АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В этом протоколе описывается модель полимикробной биопленки, относящейся к лечению муковисцидоза (МВ), которая может быть использована для изучения влияния межвидовых взаимодействий бактерий.

Аннотация

Большинству моделей in vitro не хватает возможности полностью исследовать бактериальные фенотипы, возникающие в результате сложных взаимодействий, наблюдаемых в реальных условиях. Это особенно верно в контексте трудно поддающихся лечению, хронических и полимикробных биопленочных инфекций, обнаруженных в дыхательных путях людей, живущих с муковисцидозом (МВ), полиорганным генетическим заболеванием. В то время как многочисленные исследования микробиома определили микробный состав, обнаруженный в дыхательных путях людей с муковисцидозом (pwCF), ни одна модель in vitro до сих пор не имеет полностью интегрированных критических особенностей легких, связанных с муковисцидозом. Таким образом, существует значительный пробел в знаниях о возможности исследования механизмов, управляющих патогенезом смешанных видов инфекций легких с муковисцидозом. В этой статье мы описываем недавно разработанную модель микробного сообщества четырех видов, включая Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus sanguinis, и Prevotella melaninogenica , выращенную в условиях, подобных муковисцидозу. Благодаря использованию этой системы на молекулярном уровне наблюдались и изучались клинически значимые фенотипы, такие как антимикробная стойкость нескольких патогенов. Полезность этой модели in vitro заключается в ее стандартизированном рабочем процессе, который может облегчить изучение межвидовых взаимодействий в контексте хронических инфекций легких при муковисцидозе.

Введение

Стратегии, направленные на уничтожение болезнетворных микробов, таких как те, которые обнаруживаются в дыхательных путях муковисцидоза (МВ), полиорганного генетического заболевания, часто терпят неудачу1. То есть, присутствие устойчивых биопленкоподобных микробных сообществ, растущих в богатой слизью среде легких МВ, может вызывать хронические инфекции, охватывающие несколько десятилетий2. Кроме того, несмотря на то, что использование противомикробных препаратов первой линии (Abx) и модуляторов привело к улучшению исходов у людей с муковисцидозом (pwCF), клинический подход «один вирус, одна инфекция», обычно используемый против канонических патогенов муковисцидоза, таких как Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus, оказался неэффективным в разрешении трудно поддающихся лечению инфекций, обнаруженных в легких этих людей. 5,6,7.

За последние два десятилетия многочисленные исследования изменили наше представление о хроническом заболевании легких при муковисцидозе8. То есть, отчеты указывают на то, что инфекции, обнаруженные в дыхательных путях pwCF, вызваны не только одним патогеном, но и полимикробными по своей природе8. Кроме того, хотя патогенез смешанных видов инфекций легких CF все еще плохо изучен, клинические данные показывают, что pwCF, которые коинфицированы как S. aureus , так и P. aeruginosa в дыхательных путях, ухудшают функцию легких, чем люди, колонизированные любым из этих двух патогенов9.

Предполагается, что межвидовые взаимодействия между патогенами муковисцидоза являются причиной того, что полимикробные инфекции на основе биопленки не могут быть легко искоренены с помощью терапевтических средств для лечения муковисцидоза, что в конечном итоге влияет на исходы лечения пациентов3. Подтверждая это, исследования in vitro показали, что взаимодействие между микробами, такими как P. aeruginosa, S. aureus и другими, может влиять на клинически значимые фенотипы, такие как реакция Abx на препараты первой линии для лечения муковисцидоза, включая ванкомицин и тобрамицин 6,10,11. Таким образом, пересмотр существующих стратегий лечения, направленных на искоренение возбудителей муковисцидоза в контексте смешанных инфекций, еще не достигнут.

Золотой стандарт в лечении микробных инфекций легких при МВ в значительной степени опирается на использование тестирования чувствительности к противомикробным препаратам (АСТ) для руководства клиническими вмешательствами12. Тем не менее, АСТ обычно проводят с использованием бактериальных монокультур, выращенных в богатых и хорошо перемешанных культурах, что не отражает условия роста микроорганизмов, обнаруженные в дыхательных путях МВ 3,13. Учитывая значительный разрыв между исходами лечения пациентов и успехом лечения, клинические отчеты в настоящее время выступают за разработку новых подходов, интегрирующих критические особенности легких с муковисцидозом12,14.

В нескольких исследованиях были разработаны многовидовые бактериальные системы in vitro, относящиеся к муковисцидозу, содержащие более двух патогенов15,16. Тем не менее, эти модели (1) не полностью отражают полимикробную и биопленкоподобную природу легких при МВ и (2) не используют условия питания и окружающей среды, приближенные к тем, которые обнаруживаются в дыхательных путях МВ15,16. Путем анализа больших наборов данных по генам 16S рРНК, полученных из больших наборов данных 16S рРНК в легких, Жан-Пьер и его коллеги недавно разработали модель ко-культуры in vitro, интегрирующую вышеупомянутые особенности. Эта система включает P. aeruginosa, S. aureus, Streptococcus spp. и Prevotella spp., выращенные в условиях, подобных проходимым в дыхательных путях, и стабильные до 14 дней. Авторы также сообщили о специфическом для сообщества росте Prevotella spp. и нескольких изменениях в чувствительности Abx этих патогенов муковисцидоза через механизмы, которые еще предстоит идентифицировать10. Эта податливая система in vitro также дала возможность углубиться в механически сфокусированные вопросы, связанные с устойчивостью Abx распространенного варианта P. aeruginosa, часто обнаруживаемого в дыхательных путях pwCF10. Таким образом, цель этого протокола состоит в том, чтобы предоставить исследовательскому сообществу муковисцидозов стандартизированный экспериментальный рабочий процесс для выращивания биопленки in vitro, которая имеет потенциал для дальнейшего расширения для решения ряда вопросов, связанных с муковисцидозом.

протокол

Подробная информация обо всех реагентах и оборудовании указана в Таблице материалов.

1. Приготовление искусственной среды для отведения мокроты

ПРИМЕЧАНИЕ: В рамках данного протокола искусственная среда мокроты (ASM) определяется как среда, относящаяся к CF, модифицированная из SCFM2, ранее опубликованной Turner и коллегами17. Ниже приведено описание этапов подготовки этого носителя. Смотрите таблицу материалов для изготовления стоковых растворов и условий хранения. Эта версия ASM отличается от Turner et al.,17 тем, что буферная способность в оригинальной версии не позволяет обеспечить стабильный pH с течением времени. То есть, ферментационная активность, осуществляемая Streptococcus spp. и анаэробами, такими как Prevotella spp., приводит к подкислению питательной среды (неопубликованные наблюдения). Таким образом, концентрация 3-морфолинопропан-1-сульфоновой кислоты (МОПС) была скорректирована с 10 мМ до 100 мМ.

ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовление исходного раствора с 2x ASM base (ASMb) облегчает добавление таких компонентов, как муцин, агар, вода и т.д., не влияя на конечную концентрацию молекул, присутствующих в ASM10,18. 2x ASMb можно приготовить заранее и хранить при температуре 4 °C до двух недель в темном месте. Если среда пожелтеет, выбросьте.

  1. Чтобы приготовить 2x базовое масло ASM, в чистую мензурку, содержащую 400 мл diH2O, добавьте следующее, помешивая:
    1. Добавьте 6,50 мл 0,2 М2PO4. H2O запас; 6,25 мл массы 0,2 М Na2HPO4 ; 348 мкл приклада 1 М КНО3 ; 1,084 мл приклада 0,25 M K2SO4 .
    2. Добавьте 4,0 г синтетического дропаута дрожжей без триптофана; 3,032 г NaCl; 20,92 г швабры; 1,116 г KCl и 0,124 г NH4Cl.
    3. Добавьте 9,30 мл 1 М запаса L-молочной кислоты; 2,70 мл 1,1 М глюкозы; 1,75 мл запаса 1 М CaCl2,2Н 2О; 1,20 мл 0,25 М N-ацетилглюкозамина и 1,00 мл 3,6 мМ FeSO4,7H 2O.
    4. Добавьте 660 мкл 0,1 М триптофана; 606 мкл 1 M MgCl2.6H 2O; 0,60 г дезоксирибонуклеиновой кислоты из спермы сельди; 400 мкл 250 мг/мл 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфохолина (DOPC).
    5. После добавления всех компонентов отрегулируйте pH до 6,80 с помощью запаса NaOH 5 М. Довести до 500 мл с помощью diH2O. Стерилизовать с помощью фильтра 0,22 мкм и хранить при температуре 4 °C.
  2. Чтобы приготовить бульон муцина в концентрации 10 мг/мл (2 раза), используйте чистую стеклянную бутылку, содержащую 250 мл diH2O, и при перемешивании:
    1. Добавьте 5,0 г муцина из желудка свиньи - тип II. Перемешиваем суспензию в течение 10 мин. До 500 мл с diH2O.
    2. Стерилизовать автоклавированием при 121 °C в течение 15 минут. Держите при температуре 4 °C до утилизации.
  3. Восстановить ASM.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг необходимо выполнить в день проведения эксперимента.
    1. Смешайте объемное соотношение 1:1 для 2x ASMb и 10 мг/мл муцина.
    2. Перед применением тщательно взбейте Vortex.

2. Приготовление полимикробных селективных сред

ПРИМЕЧАНИЕ: Ниже приведены количества, необходимые для приготовления объема 1 л среды.

  1. Для приготовления Mannitol Salt Agar (MSA) и Pseudomonas Isolation Agar (PIA) следуйте инструкциям производителя.
  2. Чтобы приготовить селективный агар Prevotella (PSA), в чистую стеклянную бутылку добавьте следующее:
    1. 30,0 г триптического соевого бульона (СТБ). 15,0 г агара. 5,00 г дрожжевого экстракта. 0,50 г L-цистеина гидрохлорида.
    2. 10,0 мл из 0,5 мг/мл гемина. 100 мкл запаса менадиона 10 мг/мл.
    3. Добавьте 940 мл diH2O и перемешайте. Стерилизовать автоклавированием при 121 °C в течение 15 минут.
    4. Когда флакон остынет (т.е. бутылку можно держать голыми руками), добавьте во время помешивания: 50,0 мл дебрибринационной овечьей крови. 2,00 мл 50 мг/мл канамицина. 150 мкл из запаса ванкомицина 50 мг/мл. 500 мкл полимиксина B с концентрацией 10 мг/мл.
  3. Чтобы приготовить стрептококк селективный агар (SSA), в чистую стеклянную бутылку добавьте следующее:
    1. 30,0 г БЦБ. 15,0 г агара.
    2. Добавьте 950 мл diH2O и перемешайте. Стерилизовать автоклавированием при 121 °C в течение 15 минут.
    3. Когда флакон остынет (т.е. бутылку можно держать голыми руками), добавьте во время помешивания: 50,0 мл дебрибринационной овечьей крови. 1,00 мл полимиксина B в дозе 10 мг/мл. 1,00 мл 10 мг/мл оксолиновой кислоты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Разлейте по тарелкам и держите при температуре 4 °C не более 1 месяца. Перед использованием дайте планшетам высохнуть при комнатной температуре за 24 часа до их вакцинации. ПСА был валидирован с P. melaninogenica и Prevotella intermedia. SSA была валидирована для S. sanguinis, а также группы Streptococcus milleri (Streptococcus constellatus, Streptococcus intermedius и Streptococcus anginosus, обозначенных как SMG). Настоятельно рекомендуется повторно валидировать эти селективные среды, если необходимо тестировать новые штаммы.

3. Приготовление бактериальных жидких сред и условия их роста

  1. Для регулярного выращивания P. aeruginosa и S. aureus используйте стерильную богатую среду (например, отвар лизогенеза (LB) или TSB).
    1. Начните обработку жидкости на ночь, выбрав одну колонию, ранее выращенную на агаровой пластине LB/TSB, в течение 20-24 часов при 37 °C.
    2. Бульонные культуры выращивают при температуре 37 °C в течение ночи с встряхиванием при 250 об/мин в течение 16-18 часов.
  2. Для выращивания Streptococcus spp. используют стерильный бульон Тодда Хьюитта с добавлением 0,5 % экстракта дрожжей (THB-YE).
    1. Начните культивирование жидкости в течение ночи из одной колонии, предварительно выращенной на агаровой пластине TSB с добавлением 5% дефибринированной овечьей крови (кровяная агаровая пластина) в течение 24 ч при 37 °C + 5%CO2.
    2. Выращивайте культуры THB-YE анаэробно или при 37 °C + 5% CO2 в течение ночи без встряхивания в течение 18-22 часов.
  3. Чтобы вырастить Prevotella spp., приготовьте 1 л питательной среды Prevotella (PGM), добавив в чистую бутылку:
    1. 30,0 г БЦБ. 5,00 г дрожжевого экстракта. 0,50 г L-цистеина гидрохлорида. 10,0 мл гемина, 0,5 мг/мл, и 100 мкл менадиона, 10 мг/мл.
    2. Добавьте 990 мл diH2O. Стерилизуйте автоклавированием при 121 °C в течение 15 минут. Оберните бутылку алюминиевой фольгой, чтобы защитить ее от света.
    3. Выращивайте колонии Prevotella spp. на планшете с кровяным агаром, инкубируемом анаэробно при 37 °C в течение 48 ч.
    4. Закиньте одну колонию в МПГ и выращивайте в течение ночи без встряхивания при температуре 37 °C анаэробно в течение 24 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: МПГ можно хранить при комнатной температуре до двух недель. Перед использованием настоятельно рекомендуется провести испытания на стерильность для каждой питательной среды. Если вы не используете анаэробную камеру, может потребоваться начать ночной прием жидкости Prevotella spp. с участка колоний.

4. Подготовка к эксперименту по совместной культуре

ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1 изображен обобщенный экспериментальный рабочий процесс. Постановка эксперимента может быть выполнена в кислородных условиях, если время подготовки занимает менее 1 ч. Если ожидается, что это займет больше времени, настоятельно рекомендуется проводить эксперимент с использованием анаэробной камеры (с 10%CO2, 10%H2 и 80%N2 смешанного газа). Для инкубации экспериментальных образцов также можно использовать анаэробные баночки.

  1. Подготовка монокультур и сокультур
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все этапы центрифугирования при температуре 10 000 x g в течение 2 минут при комнатной температуре. Для сокультур смешайте образцы бактерий непосредственно перед инокуляцией 96-луночных планшетов. Как правило, из ночных культур собирают объем 1 мл для штаммов P. aeruginosa и S. aureus . Для Streptococcus spp. и Prevotella spp. ночные объемы могут варьироваться в пределах 2-4 мл. Эти объемы можно регулировать в зависимости от количества проверяемых условий.
    1. Используя бактериальную жидкость из ночных культур, выполните следующие действия:
      1. Для штаммов P. aeruginosa и S. aureus дважды промойте стерильным фосфатно-солевым буфером (PBS).
      2. Для Streptococcus spp. и Prevotella spp. промойте один раз стерильным PBS.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Осторожно выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки, так как гранулы могут быть легко потеряны.
      3. После промывки суспендируйте каждую гранулу в 1 мл 1x разбавленного водой ASMb.
      4. Сделайте разведение каждого образца в соотношении 1:10 в стерильном PBS и измерьте внешний диаметр600.
      5. Настройте все языки и региональные параметры до600 наружного диаметра, равного 0,2 в ASM.
      6. Используя наружный диаметр600 = 0,2 суспензии, разбавьте в ASM образцы бактерий до конечного наружного диаметра600 , равного 0,01 (для каждого микроба) для монокультур и кокультур.
      7. Тщательно взбейте вихрь в течение 5 с.
        Примечание: Например, чтобы получить в общей сложности 1 мл монокультурной суспензии ASM P. aeruginosa при наружном диаметре600 = 0,01, добавьте 50 мкл P. aeruginosa при наружном диаметре600 = 0,2 к объему 950 мкл ASM. Для совместного культивирования берут по 50 мкл суспензий P. aeruginosa, S. aureus, Streptococcus spp. и Prevotella spp. при наружном диаметре600 = 0,2 и добавляют к 800 мкл ASM.
      8. С помощью пипетки добавьте 100 мкл суспензий монокультуры и ко-культуры в три отдельные лунки стерильного пластикового 96-луночного планшета с плоским дном.
      9. Инкубировать планшет (не встряхивая) в течение 24 ч при 37 °C в бескислородных условиях.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь также можно использовать другие напряжения кислорода (например, микроксию, нормоксию). Тем не менее, модель была разработана и проверена в бескислородных условиях. Подтвердите начальную инокуляцию путем последовательного разбавления моно- и кокультуральных бактериальных суспензий, и настоятельно рекомендуется нанесение PIA, MSA, SSA и PSA. Целевая исходная концентрация для каждого вида бактерий составляет 1 × 107 КОЕ/мл (P. aeruginosa), 3,5 × 106 КОЕ/мл (S. aureus), 1,2 × 106 КОЕ/мл (Streptococcus spp.) и 4,6 × 106 КОЕ/мл (Prevotella spp.). Бактериальный инокулят также может быть модифицирован, как описано Жан-Пьером и коллегами10.
  2. Замените среду после образования биопленки.
    1. Через 24 ч инкубации удалите неприкрепленные (планктонные) клетки с помощью аспирации с помощью многоканальной пипетки.
    2. Пополните предварительно сформированные биопленки 100 μл свежего ASM или желаемого лечения (например, антибиотиков, метаболитов и т. д.).
    3. Инкубируйте планшет в течение еще 24 часов при температуре 37 °C в бескислородных условиях.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти шаги можно выполнять аэробно, если выполнять их быстро (т.е. менее чем за 1 минуту). В противном случае используйте анаэробную камеру.

5. Сбор и нанесение гальванических покрытий на образцы

  1. После дополнительных 24 ч инкубации аспирируйте неприкрепленные (планктонные) клетки с помощью многоканальной пипетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Планктонную фракцию можно сохранять, последовательно разбавлять и наносить на селективные среды или отбраковывать.
  2. Аккуратно промойте биопленки дважды, используя 125 μл стерильного PBS, и выбросьте объемы.
  3. Добавьте 50 мкл стерильного PBS и отделите биопленки, аккуратно соскребая клетки со планшета с помощью 96-контактного репликатора.
  4. Перенесите ресуспендированные биопленочные клетки в ряд А нового стерильного 96-луночного планшета.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 96-луночный планшет будет содержать стерильный PBS в рядах от B до H.
  5. Выполните 10-кратное серийное разведение планктонной (при необходимости) и биопленочной фракций.
  6. Планшет 3-5 мкл каждого образца разбавления на PIA, MSA, SSA и PSA.
  7. Дайте местам прививки высохнуть.

6. Инкубация селективных планшетов и подсчет колониеобразующих блоков (КОЕ)

  1. P. aeruginosa и S. aureus инкубировать при 37°С в течение 18-20 ч.
  2. Streptococcus spp инкубировать при 37 °C в бескислородных условиях в течение 24 ч.
  3. Prevotella spp инкубировать при 37 °C в бескислородных условиях в течение 48 часов.
  4. После инкубации подсчитайте колонии (~10-35 на пятно) и рассчитайте КОЕ на мл.
  5. Построение графика данных с помощью средства визуализации.

Результаты

Как показано на рисунке 2, сообщалось о нескольких фенотипах, включая (1) снижение количества жизнеспособных клеток P. aeruginosa и S. aureus при выращивании в смешанных планктонных сообществах по сравнению с монокультурой, (2) увеличение полимикробного...

Обсуждение

Полезность этой клинически информированной системы ко-культивирования in vitro заключается в ее способности обнаруживать полимикробно-специфические бактериальные функции. То есть, используя эту модель, мы сообщили о микробных фенотипах, варьирующихся от популяци...

Раскрытие информации

Авторы заявляют о неразглашении информации.

Благодарности

Мы хотели бы выразить признательность д-ру Джорджу А. О'Тулу и д-ру Томасу Х. Хэмптону за их значительную роль в проектировании и развитии модели полимикробного сообщества in vitro . Мы благодарим доктора Софи Робитайл за ее полезные комментарии к рукописи. Эта работа была поддержана грантом Фонда муковисцидоза, JEAN21F0 F.J-P. Рисунок 1 рукописи создан с помощью BioRender.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)Fisher ScientificNC0387928Prepare a 250 mg/mL stock in chloroform directly in the bottle. Keep at -20°C. Final concentration 200 μg/mL in 2x ASM base.
3-morpholinopropane-1-sulfonic acid (MOPS)SigmaM1254Final concentration 200 mM in 2X ASM base.
96-pin replicatorFisher Scientific05-450-9Disposable replicators can also be used. Cat #NC1567338.
96-well sterile standard plate with lidFisher Scientific62406-081
AgarFisher ScientificDF0145-17-0
AnaeroPack 2.5 L Rectangular JarFisher Scientific23-246-385
CaCl2*2H2O Fisher ScientificC79-500Prepare a 1 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Final concentration 3.5 mM in 2x ASM base.
Defribrinated sheep's bloodTo prepare growth plates for Streptococcus and Prevotella.
Deoxyribonucleic acid from herring spermSigmaD7290Final concentration 1.2 mg/mL in 2x ASM base.
FeSO4*7H2O Fisher ScientificAA1449830Prepare a 1 mg/mL stock (3.6 mM) in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Keep wrapped in aluminum foil. Final concentration 0.0072 mM in 2x ASM base.
GasPaksFisher ScientificB260678
GlucoseFisher ScientificD16-3Prepare as a 20% stock (1.1 M) in water and sterilize by autoclave. Final concentration 6 mM in 2x ASM base.
HeminSigma51280Dissolve 100 mg of hemin in 2 mL of 1 M NaOH and then bring up volume to 200 mL with water. Store in an amber bottle or a regular bottle wrapped with aluminum foil at 4 °C.
K2SO4Fisher ScientificP304-500Prepare a 0.25 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Final concentration 0.54 mM in 2x ASM base.
KanamycinPrepare a 50 mg/mL stock solution in water. Filter sterilize with a 0.22 μm filter and store at 4 °C.
KClFisher ScientificP217-500Final concentration 30.0 mM in 2x ASM base.
KNO3Fisher ScientificP263-500Prepare a 1 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Final concentration 0.70 mM in 2x ASM base.
L-cysteine hydrochlorideFisher ScientificAAA1038922
L-Lactic acid SigmaL1750Prepare a 1 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. pH adjust to 7.0. Final concentration 18.6 mM in 2x ASM base.
L-TryptophanSigmaT0254Prepare a 0.1 M stock in 0.2 M NaOH and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Keep refrigerated at 4 °C wrapped in aluminum foil. Final concentration 0.132 mM in 2x ASM base.
Mannitol Salt AgarFisher ScientificB11407Prepare using manufacturer's recommendations.
MenadioneSigmaM5625Prepare a 10 mg/mL stock solution dissolved in 96-100% ethanol. Conserve at 4 °C wrapped in aluminium foil. Vortex before use.
MgCl2*6H2O Fisher ScientificAA12288A9Prepare a 1 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Final concentration 1.21 mM in 2x ASM base.
Mucin from porcine stomach - Type II SigmaM2378Prepare a 10 mg/mL (2x) stock in water; mix thoroughly before autoclaving. Keep at 4 °C.
Na2HPO4Fisher ScientificS375-500Prepare a 0.2 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Final concentration 2.5 mM in 2x ASM base.
N-acetylglucosamine SigmaA8625Prepare a 0.25 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Keep stock refrigerated at 4 °C. Final concentration 0.6 mM in 2x ASM base.
NaClFisher ScientificS271-500Final concentration 103.7 mM in 2x ASM base.
NaH2PO4*H2OFisher ScientificS369-500Prepare a 0.2 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Final concentration 2.6 mM in 2x ASM base.
NaOHFisher ScientificS318-500Prepare a 5 M stock solution. Use to adjust pH of 2x ASM base stock.
NH4ClFisher ScientificA661-500Final concentration 4.6 mM in 2x ASM base.
Oxolinic acidPrepare a 10 mg/mL stock solution 0.5 M NaOH. Filter sterilize with a 0.22 μm filter and store at 4 °C.
Polymixin BPrepare a 10 mg/mL stock solution in water. Filter sterilize with a 0.22 μm filter and store at 4 °C.
Pseudomonas Isolation AgarFisher ScientificDF0927-17-1Prepare using manufacturer's recommendations.
Todd Hewitt BrothFisher ScientificDF0492-17-6Prepare using manufacturer's recommendations.
Tryptic Soy BrothFisher ScientificDF0370-17-3Prepare using manufacturer's recommendations.
VancomycinPrepare a 50 mg/mL stock solution in water. Filter sterilize with a 0.22 μm filter and store at 4 °C.
Yeast ExtractFisher ScientificB11929
Yeast Synthetic Dropout without Tryptophan SigmaY1876Final concentration 8.0 mg/mL in 2x ASM base.

Ссылки

  1. Cogen, J. D., Nichols, D. P., Goss, C. H., Somayaji, R. Drugs, drugs, drugs: Current treatment paradigms in cystic fibrosis airway infections. J Pediatric Infect Dis Soc. 11 (2), S32-S39 (2022).
  2. O'Sullivan, B. P., Freedman, S. D. Cystic fibrosis. Lancet. 373 (9678), 1891-1904 (2009).
  3. Jean-Pierre, F., Vyas, A., Hampton, T. H., Henson, M. A., O'Toole, G. A. One versus many: Polymicrobial communities and the cystic fibrosis airway. mBio. 12 (2), e00006-e00021 (2021).
  4. Martin, C., et al. Longitudinal microbial and molecular dynamics in the cystic fibrosis lung after elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor therapy. Respir Res. 24 (1), 317 (2023).
  5. Sosinski, L. M., et al. A restructuring of microbiome niche space is associated with elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor therapy in the cystic fibrosis lung. J Cystic Fibros. 21 (6), 996 (2022).
  6. Orazi, G., O'Toole, G. A. 34;It takes a village": Mechanisms underlying antimicrobial recalcitrance of polymicrobial biofilms. J Bacteriol. 202 (1), e00530-e00619 (2019).
  7. Nichols, D. P., et al. Clinical effectiveness of elexacaftor/tezacaftor/ivacaftor in people with cystic fibrosis: A clinical trial. Am J Respir Crit Care Med. 205 (5), 529-539 (2022).
  8. Filkins, L. M., O'Toole, G. A. Cystic fibrosis lung infections: Polymicrobial, complex, and hard to treat. PLoS Pathog. 11 (12), e1005258 (2015).
  9. Limoli, D. H., et al. Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa co-infection is associated with cystic fibrosis-related diabetes and poor clinical outcomes. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 35 (6), 947-953 (2016).
  10. Jean-Pierre, F., et al. Community composition shapes microbial-specific phenotypes in a cystic fibrosis polymicrobial model system. Elife. 12 (12), e81604 (2023).
  11. Toole Orazi, G., O'Toole, G. A. Pseudomonas aeruginosa alters Staphylococcus aureus sensitivity to vancomycin in a biofilm model of cystic fibrosis infection. mBio. 8 (4), e00873-e00917 (2017).
  12. Lipuma, J. J. The sense and nonsense of antimicrobial susceptibility testing in cystic fibrosis. J Pediatric Infect Dis Soc. 11 (2), S46-S52 (2022).
  13. Coenye, T. Biofilm antimicrobial susceptibility testing: Where are we and where could we be going. Clin Microbiol Rev. 36 (4), e0002423 (2023).
  14. Waters, V. J., et al. Reconciling antimicrobial susceptibility testing and clinical response in antimicrobial treatment of chronic cystic fibrosis lung infections. Clin Infect Dis. 69 (10), 1812-1816 (2019).
  15. Vandeplassche, E., et al. Antibiotic susceptibility of cystic fibrosis lung microbiome members in a multispecies biofilm. Biofilm. 2, 100031 (2020).
  16. Varga, J. J., et al. Antibiotics drive expansion of rare pathogens in a chronic infection microbiome model. mSphere. 7 (5), e0031822 (2022).
  17. Turner, K. H., Wessel, A. K., Palmer, G. C., Murray, J. L., Whiteley, M. Essential genome of Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis sputum. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (13), 4110-4115 (2015).
  18. Clay, M. E., et al. Pseudomonas aeruginosa lasR mutant fitness in microoxia is supported by an anr-regulated oxygen-binding hemerythrin. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (6), 3167-3173 (2020).
  19. Hoffman, L. R., et al. Pseudomonas aeruginosa lasR mutants are associated with cystic fibrosis lung disease progression. J Cyst Fibros. 8 (1), 66-70 (2009).
  20. Heirali, A., et al. Sputum microbiota in adults with CF associates with response to inhaled tobramycin. Thorax. 75 (12), 1058-1064 (2020).
  21. Nelson, M. T., et al. Maintenance tobramycin primarily affects untargeted bacteria in the cf sputum microbiome. Thorax. 75 (9), 780-790 (2020).
  22. Kesthely, C. A., Rogers, R. R., El Hafi, B., Jean-Pierre, F., O'Toole, G. A. Transcriptional profiling and genetic analysis of a cystic fibrosis airway-relevant model shows asymmetric responses to growth in a polymicrobial community. Microbiol Spectr. 11 (5), e0220123 (2023).
  23. Jean-Pierre, F., Henson, M. A., O'Toole, G. A. Metabolic modeling to interrogate microbial disease: A tale for experimentalists. Front Mol Biosci. 8, 634479 (2021).
  24. Hendricks, M. R., et al. Respiratory syncytial virus infection enhances Pseudomonas aeruginosa biofilm growth through dysregulation of nutritional immunity. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (6), 1642-1647 (2016).
  25. Hogan, D. A., Vik, A., Kolter, R. A Pseudomonas aeruginosa quorum-sensing molecule influences Candida albicans morphology. Mol Microbiol. 54 (5), 1212-1223 (2004).
  26. Wu, Y., et al. Co-assembling living material as an in vitro lung epithelial infection model. Matter. 7 (1), 216-236 (2024).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

in vitroPseudomonas aeruginosaStaphylococcus aureusStreptococcus sanguinisPrevotella melaninogenica

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены