Cultivo de una biopelícula polimicrobiana relevante para la fibrosis quística para sondear los fenotipos de la comunidad

Resumen

Este protocolo describe un modelo de biopelícula polimicrobiana de cuatro especies relevante para los pulmones con fibrosis quística (FQ) que se puede utilizar para explorar el impacto de las interacciones bacterianas entre especies.

Resumen

La mayoría de los modelos in vitro carecen de la capacidad de investigar completamente los fenotipos bacterianos que emergen de las complejas interacciones observadas en entornos de la vida real. Esto es particularmente cierto en el contexto de infecciones difíciles de tratar, crónicas y polimicrobianas basadas en biopelículas detectadas en las vías respiratorias de personas que viven con fibrosis quística (FQ), una enfermedad genética multiorgánica. Si bien múltiples estudios de microbioma han definido las composiciones microbianas detectadas en las vías respiratorias de las personas con FQ (pwCF), hasta ahora ningún modelo in vitro ha integrado completamente las características pulmonares críticas relevantes para la FQ. Por lo tanto, existe una importante laguna de conocimiento en la capacidad de investigar los mecanismos que impulsan la patogénesis de las infecciones pulmonares por FQ de especies mixtas. Aquí, describimos un modelo de comunidad microbiana de cuatro especies desarrollado recientemente, que incluye Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus sanguinis y Prevotella melaninogenica cultivadas en condiciones similares a la FQ. A través de la utilización de este sistema, se observaron y exploraron a nivel molecular fenotipos clínicamente relevantes, como la recalcitrancia antimicrobiana de varios patógenos. La utilidad de este modelo in vitro reside en su flujo de trabajo estandarizado que puede facilitar el estudio de las interacciones entre especies en el contexto de las infecciones pulmonares crónicas por FQ.

Introducción

Las estrategias destinadas a erradicar los microbios causantes de enfermedades, como los detectados en las vías respiratorias de la fibrosis quística (FQ), una enfermedad genética multiorgánica, a menudo fracasan¹. Es decir, la presencia de comunidades microbianas resistentes similares a biopelículas que crecen en el entorno pulmonar rico en moco de la FQ puede causar infecciones crónicas que abarcan^{varias décadas.} Además, aunque la utilización de antimicrobianos de primera línea (Abx) y moduladores ha dado lugar a mejores resultados en las personas con FQ (pwCF), el enfoque clínico de "un insecto, una infección" que se emplea normalmente contra los patógenos canónicos de la FQ, como Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus, ha sido ineficaz para resolver las infecciones difíciles de tratar detectadas en los pulmones de estos individuos ^{3,4. 5,6,7}.

En las últimas dos décadas, múltiples estudios han cambiado nuestra comprensión de la enfermedad pulmonar crónica por FQ⁸. Es decir, los informes indican que las infecciones detectadas en las vías respiratorias de las pcCF no son causadas únicamente por un solo patógeno, sino que son de naturaleza polimicrobiana⁸. Además, aunque la patogenia de las infecciones pulmonares por FQ de especies mixtas es todavía poco conocida, la evidencia clínica muestra que las pwCF coinfectadas con S. aureus y P. aeruginosa en sus vías respiratorias tienen una función pulmonar peor que los individuos colonizados por cualquiera de estos dos patógenos⁹.

Se plantea la hipótesis de que las interacciones entre especies entre los patógenos de la FQ son una razón por la que las infecciones basadas en biopelículas polimicrobianas no se erradican fácilmente mediante la utilización de terapias para la FQ, lo que en última instancia repercute en los resultados de los pacientes³. En apoyo de esto, los estudios in vitro han demostrado que las interacciones entre microbios como P. aeruginosa, S. aureus y otros pueden afectar fenotipos clínicamente relevantes, como la respuesta de Abx a los medicamentos de primera línea para la FQ, incluida la vancomicina y la tobramicina ^6,10,11. Por lo tanto, aún no se ha logrado revisar las estrategias de tratamiento actuales destinadas a erradicar los patógenos de la FQ en el contexto de infecciones de especies mixtas.

El estándar de oro en el tratamiento de las infecciones pulmonares por FQ de base microbiana depende en gran medida de la utilización de pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos (AST) para guiar las intervenciones clínicas¹². Sin embargo, la AST se realiza típicamente utilizando monocultivos bacterianos cultivados en cultivos ricos y bien mezclados, lo que no refleja las condiciones de crecimiento microbiano detectadas en las vías respiratorias de FQ ^3,13. Dada la importante desconexión entre los resultados de los pacientes y el éxito del tratamiento, los informes clínicos abogan ahora por el desarrollo de nuevos enfoques que integren las características críticas del pulmón con FQ^12,14.

Pocos estudios han desarrollado sistemas bacterianos multiespecie in vitro relevantes para la FQ que contienen más de dos patógenos^15,16. Sin embargo, estos modelos (1) no reflejan completamente la naturaleza polimicrobiana y biofilmística del pulmón con FQ y (2) no utilizan condiciones nutricionales y ambientales que se aproximen a las detectadas en la vía aérea de FQ^15,16. A través de la minería de grandes conjuntos de datos y computación de genes de ARNr 16S derivados de CF-pulmón, Jean-Pierre y sus colegas desarrollaron recientemente un modelo de cocultivo in vitro que integra las características mencionadas anteriormente¹⁰. Este sistema incluye P. aeruginosa, S. aureus, Streptococcus spp. y Prevotella spp. cultivados en condiciones similares a las vías respiratorias de FQ y estables hasta por 14 días. Los autores también informaron sobre el crecimiento específico de la comunidad de Prevotella spp. y varios cambios en la capacidad de respuesta Abx de estos patógenos de FQ a través de mecanismos que aún no se han identificado¹⁰. Este sistema in vitro tratable también ofrecía la posibilidad de profundizar en cuestiones de enfoque mecánico relacionadas con la recalcitrancia de Abx de una variante común de P. aeruginosa frecuentemente detectada en las vías respiratorias de pwCF¹⁰. Por lo tanto, el objetivo de este protocolo es proporcionar a la comunidad de investigación de la FQ un flujo de trabajo experimental estandarizado para cultivar una biopelícula in vitro que tenga el potencial de expandirse aún más para abordar una serie de preguntas relevantes para la FQ.

Protocolo

Los detalles de todos los reactivos y equipos se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación del medio de esputo artificial

NOTA: A lo largo de este protocolo, el medio de esputo artificial (ASM) se define como el medio relevante para la FQ modificado de SCFM2, publicado previamente por Turner y colegas¹⁷. A continuación se muestra una descripción de los pasos para preparar este medio. Consulte la Tabla de Materiales para realizar soluciones de stock y condiciones de almacenamiento. Esta versión de ASM difiere de Turner et ^al.17 en que la capacidad de amortiguación de la versión original no permite un pH estable en el tiempo. Es decir, la actividad de fermentación llevada a cabo por Streptococcus spp. y anaerobios como Prevotella spp. resulta en la acidificación del medio de crecimiento (observaciones no publicadas). Por lo tanto, la concentración de ácido 3-morfolinopropano-1-sulfónico (MOPS) se ha ajustado de 10 mM a 100 mM.

NOTA: La preparación de una solución madre base de ASM 2x (ASMb) facilita la adición de componentes como mucina, agar, agua, etc., sin afectar la concentración final de moléculas presentes en ASM^10,18. El 2x ASMb puede prepararse con antelación y almacenarse a 4 °C durante un máximo de dos semanas en un lugar oscuro. Si el medio se vuelve amarillo, deséchelo.

1. Para preparar 2 bases de MAPE, en un vaso de precipitados limpio que contenga 400 ml de diH₂O, añada lo siguiente mientras remueve:
   1. Añadir 6,50 mL de un 0,2 M NaH₂PO₄. Stock H₂O; 6,25 mL de una culata de 0,2 M Na₂HPO₄ ; 348 μL de una culata KNO₃ de 1 M; 1.084 mL de una culata K₂SO₄ de 0.25 M.
   2. Añadir 4,0 g de Levadura puntera sintética sin Triptófano; 3.032 g de NaCl; 20,92 g de fregonas; 1,116 g de KCl y 0,124 g de NH₄Cl.
   3. Añadir 9,30 mL de un caldo de ácido L-láctico de 1 M; 2,70 mL de un stock de glucosa de 1,1 M; 1,75 mL de una culata de CaCl_{1 M 2,2H 2}O; 1,20 mL de un stock de N-acetilglucosamina de 0,25 M y 1,00 mL de un stock de FeSO_{4,7H 2}O de 3,6 mM.
   4. Añadir 660 μL de un caldo de triptófano de 0,1 M; 606 μL de una culata de 1 M MgCl_{2,6H 2}O; 0,60 g de ácido desoxirribonucleico procedente de esperma de arenque; 400 μL de una cepa de 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC) de 250 mg/mL.
   5. Una vez añadidos todos los componentes, ajustar el pH a 6,80 con un caldo de NaOH de 5 M. Completar hasta 500 mL con diH₂O. Esterilizar con un filtro de 0,22 μm y almacenar a 4 °C.
2. Para preparar un caldo de mucina de 10 mg/mL (2x), utilice un frasco de vidrio limpio que contenga 250 mL de_diH2O y mientras revuelve:
   1. Añadir 5,0 g de mucina de estómago porcino - Tipo II. Mezcla la suspensión durante 10 min. Completo hasta 500 mL con diH₂O.
   2. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 min. Mantener a 4 °C hasta su utilización.
3. Reconstituir la MAPE.
   NOTA: Este paso debe realizarse el día del experimento.
   1. Mezcle una proporción de volumen de 1:1 de la calada ASMb 2x y la calada de mucina de 10 mg/mL.
   2. Vortex a fondo antes de usar.

2. Preparación de medios selectivos polimicrobianos para la comunidad

NOTA: A continuación se muestran las cantidades necesarias para preparar un volumen de 1 L de medio.

1. Para preparar agar sal de manitol (MSA) y agar de aislamiento de Pseudomonas (PIA), siga las instrucciones del fabricante.
2. Para preparar Prevotella Agar Selectivo (PSA), en una botella de vidrio limpia, agregue lo siguiente:
   1. 30,0 g de caldo de soja tríptico (TSB). 15,0 g de agar. 5,00 g de extracto de levadura. 0,50 g de clorhidrato de L-cisteína.
   2. 10,0 mL de un caldo de hemina de 0,5 mg/mL. 100 μL de un caldo de menadiona de 10 mg/mL.
   3. Añadir 940 mL de diH₂O y remover. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 min.
   4. Cuando se enfríe (es decir, el frasco se puede sostener con las manos desnudas), agregue mientras revuelve: 50.0 mL de sangre de oveja desfribrinada. 2,00 mL de un stock de kanamicina de 50 mg/mL. 150 μL de un caldo de vancomicina de 50 mg/mL. 500 μL de un caldo de polimixina B de 10 mg/mL.
3. Para preparar Streptococcus Selective Agar (SSA), en una botella de vidrio limpia, agregue lo siguiente:
   1. 30,0 g de TSB. 15,0 g de agar.
   2. Añadir 950 mL de diH₂O y remover. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 min.
   3. Cuando se enfríe (es decir, el frasco se puede sostener con las manos desnudas), agregue mientras revuelve: 50.0 mL de sangre de oveja desfribrinada. 1,00 mL de un caldo de polimixina B de 10 mg/mL. 1,00 mL de un caldo de ácido oxolínico de 10 mg/mL.
      NOTA: Verter en platos y mantener a 4 °C durante un máximo de 1 mes. Antes de usar, deje que las placas se sequen a temperatura ambiente hasta 24 horas antes de inocularlas. El PSA ha sido validado con P. melaninogenica y Prevotella intermedia. La SSA ha sido validada con S. sanguinis y el grupo Streptococcus milleri (Streptococcus constellatus, Streptococcus intermedius y Streptococcus anginosus, denotado como SMG). Se recomienda encarecidamente validar de novo estos medios selectivos si se van a ensayar nuevas cepas.

3. Preparación de medios líquidos bacterianos y condiciones de crecimiento

1. Para cultivar rutinariamente P. aeruginosa y S. aureus, use un medio rico estéril (por ejemplo, caldo de lisogenia (LB) o TSB).
   1. Comience a tomar líquido durante la noche eligiendo una sola colonia previamente cultivada en una placa de agar LB / TSB durante 20-24 h a 37 ° C.
   2. Cultivar los cultivos de caldo a 37 °C durante la noche con agitación a 250 rpm durante 16-18 h.
2. Para cultivar Streptococcus spp., utilice un caldo estéril Todd Hewitt complementado con un 0,5 % de extracto de levadura (THB-YE).
   1. Iniciar el cultivo líquido durante la noche a partir de una sola colonia previamente cultivada en una placa de agar TSB suplementada con un 5% de sangre de oveja desfibrinada (placa de agar sangre) durante 24 h a 37 °C + 5% de CO₂.
   2. Cultive los cultivos de THB-YE anaeróbicamente o a 37 °C + 5% CO₂ durante la noche sin agitar durante 18-22 h.
3. Para cultivar Prevotella spp., prepare 1 L de medio de crecimiento de Prevotella (PGM) agregando lo siguiente a una botella limpia:
   1. 30,0 g de TSB. 5,00 g de extracto de levadura. 0,50 g de clorhidrato de L-cisteína. 10,0 mL de un caldo de hemina de 0,5 mg/mL y 100 μL de un caldo de menadiona de 10 mg/mL.
   2. Añadir 990 mL de diH₂O. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 min. Envuelve la botella en papel de aluminio para protegerla de la luz.
   3. Cultivar colonias de Prevotella spp. en una placa de agar sangre incubada anaeróbicamente a 37 °C durante 48 h.
   4. Inocular una sola colonia en PGM y crecer durante la noche sin agitar a 37 °C anaeróbicamente durante 24 h.
      NOTA: El PGM se puede mantener a temperatura ambiente hasta por dos semanas. Se recomienda encarecidamente realizar pruebas de esterilidad en cada medio de crecimiento antes de su uso. Si no se utiliza una cámara anaeróbica, puede ser necesario iniciar las noches líquidas de Prevotella spp. desde un parche de colonias.

4. Preparación del experimento de cocultivo

NOTA: En la Figura 1 se muestra un flujo de trabajo experimental resumido. La configuración del experimento se puede realizar en condiciones óxicas si el tiempo de preparación es inferior a 1 h. Si se espera que tome más tiempo que eso, se recomienda encarecidamente realizar el experimento utilizando una cámara anaeróbica (con 10% de CO₂, 10% de H₂ y 80% de gas mezclado N₂ ). También se pueden utilizar frascos anaeróbicos para incubar las muestras experimentales.

1. Preparación de los monocultivos y cocultivos
   NOTA: Realice todos los pasos de centrifugación a 10.000 x g durante 2 min a temperatura ambiente. Para los cocultivos, mezcle las muestras bacterianas justo antes de inocular las placas de 96 pocillos. Por lo general, se recolecta un volumen de 1 mL para las cepas de P. aeruginosa y S. aureus de los cultivos nocturnos. Para Streptococcus spp. y Prevotella spp., los volúmenes durante la noche pueden variar entre 2-4 mL. Estos volúmenes se pueden ajustar en función del número de condiciones que se vayan a probar.
   1. Usando el líquido bacteriano de los cultivos nocturnos, realice los siguientes pasos:
      1. En el caso de las cepas de P. aeruginosa y S. aureus , lávese dos veces con solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS).
      2. Para Streptococcus spp. y Prevotella spp., lavar una vez con PBS estéril.
         NOTA: Utilice una pipeta para desechar cuidadosamente los sobrenadantes, ya que los gránulos pueden perderse fácilmente.
      3. Después de los lavados, vuelva a suspender cada pellet en 1 ml de 1x ASMb diluido en agua.
      4. Realice una dilución 1:10 de cada muestra en PBS estéril y mida el OD₆₀₀.
      5. Ajuste todos los cultivos a un OD₆₀₀ de 0,2 en ASM.
      6. Utilizando las suspensiones OD₆₀₀ = 0,2, diluir en ASM las muestras bacterianas hasta una DO final₆₀₀ de 0,01 (para cada microbio) para los monocultivos y cocultivos.
      7. Vórtice a fondo durante 5 s.
         NOTA: Por ejemplo, para preparar un total de 1 mL de suspensión de monocultivo de ASM de P. aeruginosa a DO₆₀₀ = 0,01, agregue 50 μL de P. aeruginosa a DE₆₀₀ = 0,2 a un volumen de 950 μL de MAPE. Para el cocultivo, tomar 50 μL de cada suspensión de P. aeruginosa, S. aureus, Streptococcus spp. y Prevotella spp. a un DO₆₀₀ = 0,2 y añadir hasta 800 μL de ASM.
      8. Con una pipeta, agregue 100 μl de las suspensiones de monocultivo y cocultivo en tres pocillos separados de una placa de plástico estéril de fondo plano de 96 pocillos.
      9. Incubar la placa (sin agitar) durante 24 h a 37 °C en condiciones anóxicas.
         NOTA: Otras tensiones de oxígeno (por ejemplo, microxia, normoxia) también se pueden utilizar aquí. Sin embargo, el modelo ha sido desarrollado y validado con condiciones anóxicas. Confirme los inóculos de inicio diluyendo en serie las suspensiones bacterianas mono y de cocultivo, y se recomienda encarecidamente la siembra de placas en PIA, MSA, SSA y PSA. La concentración inicial prevista para cada especie bacteriana es de 1 × 10⁷ UFC/mL (P. aeruginosa), 3,5 × 10⁶ UFC/mL (S. aureus), 1,2 × 10⁶ UFC/mL (Streptococcus spp.) y 4,6 × 10⁶ UFC/mL (Prevotella spp.). Los inóculos bacterianos también pueden ser modificados, como lo describieron Jean-Pierre y colaboradores¹⁰.
2. Reemplace el medio después de la formación de la biopelícula.
   1. Después de 24 h de incubación, extraiga las células no adheridas (planctónicas) por aspiración con una pipeta multicanal.
   2. Reponga las biopelículas preformadas con 100 μL de ASM fresco o el tratamiento deseado (por ejemplo, antibióticos, metabolitos, etc.).
   3. Incubar la placa durante 24 h adicionales a 37 °C en condiciones anóxicas.
      NOTA: Estos pasos se pueden realizar aeróbicamente si se realizan rápidamente (es decir, menos de 1 min). De lo contrario, utilice una cámara anaeróbica.

5. Recolección y colocación de las muestras

1. Después de las 24 h adicionales de incubación, aspire las células no adheridas (planctónicas) con una pipeta multicanal.
   NOTA: La fracción planctónica puede conservarse, diluirse en serie y platearse en medios selectivos o desecharse.
2. Lave suavemente las biopelículas dos veces con 125 μL de PBS estéril y deseche los volúmenes.
3. Agregue 50 μL de PBS estéril y separe las biopelículas raspando suavemente las células de la placa con un replicador de 96 pines.
4. Transfiera las células de biopelícula resuspendidas a la fila A de una nueva placa estéril de 96 pocillos.
   NOTA: La placa de 96 pocillos contendrá PBS estéril en las filas B a H.
5. Realice una dilución en serie 10 veces de las fracciones planctónicas (si es necesario) y de biopelícula.
6. Coloque 3-5 μL de cada muestra de dilución en PIA, MSA, SSA y PSA.
7. Deje que las manchas de inoculación se sequen.

6. Incubación de las placas selectivas y recuento de unidades formadoras de colonias (UFC)

1. Para P. aeruginosa y S. aureus, incubar a 37 °C durante 18-20 h.
2. En el caso de Streptococcus spp, incubar a 37 °C en condiciones anóxicas durante 24 h.
3. En el caso de Prevotella spp, incubar a 37 °C en condiciones anóxicas durante 48 h.
4. Después de la incubación, cuente las colonias (~ 10-35 por punto) y calcule la UFC por mL.
5. Trace los datos con una herramienta de visualización.

Resultados

Como se representa en la Figura 2, se informaron varios fenotipos, incluyendo (1) una reducción en el número de recuentos de células viables de P. aeruginosa y S. aureus cuando se cultivaron en comunidades planctónicas mixtas en comparación con el monocultivo, (2) un aumento en el crecimiento polimicrobiano de células de S. sanguinis y, (3) crecimiento de comunidades mixtas de P. melaninogenica como se informó previ...

Discusión

La utilidad de este sistema de cocultivo in vitro clínicamente informado reside en su capacidad para detectar funciones bacterianas específicas de polimicrobianos. Es decir, a través de la utilización de este modelo hemos reportado fenotipos microbianos que van desde el crecimiento específico de la comunidad de Prevotella spp. (Figura 2) hasta cambios en la susceptibilidad a la CF Abx de primera línea de P. aeruginosa, S....

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)	Fisher Scientific	NC0387928	Prepare a 250 mg/mL stock in chloroform directly in the bottle. Keep at -20°C. Final concentration 200 μg/mL in 2x ASM base.
3-morpholinopropane-1-sulfonic acid (MOPS)	Sigma	M1254	Final concentration 200 mM in 2X ASM base.
96-pin replicator	Fisher Scientific	05-450-9	Disposable replicators can also be used. Cat #NC1567338.
96-well sterile standard plate with lid	Fisher Scientific	62406-081
Agar	Fisher Scientific	DF0145-17-0
AnaeroPack 2.5 L Rectangular Jar	Fisher Scientific	23-246-385
CaCl2*2H2O	Fisher Scientific	C79-500	Prepare a 1 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Final concentration 3.5 mM in 2x ASM base.
Defribrinated sheep's blood			To prepare growth plates for Streptococcus and Prevotella.
Deoxyribonucleic acid from herring sperm	Sigma	D7290	Final concentration 1.2 mg/mL in 2x ASM base.
FeSO4*7H2O	Fisher Scientific	AA1449830	Prepare a 1 mg/mL stock (3.6 mM) in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Keep wrapped in aluminum foil. Final concentration 0.0072 mM in 2x ASM base.
GasPaks	Fisher Scientific	B260678
Glucose	Fisher Scientific	D16-3	Prepare as a 20% stock (1.1 M) in water and sterilize by autoclave. Final concentration 6 mM in 2x ASM base.
Hemin	Sigma	51280	Dissolve 100 mg of hemin in 2 mL of 1 M NaOH and then bring up volume to 200 mL with water. Store in an amber bottle or a regular bottle wrapped with aluminum foil at 4 °C.
K2SO4	Fisher Scientific	P304-500	Prepare a 0.25 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Final concentration 0.54 mM in 2x ASM base.
Kanamycin			Prepare a 50 mg/mL stock solution in water. Filter sterilize with a 0.22 μm filter and store at 4 °C.
KCl	Fisher Scientific	P217-500	Final concentration 30.0 mM in 2x ASM base.
KNO3	Fisher Scientific	P263-500	Prepare a 1 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Final concentration 0.70 mM in 2x ASM base.
L-cysteine hydrochloride	Fisher Scientific	AAA1038922
L-Lactic acid	Sigma	L1750	Prepare a 1 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. pH adjust to 7.0. Final concentration 18.6 mM in 2x ASM base.
L-Tryptophan	Sigma	T0254	Prepare a 0.1 M stock in 0.2 M NaOH and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Keep refrigerated at 4 °C wrapped in aluminum foil. Final concentration 0.132 mM in 2x ASM base.
Mannitol Salt Agar	Fisher Scientific	B11407	Prepare using manufacturer's recommendations.
Menadione	Sigma	M5625	Prepare a 10 mg/mL stock solution dissolved in 96-100% ethanol. Conserve at 4 °C wrapped in aluminium foil. Vortex before use.
MgCl2*6H2O	Fisher Scientific	AA12288A9	Prepare a 1 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Final concentration 1.21 mM in 2x ASM base.
Mucin from porcine stomach - Type II	Sigma	M2378	Prepare a 10 mg/mL (2x) stock in water; mix thoroughly before autoclaving. Keep at 4 °C.
Na2HPO4	Fisher Scientific	S375-500	Prepare a 0.2 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Final concentration 2.5 mM in 2x ASM base.
N-acetylglucosamine	Sigma	A8625	Prepare a 0.25 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Keep stock refrigerated at 4 °C. Final concentration 0.6 mM in 2x ASM base.
NaCl	Fisher Scientific	S271-500	Final concentration 103.7 mM in 2x ASM base.
NaH2PO4*H2O	Fisher Scientific	S369-500	Prepare a 0.2 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Final concentration 2.6 mM in 2x ASM base.
NaOH	Fisher Scientific	S318-500	Prepare a 5 M stock solution. Use to adjust pH of 2x ASM base stock.
NH4Cl	Fisher Scientific	A661-500	Final concentration 4.6 mM in 2x ASM base.
Oxolinic acid			Prepare a 10 mg/mL stock solution 0.5 M NaOH. Filter sterilize with a 0.22 μm filter and store at 4 °C.
Polymixin B			Prepare a 10 mg/mL stock solution in water. Filter sterilize with a 0.22 μm filter and store at 4 °C.
Pseudomonas Isolation Agar	Fisher Scientific	DF0927-17-1	Prepare using manufacturer's recommendations.
Todd Hewitt Broth	Fisher Scientific	DF0492-17-6	Prepare using manufacturer's recommendations.
Tryptic Soy Broth	Fisher Scientific	DF0370-17-3	Prepare using manufacturer's recommendations.
Vancomycin			Prepare a 50 mg/mL stock solution in water. Filter sterilize with a 0.22 μm filter and store at 4 °C.
Yeast Extract	Fisher Scientific	B11929
Yeast Synthetic Dropout without Tryptophan	Sigma	Y1876	Final concentration 8.0 mg/mL in 2x ASM base.