嚢胞性線維症に関連する多微生物バイオフィルムの増殖によるコミュニティ表現型の調査

要約

このプロトコルは、細菌の種間相互作用の影響を調査するために使用できる嚢胞性線維症(CF)肺関連の4種の多微生物バイオフィルムモデルについて説明しています。

要約

ほとんどの in vitro モデルは、実際の環境で観察された複雑な相互作用から生じる細菌の表現型を完全に調査する能力を欠いています。これは、多臓器遺伝性疾患である嚢胞性線維症(CF)を患っている個人の気道で検出される、治療が困難な慢性の多微生物バイオフィルムベースの感染症の文脈で特に当てはまります。複数のマイクロバイオーム研究により、CF患者の気道で検出される微生物組成が定義されていますが(pwCF)、これまでのところ、重要なCF関連の肺の特徴を完全に統合した in vitro モデルはありませんでした。したがって、混合種CF肺感染症の病因を引き起こすメカニズムを調査する能力には、大きな知識のギャップが存在します。ここでは、最近開発された4種の微生物群集モデル( Pseudomonas aeruginosa、 黄色ブドウ球菌、Streptococcus sanguinis、およびCF様条件で増殖した Prevotella melaninogenica )について述べる。このシステムを利用することにより、いくつかの病原体の抗菌難性など、臨床的に関連性のある表現型が観察され、分子レベルで調査されました。この in vitro モデルの有用性は、慢性CF肺感染症の状況における種間相互作用の研究を容易にする標準化されたワークフローにあります。

概要

多臓器遺伝性疾患である嚢胞性線維症(CF)気道で検出されるような疾患の原因となる微生物を根絶することを目的とした戦略は、しばしば失敗します¹。つまり、粘液が豊富なCF肺環境で増殖する弾力性のあるバイオフィルム様微生物群集の存在は、数十年にわたる慢性感染症を引き起こす可能性があります²。さらに、最前線の抗菌薬(Abx)とモジュレーターの利用により、CF患者(pwCF)の転帰が改善されましたが、緑膿菌や黄色ブドウ球菌などの標準的なCF病原体に対して通常採用される「1つのバグ、1つの感染」臨床アプローチは、これらの個人の肺で検出された治療が困難な感染症を解決するのに効果がありませんでした^{3,4。5、6、7}。

過去20年間で、複数の研究が慢性CF肺疾患に対する私たちの理解を変えました⁸。つまり、pwCFの気道で検出され....

プロトコル

すべての試薬と機器の詳細は、 材料表に記載されています。

1.人工痰培地の調製

注:このプロトコル全体を通じて、人工喀痰培地(ASM)は、以前にTurnerら¹⁷によって発表されたSCFM2から修飾されたCF関連培地として定義されています。以下は、このメディアを準備する手順の説明です。ストックソリューションと保管条件については、 材料の表 を参照してください。このバージョンのASMは、元のバージョンの緩衝能力が長期にわたって安定したpHを許容しないという点で、Turnerら¹⁷ とは異なります。すなわち、 Streptococcus spp.や Prevotella spp.のような嫌気性菌による発酵活性は、増殖培地の酸性化をもたらす(未発表の観察結果)。そのため、3-モルホリノプロパン-1-スルホン酸(MOPS)の濃度を10 mMから100 mMに調整しました。

注:2x ASMベース(ASMb)ストック溶液を調製すると、ASM^10,1....

結果

図2に示されているように、いくつかの表現型が報告されており、これには、(1)単一栽培と比較して混合プランクトン群集を増殖させた場合の緑膿菌および黄色ブドウ球菌の生存細胞数の減少、(2)S.sanguinis細胞の多微生物増殖の増加、および(3)Jean-Pierreらによって以前に報告されたP.メラニノジェニカの混合群集増殖が?.......

ディスカッション

この臨床的に情報に基づいたin vitro共培養システムの有用性は、多微生物特異的な細菌機能を検出する能力にあります。すなわち、このモデルを利用することで、Prevotella spp.のコミュニティ特異的な増殖(図2)から、P. aeruginosa、S. aureus、S. sanguinisの最前線のCF Abxに対する感受性の変化(図3)ま.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)	Fisher Scientific	NC0387928	Prepare a 250 mg/mL stock in chloroform directly in the bottle. Keep at -20°C. Final concentration 200 μg/mL in 2x ASM base.
3-morpholinopropane-1-sulfonic acid (MOPS)	Sigma	M1254	Final concentration 200 mM in 2X ASM base.
96-pin replicator	Fisher Scientific	05-450-9	Disposable replicators can also be used. Cat #NC1567338.
96-well sterile standard plate with lid	Fisher Scientific	62406-081
Agar	Fisher Scientific	DF0145-17-0
AnaeroPack 2.5 L Rectangular Jar	Fisher Scientific	23-246-385
CaCl2*2H2O	Fisher Scientific	C79-500	Prepare a 1 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Final concentration 3.5 mM in 2x ASM base.
Defribrinated sheep's blood			To prepare growth plates for Streptococcus and Prevotella.
Deoxyribonucleic acid from herring sperm	Sigma	D7290	Final concentration 1.2 mg/mL in 2x ASM base.
FeSO4*7H2O	Fisher Scientific	AA1449830	Prepare a 1 mg/mL stock (3.6 mM) in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Keep wrapped in aluminum foil. Final concentration 0.0072 mM in 2x ASM base.
GasPaks	Fisher Scientific	B260678
Glucose	Fisher Scientific	D16-3	Prepare as a 20% stock (1.1 M) in water and sterilize by autoclave. Final concentration 6 mM in 2x ASM base.
Hemin	Sigma	51280	Dissolve 100 mg of hemin in 2 mL of 1 M NaOH and then bring up volume to 200 mL with water. Store in an amber bottle or a regular bottle wrapped with aluminum foil at 4 °C.
K2SO4	Fisher Scientific	P304-500	Prepare a 0.25 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Final concentration 0.54 mM in 2x ASM base.
Kanamycin			Prepare a 50 mg/mL stock solution in water. Filter sterilize with a 0.22 μm filter and store at 4 °C.
KCl	Fisher Scientific	P217-500	Final concentration 30.0 mM in 2x ASM base.
KNO3	Fisher Scientific	P263-500	Prepare a 1 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Final concentration 0.70 mM in 2x ASM base.
L-cysteine hydrochloride	Fisher Scientific	AAA1038922
L-Lactic acid	Sigma	L1750	Prepare a 1 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. pH adjust to 7.0. Final concentration 18.6 mM in 2x ASM base.
L-Tryptophan	Sigma	T0254	Prepare a 0.1 M stock in 0.2 M NaOH and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Keep refrigerated at 4 °C wrapped in aluminum foil. Final concentration 0.132 mM in 2x ASM base.
Mannitol Salt Agar	Fisher Scientific	B11407	Prepare using manufacturer's recommendations.
Menadione	Sigma	M5625	Prepare a 10 mg/mL stock solution dissolved in 96-100% ethanol. Conserve at 4 °C wrapped in aluminium foil. Vortex before use.
MgCl2*6H2O	Fisher Scientific	AA12288A9	Prepare a 1 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Final concentration 1.21 mM in 2x ASM base.
Mucin from porcine stomach - Type II	Sigma	M2378	Prepare a 10 mg/mL (2x) stock in water; mix thoroughly before autoclaving. Keep at 4 °C.
Na2HPO4	Fisher Scientific	S375-500	Prepare a 0.2 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Final concentration 2.5 mM in 2x ASM base.
N-acetylglucosamine	Sigma	A8625	Prepare a 0.25 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Keep stock refrigerated at 4 °C. Final concentration 0.6 mM in 2x ASM base.
NaCl	Fisher Scientific	S271-500	Final concentration 103.7 mM in 2x ASM base.
NaH2PO4*H2O	Fisher Scientific	S369-500	Prepare a 0.2 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Final concentration 2.6 mM in 2x ASM base.
NaOH	Fisher Scientific	S318-500	Prepare a 5 M stock solution. Use to adjust pH of 2x ASM base stock.
NH4Cl	Fisher Scientific	A661-500	Final concentration 4.6 mM in 2x ASM base.
Oxolinic acid			Prepare a 10 mg/mL stock solution 0.5 M NaOH. Filter sterilize with a 0.22 μm filter and store at 4 °C.
Polymixin B			Prepare a 10 mg/mL stock solution in water. Filter sterilize with a 0.22 μm filter and store at 4 °C.
Pseudomonas Isolation Agar	Fisher Scientific	DF0927-17-1	Prepare using manufacturer's recommendations.
Todd Hewitt Broth	Fisher Scientific	DF0492-17-6	Prepare using manufacturer's recommendations.
Tryptic Soy Broth	Fisher Scientific	DF0370-17-3	Prepare using manufacturer's recommendations.
Vancomycin			Prepare a 50 mg/mL stock solution in water. Filter sterilize with a 0.22 μm filter and store at 4 °C.
Yeast Extract	Fisher Scientific	B11929
Yeast Synthetic Dropout without Tryptophan	Sigma	Y1876	Final concentration 8.0 mg/mL in 2x ASM base.