على 250 مل من diH2O وأثناء التقليب:
    1. أضف 5.0 غرام من الميوسين من معدة الخنازير - النوع الثاني. امزج التعليق لمدة 10 دقائق. أكمل حتى 500 مل مع diH2O.
    2. تعقيم عن طريق التعقيم عند 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
  3. إعادة تشكيل ASM.
    ملاحظة: يجب تنفيذ هذه الخطوة في يوم التجربة.
    1. امزج نسبة حجم 1: 1 من مخزون ASMb 2x ومخزون الميوسين 10 مجم / مل.
    2. دوامة جيدا قبل الاستخدام.

2. إعداد وسائط انتقائية للمجتمع متعدد الميكروبات

ملاحظة: فيما يلي الكميات اللازمة لإعداد حجم 1 لتر من الوسائط.

  1. لتحضير Mannitol Salt Agar (MSA) و Pseudomonas Isolation Agar (PIA) ، اتبع تعليمات الشركة المصنعة.
  2. لتحضير Prevotella Selective Agar (PSA) ، في زجاجة زجاجية نظيفة ، أضف ما يلي:
    1. 30.0 غرام من مرق الصويا التريبتيك (TSB). 15.0 غرام من أجار. 5.00 غرام من مستخلص الخميرة. 0.50 غرام من هيدروكلوريد L-سيستين.
    2. 10.0 مل من مخزون هيمين 0.5 مجم / مل. 100 ميكرولتر من مخزون 10 مجم / مل من ميناديون.
    3. أضف 940 مل من diH2O وحرك. تعقيم عن طريق التعقيم عند 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
    4. عندما تبرد (أي يمكن وضع الزجاجة عارية اليدين) ، أضف مع التحريك: 50.0 مل من دم الأغنام المنزوعة التدبير. 2.00 مل من مخزون الكاناميسين 50 مجم / مل. 150 ميكرولتر من مخزون الفانكومايسين 50 مجم / مل. 500 ميكرولتر من مخزون بولي ميكسين ب 10 مجم / مل.
  3. لتحضير العقدية الانتقائية أجار (SSA) ، في زجاجة زجاجية نظيفة ، أضف ما يلي:
    1. 30.0 غرام من TSB. 15.0 غرام من أجار.
    2. أضف 950 مل من diH2O وقلب. تعقيم عن طريق التعقيم عند 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
    3. عندما تبرد (أي يمكن وضع الزجاجة عارية اليدين) ، أضف مع التحريك: 50.0 مل من دم الأغنام المنزوعة التدبير. 1.00 مل من مخزون بولي ميكسين ب 10 مجم / مل. 1.00 مل من مخزون حمض الأكسولينيك 10 مجم / مل.
      ملاحظة: تصب في الأطباق وتحفظ عند 4 درجات مئوية لمدة أقصاها شهر واحد. قبل الاستخدام ، اترك الأطباق تجف في درجة حرارة الغرفة حتى 24 ساعة قبل تلقيحها. تم التحقق من صحة مستضد البروستاتا النوعي باستخدام المتصورة الميلانينوجينيكا وبريفوتيلا إنترميديا. تم التحقق من صحة SSA مع S. sanguinis، ومجموعة Streptococcus milleri (Streptococcus constellatus و Streptococcus intermedius و Streptococcus anginosus ، يشار إليها باسم SMG). يوصى بشدة بالتحقق من صحة هذه الوسائط الانتقائية من جديد إذا كان سيتم اختبار سلالات جديدة.

3. تحضير الوسائط السائلة البكتيرية وظروف النمو

  1. لزراعة المتصورة الزنجارية والمكورات العنقودية الذهبية بشكل روتيني ، استخدم وسطا غنيا معقما (على سبيل المثال ، مرق ليزوجيني (LB) أو TSB).
    1. ابدأ السائل بين عشية وضحاها عن طريق قطف مستعمرة واحدة نمت سابقا على طبق أجار LB / TSB لمدة 20-24 ساعة عند 37 درجة مئوية.
    2. قم بزراعة مزارع المرق عند 37 درجة مئوية طوال الليل مع الرج عند 250 دورة في الدقيقة لمدة 16-18 ساعة.
  2. لزراعة المكورات العقدية ، استخدم مرق تود هيويت المعقم المكمل بمستخلص الخميرة بنسبة 0.5٪ (THB-YE).
    1. ابدأ الاستزراع السائل بين عشية وضحاها من مستعمرة واحدة نمت سابقا على صفيحة أجار TSB مكملة بدم الأغنام منزوع التيفان بنسبة 5٪ (صفيحة أجار الدم) لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية + 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
    2. قم بزراعة ثقافات THB-YE بشكل لاهوائي أو عند 37 درجة مئوية + 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 بين عشية وضحاها دون اهتزاز لمدة 18-22 ساعة.
  3. لزراعة Prevotella spp. ، قم بإعداد 1 لتر من وسط نمو Prevotella (PGM) عن طريق إضافة ما يلي إلى زجاجة نظيفة:
    1. 30.0 غرام من TSB. 5.00 غرام من مستخلص الخميرة. 0.50 غرام من هيدروكلوريد L-سيستين. 10.0 مل من مخزون هيمين 0.5 مجم / مل و 100 ميكرولتر من مخزون الميناديون 10 مجم / مل.
    2. أضف 990 مل من diH2O. تعقيم عن طريق التعقيم عند 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. لف الزجاجة بورق الألمنيوم لحمايتها من الضوء.
    3. تنمو Prevotella spp. مستعمرات على صفيحة أجار الدم المحتضنة بشكل لاهوائي عند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
    4. تلقيح مستعمرة واحدة في PGM وتنمو بين عشية وضحاها دون اهتزاز عند 37 درجة مئوية لاهوائية لمدة 24 ساعة.
      ملاحظة: يمكن حفظ PGM في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى أسبوعين. يوصى بشدة بإجراء اختبارات العقم على كل وسط نمو قبل الاستخدام. إذا لم تستخدم غرفة لاهوائية ، فقد يكون من الضروري بدء السائل بين عشية وضحاها من Prevotella spp. من رقعة من المستعمرات.

4. إعداد تجربة الزراعة المشتركة

ملاحظة: يوضح الشكل 1 سير عمل تجريبي ملخص. يمكن إجراء التجربة في ظروف الأكسجين إذا كان وقت التحضير يستغرق أقل من 1 ساعة. إذا كان من المتوقع أن يستغرق الأمر وقتا أطول من ذلك ، فمن المستحسن بشدة إجراء التجربة باستخدام غرفة لاهوائية (مع 10٪ ثاني أكسيد الكربون2 ، و 10٪ H2 ، و 80٪ N2 غاز مختلط). يمكن أيضا استخدام الجرار اللاهوائية لاحتضان العينات التجريبية.

  1. إعداد الزراعة الأحادية والثقافات المشتركة
    ملاحظة: قم بتنفيذ جميع خطوات الطرد المركزي عند 10,000 × جم لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. بالنسبة للمزارع المشتركة ، قم بخلط العينات البكتيرية قبل تلقيح الألواح المكونة من 96 بئرا مباشرة. عادة ، يتم جمع حجم 1 مل ل P. aeruginosa و S. aureus السلالات من الثقافات الليلية. بالنسبة للمكورات العقدية spp. و Prevotella spp. ، قد تختلف الأحجام الليلية بين 2-4 مل. يمكن تعديل هذه الأحجام اعتمادا على عدد الشروط المراد اختبارها.
    1. باستخدام السائل البكتيري من الثقافات الليلية ، قم بتنفيذ الخطوات التالية:
      1. بالنسبة لسلالات المتصورة الزنجارية والمكورات العنقودية الذهبية ، اغسل مرتين باستخدام محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS).
      2. بالنسبة للمكورات العقدية spp. و Prevotella spp. ، اغسل مرة واحدة باستخدام PBS المعقم.
        ملاحظة: استخدم ماصة للتخلص من المواد الطافية بعناية ، حيث يمكن أن تفقد الكريات بسهولة.
      3. بعد الغسيل, أعد تعليق كل حبيبات في 1 مل من 1x ASMb المخفف بالماء.
      4. قم بعمل تخفيف 1:10 لكل عينة في PBS معقم وقم بقياس OD600.
      5. اضبط جميع الثقافات على OD600 من 0.2 في ASM.
      6. باستخدام معلقات OD600 = 0.2 ، قم بتخفيف العينات البكتيرية في ASM إلى OD600 نهائي من 0.01 (لكل ميكروب) للزراعة الأحادية والثقافات المشتركة.
      7. دوامة جيدا لمدة 5 ثوان.
        ملاحظة: على سبيل المثال ، لتحضير ما مجموعه 1 مل من P. aeruginosa معلق ASM أحادي الزراعة عند OD600 = 0.01 ، أضف 50 ميكرولتر من P. aeruginosa عند OD600 = 0.2 إلى حجم 950 ميكرولتر من ASM. بالنسبة للاستزراع المشترك ، خذ 50 ميكرولتر من كل من P. aeruginosa و S. aureus و Streptococcus spp. و Prevotella spp. معلقات عند OD600 = 0.2 وأضفها إلى 800 ميكرولتر ASM.
      8. باستخدام ماصة، أضف 100 ميكرولتر من معلقات الزراعة الأحادية والزراعة المشتركة في ثلاثة آبار منفصلة من صفيحة بلاستيكية مسطحة ذات قاع 96 بئرا معقمة.
      9. احتضان اللوحة (بدون رج) لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية في ظروف نقص الأكسجين.
        ملاحظة: يمكن أيضا استخدام توترات الأكسجين الأخرى (على سبيل المثال ، ميكروكسيا ، نورموكسيا) هنا. ومع ذلك ، فقد تم تطوير النموذج والتحقق من صحته مع ظروف نقص الأكسجين. قم بتأكيد اللقاح الأولي عن طريق تخفيف المعلقات البكتيرية الأحادية والمشتركة بشكل متسلسل ، ويوصى بشدة بالطلاء على PIA و MSA و SSA و PSA. تركيز البداية المستهدف لكل نوع من الأنواع البكتيرية هو 1 × 107 CFU / مل (P. aeruginosa) ، 3.5 × 106 CFU / مل (S. aureus) ، 1.2 × 106 CFU / مل (المكورات العقدية spp.) ، و 4.6 × 106 CFU / مل (Prevotella spp.). يمكن أيضا تعديل اللقاح البكتيري ، كما وصفه جان بيير وزملاؤه10.
  2. استبدل الوسائط بعد تكوين الأغشية الحيوية.
    1. بعد 24 ساعة من الحضانة، قم بإزالة الخلايا غير المتصلة (العوالق) عن طريق الشفط باستخدام ماصة متعددة القنوات.
    2. قم بتجديد الأغشية الحيوية المكونة مسبقا ب 100 ميكرولتر من ASM الطازج أو العلاج المطلوب (مثل المضادات الحيوية والمستقلبات وما إلى ذلك).
    3. احتضان اللوحة لمدة 24 ساعة إضافية عند 37 درجة مئوية في ظروف نقص الأكسجين.
      ملاحظة: يمكن تنفيذ هذه الخطوات بشكل هوائي إذا تم تنفيذها بسرعة (أي أقل من 1 دقيقة). خلاف ذلك ، يرجى استخدام غرفة لاهوائية.

5. جمع وطلاء العينات

  1. بعد 24 ساعة إضافية من الحضانة، قم بشفط الخلايا غير المتصلة (العوالق) باستخدام ماصة متعددة القنوات.
    ملاحظة: يمكن الاحتفاظ بجزء العوالق وتخفيفه وتخفيفه وتصفيفه على وسائط انتقائية أو التخلص منه.
  2. اغسل الأغشية الحيوية برفق مرتين باستخدام 125 ميكرولتر من PBS المعقم وتخلص من الأحجام.
  3. أضف 50 ميكرولتر من PBS المعقم وافصل الأغشية الحيوية عن طريق كشط الخلايا برفق من اللوحة باستخدام مكرر مكون من 96 سنا.
  4. انقل خلايا الأغشية الحيوية المعلقة إلى الصف A من صفيحة معقمة جديدة مكونة من 96 بئرا.
    ملاحظة: ستحتوي اللوحة المكونة من 96 بئرا على PBS معقم في الصفوف من B إلى H.
  5. قم بإجراء تخفيف تسلسلي 10x لأجزاء العوالق (إذا لزم الأمر) وكسور الأغشية الحيوية.
  6. لوحة 3-5 ميكرولتر من كل عينة تخفيف على PIA و MSA و SSA و PSA.
  7. اترك بقع التلقيح تجف.

6. احتضان الألواح الانتقائية وعد وحدة تشكيل المستعمرة (CFU)

  1. بالنسبة إلى المتصورة الزنجارية والمكورات العنقودية الذهبية ، تحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 18-20 ساعة.
  2. بالنسبة للمكورات العقدية spp ، احتضن عند 37 درجة مئوية في ظروف نقص الأكسجين لمدة 24 ساعة.
  3. بالنسبة إلى Prevotella spp ، احتضن عند 37 درجة مئوية في ظروف نقص الأكسجين لمدة 48 ساعة.
  4. بعد الحضانة ، عد المستعمرات (~ 10-35 لكل بقعة) واحسب CFU لكل مل.
  5. ارسم البيانات باستخدام أداة التصور.

النتائج

كما هو موضح في الشكل 2 ، تم الإبلاغ عن العديد من الأنماط الظاهرية بما في ذلك (1) انخفاض في عدد المتصورة الزنجارية و S. aureus عدد الخلايا القابلة للحياة عند زراعة مجتمعات العوالق المختلطة مقارنة بالزراعة الأحادية ، (2) زيادة في النمو متعدد الميكروبات ل...

Discussion

تكمن فائدة هذا النظام المستنير سريريا في المختبر في قدرته على اكتشاف الوظائف البكتيرية الخاصة بالميكروبات. أي ، من خلال استخدام هذا النموذج ، أبلغنا عن أنماط ظاهرية ميكروبية تتراوح من النمو الخاص بالمجتمع ل Prevotella spp. (الشكل 2) إلى التغيرات في الق...

Disclosures

ولا يعلن أصحاب البلاغ أي إفصاح.

Acknowledgements

نود أن نتوجه بخالص الشكر للدكتور جورج أ. أوتول والدكتور توماس إتش هامبتون لدورهما الهام في تصميم وتطوير نموذج المجتمع متعدد الميكروبات في المختبر . نشكر الدكتورة صوفي روبيتاي على تعليقاتها المفيدة على المخطوطة. تم دعم هذا العمل من خلال منحة مؤسسة التليف الكيسي JEAN21F0 إلى FJ-P. تم إنشاء الشكل 1 من المخطوطة باستخدام BioRender.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)Fisher ScientificNC0387928Prepare a 250 mg/mL stock in chloroform directly in the bottle. Keep at -20°C. Final concentration 200 μg/mL in 2x ASM base.
3-morpholinopropane-1-sulfonic acid (MOPS)SigmaM1254Final concentration 200 mM in 2X ASM base.
96-pin replicatorFisher Scientific05-450-9Disposable replicators can also be used. Cat #NC1567338.
96-well sterile standard plate with lidFisher Scientific62406-081
AgarFisher ScientificDF0145-17-0
AnaeroPack 2.5 L Rectangular JarFisher Scientific23-246-385
CaCl2*2H2O Fisher ScientificC79-500Prepare a 1 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Final concentration 3.5 mM in 2x ASM base.
Defribrinated sheep's bloodTo prepare growth plates for Streptococcus and Prevotella.
Deoxyribonucleic acid from herring spermSigmaD7290Final concentration 1.2 mg/mL in 2x ASM base.
FeSO4*7H2O Fisher ScientificAA1449830Prepare a 1 mg/mL stock (3.6 mM) in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Keep wrapped in aluminum foil. Final concentration 0.0072 mM in 2x ASM base.
GasPaksFisher ScientificB260678
GlucoseFisher ScientificD16-3Prepare as a 20% stock (1.1 M) in water and sterilize by autoclave. Final concentration 6 mM in 2x ASM base.
HeminSigma51280Dissolve 100 mg of hemin in 2 mL of 1 M NaOH and then bring up volume to 200 mL with water. Store in an amber bottle or a regular bottle wrapped with aluminum foil at 4 °C.
K2SO4Fisher ScientificP304-500Prepare a 0.25 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Final concentration 0.54 mM in 2x ASM base.
KanamycinPrepare a 50 mg/mL stock solution in water. Filter sterilize with a 0.22 μm filter and store at 4 °C.
KClFisher ScientificP217-500Final concentration 30.0 mM in 2x ASM base.
KNO3Fisher ScientificP263-500Prepare a 1 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Final concentration 0.70 mM in 2x ASM base.
L-cysteine hydrochlorideFisher ScientificAAA1038922
L-Lactic acid SigmaL1750Prepare a 1 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. pH adjust to 7.0. Final concentration 18.6 mM in 2x ASM base.
L-TryptophanSigmaT0254Prepare a 0.1 M stock in 0.2 M NaOH and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Keep refrigerated at 4 °C wrapped in aluminum foil. Final concentration 0.132 mM in 2x ASM base.
Mannitol Salt AgarFisher ScientificB11407Prepare using manufacturer's recommendations.
MenadioneSigmaM5625Prepare a 10 mg/mL stock solution dissolved in 96-100% ethanol. Conserve at 4 °C wrapped in aluminium foil. Vortex before use.
MgCl2*6H2O Fisher ScientificAA12288A9Prepare a 1 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Final concentration 1.21 mM in 2x ASM base.
Mucin from porcine stomach - Type II SigmaM2378Prepare a 10 mg/mL (2x) stock in water; mix thoroughly before autoclaving. Keep at 4 °C.
Na2HPO4Fisher ScientificS375-500Prepare a 0.2 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Final concentration 2.5 mM in 2x ASM base.
N-acetylglucosamine SigmaA8625Prepare a 0.25 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Keep stock refrigerated at 4 °C. Final concentration 0.6 mM in 2x ASM base.
NaClFisher ScientificS271-500Final concentration 103.7 mM in 2x ASM base.
NaH2PO4*H2OFisher ScientificS369-500Prepare a 0.2 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Final concentration 2.6 mM in 2x ASM base.
NaOHFisher ScientificS318-500Prepare a 5 M stock solution. Use to adjust pH of 2x ASM base stock.
NH4ClFisher ScientificA661-500Final concentration 4.6 mM in 2x ASM base.
Oxolinic acidPrepare a 10 mg/mL stock solution 0.5 M NaOH. Filter sterilize with a 0.22 μm filter and store at 4 °C.
Polymixin BPrepare a 10 mg/mL stock solution in water. Filter sterilize with a 0.22 μm filter and store at 4 °C.
Pseudomonas Isolation AgarFisher ScientificDF0927-17-1Prepare using manufacturer's recommendations.
Todd Hewitt BrothFisher ScientificDF0492-17-6Prepare using manufacturer's recommendations.
Tryptic Soy BrothFisher ScientificDF0370-17-3Prepare using manufacturer's recommendations.
VancomycinPrepare a 50 mg/mL stock solution in water. Filter sterilize with a 0.22 μm filter and store at 4 °C.
Yeast ExtractFisher ScientificB11929
Yeast Synthetic Dropout without Tryptophan SigmaY1876Final concentration 8.0 mg/mL in 2x ASM base.

References

  1. Cogen, J. D., Nichols, D. P., Goss, C. H., Somayaji, R. Drugs, drugs, drugs: Current treatment paradigms in cystic fibrosis airway infections. J Pediatric Infect Dis Soc. 11 (2), S32-S39 (2022).
  2. O'Sullivan, B. P., Freedman, S. D. Cystic fibrosis. Lancet. 373 (9678), 1891-1904 (2009).
  3. Jean-Pierre, F., Vyas, A., Hampton, T. H., Henson, M. A., O'Toole, G. A. One versus many: Polymicrobial communities and the cystic fibrosis airway. mBio. 12 (2), e00006-e00021 (2021).
  4. Martin, C., et al. Longitudinal microbial and molecular dynamics in the cystic fibrosis lung after elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor therapy. Respir Res. 24 (1), 317 (2023).
  5. Sosinski, L. M., et al. A restructuring of microbiome niche space is associated with elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor therapy in the cystic fibrosis lung. J Cystic Fibros. 21 (6), 996 (2022).
  6. Orazi, G., O'Toole, G. A. 34;It takes a village": Mechanisms underlying antimicrobial recalcitrance of polymicrobial biofilms. J Bacteriol. 202 (1), e00530-e00619 (2019).
  7. Nichols, D. P., et al. Clinical effectiveness of elexacaftor/tezacaftor/ivacaftor in people with cystic fibrosis: A clinical trial. Am J Respir Crit Care Med. 205 (5), 529-539 (2022).
  8. Filkins, L. M., O'Toole, G. A. Cystic fibrosis lung infections: Polymicrobial, complex, and hard to treat. PLoS Pathog. 11 (12), e1005258 (2015).
  9. Limoli, D. H., et al. Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa co-infection is associated with cystic fibrosis-related diabetes and poor clinical outcomes. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 35 (6), 947-953 (2016).
  10. Jean-Pierre, F., et al. Community composition shapes microbial-specific phenotypes in a cystic fibrosis polymicrobial model system. Elife. 12 (12), e81604 (2023).
  11. Toole Orazi, G., O'Toole, G. A. Pseudomonas aeruginosa alters Staphylococcus aureus sensitivity to vancomycin in a biofilm model of cystic fibrosis infection. mBio. 8 (4), e00873-e00917 (2017).
  12. Lipuma, J. J. The sense and nonsense of antimicrobial susceptibility testing in cystic fibrosis. J Pediatric Infect Dis Soc. 11 (2), S46-S52 (2022).
  13. Coenye, T. Biofilm antimicrobial susceptibility testing: Where are we and where could we be going. Clin Microbiol Rev. 36 (4), e0002423 (2023).
  14. Waters, V. J., et al. Reconciling antimicrobial susceptibility testing and clinical response in antimicrobial treatment of chronic cystic fibrosis lung infections. Clin Infect Dis. 69 (10), 1812-1816 (2019).
  15. Vandeplassche, E., et al. Antibiotic susceptibility of cystic fibrosis lung microbiome members in a multispecies biofilm. Biofilm. 2, 100031 (2020).
  16. Varga, J. J., et al. Antibiotics drive expansion of rare pathogens in a chronic infection microbiome model. mSphere. 7 (5), e0031822 (2022).
  17. Turner, K. H., Wessel, A. K., Palmer, G. C., Murray, J. L., Whiteley, M. Essential genome of Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis sputum. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (13), 4110-4115 (2015).
  18. Clay, M. E., et al. Pseudomonas aeruginosa lasR mutant fitness in microoxia is supported by an anr-regulated oxygen-binding hemerythrin. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (6), 3167-3173 (2020).
  19. Hoffman, L. R., et al. Pseudomonas aeruginosa lasR mutants are associated with cystic fibrosis lung disease progression. J Cyst Fibros. 8 (1), 66-70 (2009).
  20. Heirali, A., et al. Sputum microbiota in adults with CF associates with response to inhaled tobramycin. Thorax. 75 (12), 1058-1064 (2020).
  21. Nelson, M. T., et al. Maintenance tobramycin primarily affects untargeted bacteria in the cf sputum microbiome. Thorax. 75 (9), 780-790 (2020).
  22. Kesthely, C. A., Rogers, R. R., El Hafi, B., Jean-Pierre, F., O'Toole, G. A. Transcriptional profiling and genetic analysis of a cystic fibrosis airway-relevant model shows asymmetric responses to growth in a polymicrobial community. Microbiol Spectr. 11 (5), e0220123 (2023).
  23. Jean-Pierre, F., Henson, M. A., O'Toole, G. A. Metabolic modeling to interrogate microbial disease: A tale for experimentalists. Front Mol Biosci. 8, 634479 (2021).
  24. Hendricks, M. R., et al. Respiratory syncytial virus infection enhances Pseudomonas aeruginosa biofilm growth through dysregulation of nutritional immunity. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (6), 1642-1647 (2016).
  25. Hogan, D. A., Vik, A., Kolter, R. A Pseudomonas aeruginosa quorum-sensing molecule influences Candida albicans morphology. Mol Microbiol. 54 (5), 1212-1223 (2004).
  26. Wu, Y., et al. Co-assembling living material as an in vitro lung epithelial infection model. Matter. 7 (1), 216-236 (2024).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Prevotella Melaninogenica

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved