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摘要

该方案描述了囊性纤维化 （CF） 肺相关的四物种多微生物生物膜模型，可用于探索细菌种间相互作用的影响。

摘要

大多数 体外 模型缺乏完全探测从现实环境中观察到的复杂相互作用中出现的细菌表型的能力。在囊性纤维化 （CF）（一种多器官遗传病）患者的气道中检测到难以治疗的慢性和基于多微生物生物膜的感染的情况下，尤其如此。虽然多项微生物组研究已经确定了在 CF 患者 （pwCF） 气道中检测到的微生物组成，但迄今为止还没有 体外 模型完全整合关键的 CF 相关肺部特征。因此，在研究驱动混合种 CF 肺部感染发病机制的能力方面存在重大知识差距。在这里，我们描述了最近开发的四种微生物群落模型，包括在 CF 样条件下生长 的铜绿假单胞菌、 金黄色葡萄球菌、 血链球菌和产黑素 普雷沃氏 菌。通过利用该系统，在分子水平上观察和探索了临床相关的表型，例如几种病原体的抗菌顽固性。这种 体外 模型的有用性在于其标准化工作流程，可以促进在慢性 CF 肺部感染背景下研究物种间相互作用。

引言

旨在根除致病微生物的策略，例如在囊性纤维化 （CF） 气道（一种多器官遗传病）中检测到的微生物，经常失败1。也就是说，在富含粘液的 CF 肺部环境中生长的弹性生物膜样微生物群落的存在会导致长达数十年的慢性感染2。此外，尽管使用一线抗菌剂 （Abx） 和调节剂改善了 CF 患者 （pwCF） 的预后，但通常针对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌等典型 CF 病原体采用的"一虫一感染"临床方法在解决在这些个体肺部检测到的难以治疗的感染方面无效 3,4，5,6,7.

在过去的二十年里，多项研究改变了我们对慢性 CF 肺病的理解8。也就是说，报告表明，在 pwCF 气道中检测到的感染不仅仅是由单一病原体引起的，而是本质上是多种微生物8。此外，尽管混合种 CF 肺部感染的发病机制仍然知之甚少，但临床证据表明，与这两种病原体中的任何一种定植的个体相比，在气道中同时感染金 黄色 葡萄球菌和 铜绿假单 胞菌的 pwCF 的肺功能更差9。

据推测，CF 病原体之间的种间相互作用是利用 CF 疗法不容易根除基于多微生物生物膜的感染，最终影响患者预后的原因3。支持这一点的是，体外研究表明，铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌等微生物之间的相互作用会影响临床相关表型，例如对一线 CF 药物（包括万古霉素和妥布霉素）的 Abx 反应性 6,10,11。因此，在混合物种感染的情况下重新审视旨在根除 CF 病原体的当前治疗策略仍有待实现。

管理基于微生物的 CF 肺部感染的金标准在很大程度上依赖于使用抗菌药物敏感性试验 （AST） 来指导临床干预12。然而，AST 通常是使用在丰富且混合良好的培养物中生长的细菌单一培养物来完成的，这并不能反映在 CF 气道中检测到的微生物生长条件 3,13。鉴于患者结果和治疗成功之间的重大脱节，临床报告现在倡导开发整合 CF 肺关键特征的新方法12,14。

很少有研究开发出包含两种以上病原体的 CF 相关细菌多物种体外系统15,16。然而，这些模型 （1） 并不完全反映 CF 肺的多微生物和生物膜样性质，并且 （2） 没有使用近似于 CF 气道中检测到的营养和环境条件15,16。通过挖掘大型 CF 肺衍生的 16S rRNA 基因数据集和计算，Jean-Pierre 及其同事最近开发了一种整合了上述特征的体外共培养模型10。该系统包括在 CF 气道样条件下生长的铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、链球菌属和普雷沃氏菌属，可稳定长达 14 天。作者还报告了普雷沃氏菌属的群落特异性生长以及这些 CF 病原体的 Abx 反应性通过仍有待确定的机制的几种变化10。这种易于处理的体外系统还提供了深入研究与 pwCF10 气道中经常检测到的铜绿假单胞菌常见变体的 Abx 顽固性相关的机械重点问题的可能性。因此，该协议的目标是为 CF 研究界提供标准化的实验工作流程，以培养具有进一步扩展潜力以解决许多 CF 相关问题所需的体外生物膜。

研究方案

所有试剂和设备的详细信息均列在 材料表中。

1. 制备人工痰液培养基

注意:在整个协议中，人工痰液培养基 （ASM） 定义为从 SCFM2 修饰的 CF 相关培养基，之前由 Turner 及其同事17 发表。以下是准备此培养基的步骤说明。请参阅 材料表 以制作库存溶液和储存条件。此版本的 ASM 与 Turner 等人17 不同，因为原始版本中的缓冲能力不允许随时间保持稳定的 pH 值。也就是说， 链球菌 属和厌氧菌（如 普雷沃菌 属）进行的发酵活动会导致生长培养基酸化（未发表的观察结果）。因此，3-吗啉代丙烷-1-磺酸 （MOPS） 浓度已从 10 mM 调整到 100 mM。

注:制备 2x ASM 碱 （ASMb） 储备液有助于添加粘蛋白、琼脂、水等组分，而不会影响 ASM 中存在的分子的最终浓度10,18。2x ASMb 可以提前制备并在 4 °C 下在黑暗处储存长达两周。如果培养基变黄，请丢弃。

  1. 要制备 2x ASM 基础油，请在含有 400 mL diH2O 的干净烧杯中，一边搅拌一边添加以下内容:
    1. 加入 6.50 mL 的 0.2 M NaH2PO4。H2O 股票;6.25 mL 的 0.2 M Na2HPO4 原液;348 μL 1 M KNO3 储备液;1.084 mL 的 0.25 M K2SO4 储备液。
    2. 加入 4.0 g 不含色氨酸的酵母合成辍学;3.032 克氯化钠;20.92 克 MOPS;1.116 克 KCl 和 0.124 克 NH4Cl。
    3. 加入 9.30 mL 的 1 M L-乳酸原液;2.70 mL 的 1.1 M 葡萄糖原液;1.75 mL 1 M CaCl2.2H 2O 储备液;1.20 mL 的 0.25 M N-乙酰氨基葡萄糖原液和 1.00 mL 的 3.6 mM FeSO4.7H 2O 原液。
    4. 加入 660 μL 的 0.1 M 色氨酸原液;606 μL 1 M MgCl2.6H 2O 储备液;来自鲱鱼精子的 0.60 克脱氧核糖核酸;400 μL 250 mg/mL 1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱 （DOPC） 储备液。
    5. 添加所有组分后，用 5 M NaOH 储备液将 pH 值调节至 6.80。使用 diH2O 完成至 500 mL。使用 0.22 μm 过滤器消毒，并在 4 °C 下储存。
  2. 要制备 10 mg/mL （2x） 粘蛋白原液，请使用含有 250 mL diH2O 的干净玻璃瓶，并在搅拌时:
    1. 添加 5.0 克猪胃粘蛋白 - II 型。将悬浮液混合 10 分钟。用 diH2O 完成 500 mL。
    2. 通过在 121 °C 下高压灭菌 15 分钟进行灭菌。保持在 4 °C 直至使用。
  3. 重新构建 ASM。
    注意:此步骤需要在实验当天进行。
    1. 将 2x ASMb 原液和 10 mg/mL 粘蛋白原液的体积比为 1:1 混合。
    2. 使用前彻底涡旋。

2. 制备多微生物群落选择性培养基

注意: 以下是制备 1 L 培养基所需的数量。

  1. 要制备甘露醇盐琼脂 （MSA） 和 假单胞菌 分离琼脂 （PIA），请遵循制造商的说明。
  2. 要在干净的玻璃瓶中制备 普雷沃氏菌 选择性琼脂 （PSA），请添加以下内容:
    1. 30.0 克胰蛋白酶大豆汤 （TSB）。琼脂 15.0 克。5.00 克酵母提取物。0.50 克 L-半胱氨酸盐酸盐。
    2. 10.0 mL 0.5 mg/mL 血红素原液。100 μL 10 mg/mL 甲萘醌储备液。
    3. 加入 940 mL diH2O 并搅拌。通过在 121 °C 下高压灭菌 15 分钟进行灭菌。
    4. 冷却后（即可以赤手拿着瓶子），边搅拌边加入:50.0 mL 去裂羊血。2.00 mL 50 mg/mL 卡那霉素原液。150 μL 50 mg/mL 万古霉素储备液。500 μL 10 mg/mL 多粘菌素 B 储备液。
  3. 要在干净的玻璃瓶中制备 链球菌 选择性琼脂 （SSA），请添加以下内容:
    1. 30.0 克 TSB。琼脂 15.0 克。
    2. 加入 950 mL diH2O 并搅拌。通过在 121 °C 下高压灭菌 15 分钟进行灭菌。
    3. 冷却后（即可以赤手拿着瓶子），边搅拌边加入:50.0 mL 去裂羊血。1.00 mL 10 mg/mL 多粘菌素 B 储备液。1.00 mL 10 mg/mL 氧代油酸原液。
      注意:倒入板中，在 4 °C 下最多保存 1 个月。使用前，让板在室温下干燥，最多提前 24 小时进行接种。PSA 已通过 P. melaninogenica 和 Prevotella intermedia 进行验证。SSA 已通过 S. sanguinis 和 Streptococcus milleri 组（Streptococcus constellatus、Streptococcus intermedius 和 Streptococcus anginosus，表示为 SMG）进行了验证。如果要测试新菌株，强烈建议从头验证这些选择性培养基。

3. 细菌液体培养基制备和生长条件

  1. 要常规培养 铜绿假单 胞菌和 金黄色葡萄球菌，请使用无菌丰富的培养基（例如，溶原肉汤 （LB） 或 TSB）。
    1. 通过在 37 °C 下挑选先前在 LB/TSB 琼脂平板上生长的单个菌落 20-24 小时，开始液体过夜。
    2. 将肉汤培养物在 37 °C 下生长过夜，以 250 rpm 振荡 16-18 小时。
  2. 要培养 链球菌 属，请使用补充有 0.5% 酵母提取物 （THB-YE） 的无菌 Todd Hewitt 肉汤。
    1. 从先前在补充有 5% 去纤维羊血（血琼脂板）的 TSB 琼脂平板上生长的单个菌落开始液体培养过夜，在 37 °C + 5% CO2 下培养 24 小时。
    2. 将THB-YE培养物厌氧或在37°C + 5%CO2 下生长过夜，不摇晃18-22小时。
  3. 要培养 普雷沃氏菌 属，请将以下内容添加到干净的瓶子中，制备 1 L 普雷沃氏菌 生长培养基 （PGM）:
    1. 30.0 克 TSB。5.00 克酵母提取物。0.50 克 L-半胱氨酸盐酸盐。10.0 mL 0.5 mg/mL 血红素原液和 100 μL 10 mg/mL 甲萘醌原液。
    2. 加入 990 mL diH2O. 通过在 121 °C 高压灭菌 15 分钟进行消毒。用铝箔包裹瓶子以保护其避光。
    3. 在血琼脂平板上培养 普雷沃菌 属菌落，在37°C厌氧孵育48小时。
    4. 在 PGM 中接种单个菌落并生长过夜，无需在 37 °C 下厌氧摇动 24 小时。
      注意:PGM 可在室温下保存长达两周。强烈建议在使用前对每种生长培养基进行无菌测试。如果不使用厌氧室，则可能需要从一小块菌落开始对 Prevotella spp. 进行液体过夜。

4. 共培养实验准备

注意: 图 1 描述了一个总结的实验工作流程。如果准备时间少于 1 小时，则可以在含氧条件下进行设置实验。如果预计需要更长的时间，强烈建议使用厌氧室（含 10% CO2、10% H2 和 80% N2 混合气体）进行实验。厌氧罐也可用于孵育实验样品。

  1. 单一培养和共培养的制备
    注:在室温下以 10,000 x g 的速度进行 2 分钟的离心步骤。对于共培养物，在接种 96 孔板之前混合细菌样品。通常，从过夜培养物中收集 1 mL 体积 的铜绿假单 胞菌和 金黄色葡萄球菌 菌株。对于 链球菌 属和 普雷沃菌 属，过夜体积可能在 2-4 mL 之间变化。这些体积可以根据要测试的条件数量进行调整。
    1. 使用来自过夜培养物的细菌液体，执行以下步骤:
      1. 对于 铜绿假单 胞菌和 金黄色葡萄球菌 菌株，使用无菌磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 洗涤两次。
      2. 对于 链球菌 属和 普雷沃氏菌 属，用无菌 PBS 洗涤一次。
        注意:使用移液器小心丢弃上清液，因为沉淀很容易丢失。
      3. 洗涤后，将每个沉淀重悬于 1 mL 的 1x 水稀释的 ASMb 中。
      4. 在无菌 PBS 中对每个样品进行 1:10 稀释，并测量 OD600。
      5. 在 ASM 中将所有培养物调整为 OD600 为 0.2。
      6. 使用 OD600 = 0.2 悬浮液，在 ASM 中将细菌样品稀释至最终 OD600 为 0.01（对于每种微生物），用于单一培养和共培养。
      7. 彻底涡旋 5 秒。
        注:例如，要制备总共 1 mL 铜 绿假单 胞菌单培养 ASM 悬浮液，OD600 = 0.01，将 50 μL 铜 绿假单 胞菌以 OD600 = 0.2 的体积添加到 950 μL 的 ASM 中。对于共培养，取 50 μL 铜 绿假单胞菌、 金黄色葡萄球菌、 链球菌 属和 普雷沃氏菌 属悬浮液，OD600 = 0.2，加入 800 μL ASM 中。
      8. 使用移液器，在无菌塑料平底 96 孔板的三个独立孔中加入 100 μl 单一培养和共培养悬浮液。
      9. 在缺氧条件下，将板（不摇晃）在 37 °C 下孵育 24 小时。
        注意:这里也可以使用其他氧张力（例如，微氧、常氧）。然而，该模型已经在缺氧条件下开发和验证。通过连续稀释单体和共培养细菌悬浮液来确认起始接种物，并强烈建议在 PIA、MSA、SSA 和 PSA 上接种。每种细菌的目标起始浓度为 1 × 107 CFU/mL（铜绿假单胞菌）、3.5 ×10 6 CFU/mL（金黄色葡萄球菌）、1.2 × 106 CFU/mL（链球菌 属）和 4.6 × 106 CFU/mL（普雷沃菌 属）。细菌接种物也可以被修饰，正如 Jean-Pierre 及其同事所描述的 10。
  2. 生物膜形成后更换培养基。
    1. 孵育 24 小时后，使用多通道移液器抽吸去除未附着的（浮游）细胞。
    2. 用 100 μL 新鲜 ASM 或所需的处理剂（例如抗生素、代谢物等）补充预先形成的生物膜。
    3. 在缺氧条件下，将板在 37 °C 下再孵育 24 小时。
      注意:如果快速执行（即少于 1 分钟），这些步骤可以通过有氧方式完成。否则，请使用厌氧室。

5. 收集和电镀样品

  1. 额外孵育 24 小时后，用多通道移液器吸出未附着的（浮游）细胞。
    注:浮游组分可以保留、连续稀释并接种在选择性培养基上或丢弃。
  2. 使用 125 μL 无菌 PBS 轻轻洗涤生物膜两次，然后丢弃体积。
  3. 加入 50 μL 无菌 PBS，并使用 96 针复制器轻轻地从板中刮下细胞，以分离生物膜。
  4. 将重悬的生物膜细胞转移到新的无菌 96 孔板的 A 行。
    注:96 孔板的 B 行至 H 行中将包含无菌 PBS。
  5. 对浮游生物（如果需要）和生物膜组分进行 10 倍连续稀释。
  6. 将 3-5 μL 每种稀释样品接种到 PIA、MSA、SSA 和 PSA 上。
  7. 让接种点干燥。

6. 孵育选择性板和菌落形成单位 （CFU） 计数

  1. 对于 铜绿假单 胞菌和 金黄色葡萄球菌，在 37 °C 下孵育 18-20 小时。
  2. 对于 链球菌 属，在缺氧条件下于 37 °C 孵育 24 小时。
  3. 对于 Prevotella spp，在 37 °C 的缺氧条件下孵育 48 小时。
  4. 孵育后，对菌落进行计数（每个点 ~10-35 个）并计算每 mL 的 CFU。
  5. 使用可视化工具绘制数据。

结果

如图 2 所示，报告了几种表型，包括 （1） 与单一培养相比，混合浮游生物群落生长时铜 绿假 单胞菌和 金黄色 葡萄球菌活细胞计数减少，（2） 血红葡萄球菌 细胞的多微生物生长增加，以及 （3） Jean-Pierre 及其同事之前报道的产 黑单 胞菌的混合群落生长10。

此外，如图

讨论

这种临床知情的体外共培养系统的有用性在于其检测多微生物特异性细菌功能的能力。也就是说，通过利用该模型，我们报道了微生物表型，从普雷沃氏菌属的群落特异性生长（图 2）到对铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和血葡萄球菌的一线 CF Abx 的敏感性变化（图 3）。此外，尽管

披露声明

作者声明不披露任何内容。

致谢

我们要感谢 George A. O'Toole 博士和 Thomas H. Hampton 博士在 体外 多微生物群落模型的设计和开发中发挥的重要作用。我们感谢 Sophie Robitaille 博士对手稿的有益评论。这项工作得到了囊性纤维化基金会 JEAN21F0 F.J-P 的资助。手稿的 图 1 是使用 BioRender 创建的。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)Fisher ScientificNC0387928Prepare a 250 mg/mL stock in chloroform directly in the bottle. Keep at -20°C. Final concentration 200 μg/mL in 2x ASM base.
3-morpholinopropane-1-sulfonic acid (MOPS)SigmaM1254Final concentration 200 mM in 2X ASM base.
96-pin replicatorFisher Scientific05-450-9Disposable replicators can also be used. Cat #NC1567338.
96-well sterile standard plate with lidFisher Scientific62406-081
AgarFisher ScientificDF0145-17-0
AnaeroPack 2.5 L Rectangular JarFisher Scientific23-246-385
CaCl2*2H2O Fisher ScientificC79-500Prepare a 1 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Final concentration 3.5 mM in 2x ASM base.
Defribrinated sheep's bloodTo prepare growth plates for Streptococcus and Prevotella.
Deoxyribonucleic acid from herring spermSigmaD7290Final concentration 1.2 mg/mL in 2x ASM base.
FeSO4*7H2O Fisher ScientificAA1449830Prepare a 1 mg/mL stock (3.6 mM) in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Keep wrapped in aluminum foil. Final concentration 0.0072 mM in 2x ASM base.
GasPaksFisher ScientificB260678
GlucoseFisher ScientificD16-3Prepare as a 20% stock (1.1 M) in water and sterilize by autoclave. Final concentration 6 mM in 2x ASM base.
HeminSigma51280Dissolve 100 mg of hemin in 2 mL of 1 M NaOH and then bring up volume to 200 mL with water. Store in an amber bottle or a regular bottle wrapped with aluminum foil at 4 °C.
K2SO4Fisher ScientificP304-500Prepare a 0.25 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Final concentration 0.54 mM in 2x ASM base.
KanamycinPrepare a 50 mg/mL stock solution in water. Filter sterilize with a 0.22 μm filter and store at 4 °C.
KClFisher ScientificP217-500Final concentration 30.0 mM in 2x ASM base.
KNO3Fisher ScientificP263-500Prepare a 1 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Final concentration 0.70 mM in 2x ASM base.
L-cysteine hydrochlorideFisher ScientificAAA1038922
L-Lactic acid SigmaL1750Prepare a 1 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. pH adjust to 7.0. Final concentration 18.6 mM in 2x ASM base.
L-TryptophanSigmaT0254Prepare a 0.1 M stock in 0.2 M NaOH and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Keep refrigerated at 4 °C wrapped in aluminum foil. Final concentration 0.132 mM in 2x ASM base.
Mannitol Salt AgarFisher ScientificB11407Prepare using manufacturer's recommendations.
MenadioneSigmaM5625Prepare a 10 mg/mL stock solution dissolved in 96-100% ethanol. Conserve at 4 °C wrapped in aluminium foil. Vortex before use.
MgCl2*6H2O Fisher ScientificAA12288A9Prepare a 1 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Final concentration 1.21 mM in 2x ASM base.
Mucin from porcine stomach - Type II SigmaM2378Prepare a 10 mg/mL (2x) stock in water; mix thoroughly before autoclaving. Keep at 4 °C.
Na2HPO4Fisher ScientificS375-500Prepare a 0.2 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Final concentration 2.5 mM in 2x ASM base.
N-acetylglucosamine SigmaA8625Prepare a 0.25 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Keep stock refrigerated at 4 °C. Final concentration 0.6 mM in 2x ASM base.
NaClFisher ScientificS271-500Final concentration 103.7 mM in 2x ASM base.
NaH2PO4*H2OFisher ScientificS369-500Prepare a 0.2 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Final concentration 2.6 mM in 2x ASM base.
NaOHFisher ScientificS318-500Prepare a 5 M stock solution. Use to adjust pH of 2x ASM base stock.
NH4ClFisher ScientificA661-500Final concentration 4.6 mM in 2x ASM base.
Oxolinic acidPrepare a 10 mg/mL stock solution 0.5 M NaOH. Filter sterilize with a 0.22 μm filter and store at 4 °C.
Polymixin BPrepare a 10 mg/mL stock solution in water. Filter sterilize with a 0.22 μm filter and store at 4 °C.
Pseudomonas Isolation AgarFisher ScientificDF0927-17-1Prepare using manufacturer's recommendations.
Todd Hewitt BrothFisher ScientificDF0492-17-6Prepare using manufacturer's recommendations.
Tryptic Soy BrothFisher ScientificDF0370-17-3Prepare using manufacturer's recommendations.
VancomycinPrepare a 50 mg/mL stock solution in water. Filter sterilize with a 0.22 μm filter and store at 4 °C.
Yeast ExtractFisher ScientificB11929
Yeast Synthetic Dropout without Tryptophan SigmaY1876Final concentration 8.0 mg/mL in 2x ASM base.

参考文献

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