Crescita di un biofilm polimicrobico rilevante per la fibrosi cistica per sondare i fenotipi della comunità

Riepilogo

Questo protocollo descrive un modello di biofilm polimicrobico a quattro specie rilevante per la fibrosi cistica (FC) polmonare che può essere utilizzato per esplorare l'impatto delle interazioni batteriche interspecie.

Abstract

La maggior parte dei modelli in vitro non ha la capacità di sondare completamente i fenotipi batterici che emergono dalle complesse interazioni osservate in ambienti di vita reale. Ciò è particolarmente vero nel contesto di infezioni croniche e polimicrobiche difficili da trattare, rilevate nelle vie aeree di individui affetti da fibrosi cistica (FC), una malattia genetica multiorgano. Sebbene diversi studi sul microbioma abbiano definito le composizioni microbiche rilevate nelle vie aeree delle persone con FC (pwCF), finora nessun modello in vitro ha completamente integrato le caratteristiche polmonari critiche rilevanti per la FC. Pertanto, esiste una significativa lacuna di conoscenza nella capacità di studiare i meccanismi che guidano la patogenesi delle infezioni polmonari da FC di specie miste. Qui, descriviamo un modello di comunità microbica di quattro specie recentemente sviluppato, tra cui Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus sanguinis e Prevotella melaninogenica cresciuti in condizioni simili alla FC. Attraverso l'utilizzo di questo sistema, sono stati osservati ed esplorati fenotipi clinicamente rilevanti come la recalcitranza antimicrobica di diversi patogeni a livello molecolare. L'utilità di questo modello in vitro risiede nel suo flusso di lavoro standardizzato che può facilitare lo studio delle interazioni interspecie nel contesto delle infezioni polmonari croniche da FC.

Introduzione

Le strategie volte a sradicare i microbi che causano malattie come quelli rilevati nelle vie aeree della fibrosi cistica (FC), una malattia genetica multiorgano, spesso falliscono¹. Cioè, la presenza di comunità microbiche resilienti simili al biofilm che crescono nell'ambiente polmonare della FC ricco di muco può causare infezioni croniche che si estendono per più decenni². Inoltre, sebbene l'utilizzo di antimicrobici di prima linea (Abx) e modulatori abbia portato a risultati migliori nelle persone con FC (pwCF), l'approccio clinico "un bug, un'infezione" tipicamente impiegato contro i patogeni canonici della FC come Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus è stato inefficace nel risolvere le infezioni difficili da trattare rilevate nei polmoni di questi individui ^{3,4, 5,6,7}.

Negli ultimi due decenni, diversi studi hanno cambiato la nostra comprensione della malattia polmonare cronica^{FC 8}. Cioè, i rapporti indicano che le infezioni rilevate nelle vie aeree di pwCF non sono causate esclusivamente da un singolo agente patogeno, ma sono piuttosto di natura polimicrobica⁸. Inoltre, sebbene la patogenesi delle infezioni polmonari da FC di specie miste sia ancora poco conosciuta, l'evidenza clinica mostra che le pwCF che sono co-infettate sia da S. aureus che da P. aeruginosa nelle loro vie aeree hanno peggiorato la funzione polmonare rispetto agli individui colonizzati da uno di questi due patogeni⁹.

Si ipotizza che le interazioni interspecie tra i patogeni della FC siano una delle ragioni per cui le infezioni polimicrobiche basate sul biofilm non vengono prontamente sradicate attraverso l'utilizzo di terapie per la FC, influenzando in ultima analisi gli esiti dei pazienti³. A sostegno di ciò, studi in vitro hanno dimostrato che le interazioni tra microbi come P. aeruginosa, S. aureus e altri possono avere un impatto su fenotipi clinicamente rilevanti come la risposta Abx ai farmaci FC di prima linea, tra cui vancomicina e tobramicina ^6,10,11. Pertanto, resta da riesaminare le attuali strategie di trattamento volte a eradicare i patogeni della FC nel contesto delle infezioni da specie miste.

Il gold standard nella gestione delle infezioni polmonari da FC su base microbica si basa fortemente sull'utilizzo dei test di suscettibilità antimicrobica (AST) per guidare gli interventi clinici¹². Tuttavia, l'AST viene tipicamente eseguita utilizzando monocolture batteriche coltivate in colture ricche e ben miscelate, il che non riflette le condizioni di crescita microbica rilevate nelle vie aeree FC ^3,13. Data la significativa discrepanza tra gli esiti dei pazienti e il successo del trattamento, i rapporti clinici ora sostengono lo sviluppo di nuovi approcci che integrino le caratteristiche critiche del polmone FC^12,14.

Pochi studi hanno sviluppato sistemi in vitro multispecie batteriche rilevanti per la FC contenenti più di due patogeni^15,16. Tuttavia, questi modelli (1) non riflettono interamente la natura polimicrobica e simile al biofilm del polmone FC e (2) non utilizzano condizioni nutrizionali e ambientali che si avvicinino a quelle rilevate nelle vie aeree FC^15,16. Attraverso l'estrazione di grandi set di dati e il calcolo del gene 16S rRNA derivato da CF-lung, Jean-Pierre e colleghi hanno recentemente sviluppato un modello di co-coltura in vitro che integra le caratteristiche sopra menzionate¹⁰. Questo sistema comprende P. aeruginosa, S. aureus, Streptococcus spp. e Prevotella spp. cresciuti in condizioni simili alle vie aeree FC e stabili fino a 14 giorni. Gli autori hanno anche riportato una crescita specifica della comunità di Prevotella spp. e diversi cambiamenti nella risposta Abx di questi patogeni FC attraverso meccanismi che rimangono da identificare¹⁰. Questo sistema trattabile in vitro ha anche offerto la possibilità di approfondire questioni focalizzate meccanicisticamente relative alla recalcitranza Abx di una variante comune di P. aeruginosa frequentemente rilevata nelle vie aeree di pwCF¹⁰. Pertanto, l'obiettivo di questo protocollo è quello di fornire alla comunità di ricerca sulla fibrosi cistica un flusso di lavoro sperimentale standardizzato per far crescere un biofilm in vitro che ha il potenziale per essere ulteriormente ampliato per affrontare una serie di domande rilevanti per la fibrosi cistica.

Protocollo

I dettagli di tutti i reagenti e le attrezzature sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione del terreno di espettorato artificiale

NOTA: In tutto questo protocollo, il terreno di espettorato artificiale (ASM) è definito come il mezzo rilevante per la fibrosi cistica modificato da SCFM2, precedentemente pubblicato da Turner e colleghi¹⁷. Di seguito è riportata una descrizione dei passaggi per preparare questo mezzo. Vedere la tabella dei materiali per creare soluzioni di riserva e condizioni di conservazione. Questa versione di ASM differisce da Turner et al.,¹⁷ in quanto la capacità tampone nella versione originale non consente un pH stabile nel tempo. Cioè, l'attività fermentativa svolta da Streptococcus spp. e anaerobi come Prevotella spp. provoca l'acidificazione del terreno di coltura (osservazioni non pubblicate). Pertanto, la concentrazione di acido 3-morfolinopropano-1-solfonico (MOPS) è stata regolata da 10 mM a 100 mM.

NOTA: La preparazione di una soluzione madre di base ASM 2x (ASMb) facilita l'aggiunta di componenti come mucina, agar, acqua, ecc., senza influire sulla concentrazione finale di molecole presenti in ASM ^10,18. Il 2x ASMb può essere preparato in anticipo e conservato a 4 °C per un massimo di due settimane in un luogo buio. Se il mezzo diventa giallo, scartarlo.

1. Per preparare 2 brodi base ASM, in un becher pulito contenente 400 mL di diH₂O, aggiungere mescolando:
   1. Aggiungere 6,50 mL di 0,2 M NaH₂PO₄. H₂O calcio; 6,25 mL di un stock 0,2 M Na₂HPO₄ ; 348 μl di un stock KNO₃ da 1 M; 1,084 mL di un stock 0,25 M K₂SO₄ .
   2. Aggiungere 4,0 g di Lievito di Lievito sintetico dropout senza Triptofano; 3,032 g di NaCl; 20,92 g di MOPS; 1,116 g di KCl e 0,124 g di NH₄Cl.
   3. Aggiungere 9,30 ml di un brodo di acido L-lattico da 1 M; 2,70 mL di una scorta di glucosio da 1,1 M; 1,75 mL di un ceppo di CaCl_{2,2H 2}O da 1 M; 1,20 mL di una riserva di N-acetilglucosamina da 0,25 M e 1,00 mL di una riserva di FeSO _{4,7H 2}O da 3,6 mM.
   4. Aggiungere 660 μl di un stock di triptofano 0,1 M; 606 μL di un stock di 1 M MgCl 2.6H ₂O; 0,60 g di acido desossiribonucleico da spermatozoi di aringhe; 400 μL di una 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC) da 250 mg/mL.
   5. Una volta aggiunti tutti i componenti, regolare il pH a 6,80 con un stock di NaOH 5 M. Completare a 500 mL con diH₂O. Sterilizzare utilizzando un filtro da 0,22 μm e conservare a 4 °C.
2. Per preparare una scorta di mucina da 10 mg/mL (2x), utilizzare un flacone di vetro pulito contenente 250 mL di diH₂O e mescolando:
   1. Aggiungere 5,0 g di mucina dallo stomaco suino - Tipo II. Mescolare la sospensione per 10 min. Completare a 500 mL con diH₂O.
   2. Sterilizzare in autoclave a 121 °C per 15 min. Conservare a 4 °C fino al momento dell'utilizzo.
3. Ricostituire l'ASM.
   NOTA: Questo passaggio deve essere eseguito il giorno dell'esperimento.
   1. Miscelare un rapporto in volume 1:1 tra il brodo 2x ASMb e il brodo di mucina 10 mg/mL.
   2. Agitare accuratamente prima dell'uso.

2. Preparazione di terreni selettivi per comunità polimicrobiche

NOTA: Di seguito sono riportate le quantità necessarie per preparare un volume di 1 L di supporto.

1. Per preparare il Mannitol Salt Agar (MSA) e lo Pseudomonas Isolation Agar (PIA), seguire le istruzioni del produttore.
2. Per preparare l'agar selettivo Prevotella (PSA), in una bottiglia di vetro pulita, aggiungere quanto segue:
   1. 30,0 g di brodo di soia triptico (TSB). 15,0 g di agar. 5,00 g di estratto di lievito. 0,50 g di L-cisteina cloridrato.
   2. 10,0 mL di una stock di emina da 0,5 mg/mL. 100 μL di una stock di menadione da 10 mg/mL.
   3. Aggiungere 940 mL di diH₂O e mescolare. Sterilizzare in autoclave a 121 °C per 15 min.
   4. Una volta raffreddato (cioè la bottiglia può essere tenuta a mani nude), aggiungere mescolando: 50,0 ml di sangue di pecora defribrinato. 2,00 mL di una riserva di kanamicina da 50 mg/mL. 150 μL di una riserva di vancomicina da 50 mg/mL. 500 μL di polimixina B da 10 mg/mL.
3. Per preparare lo Streptococcus Selective Agar (SSA), in una bottiglia di vetro pulita, aggiungere quanto segue:
   1. 30,0 g di cucchiaino. 15,0 g di agar.
   2. Aggiungere 950 mL di diH₂O e mescolare. Sterilizzare in autoclave a 121 °C per 15 min.
   3. Una volta raffreddato (cioè la bottiglia può essere tenuta a mani nude), aggiungere mescolando: 50,0 ml di sangue di pecora defribrinato. 1,00 mL di una polimixina B da 10 mg/mL. 1,00 mL di una scorta di acido ossolinico da 10 mg/mL.
      NOTA: Versare nei piatti e conservare a 4 °C per un massimo di 1 mese. Prima dell'uso, lasciare asciugare le piastre a temperatura ambiente fino a 24 ore prima di essere inoculate. Il PSA è stato convalidato con P. melaninogenica e Prevotella intermedia. La SSA è stata convalidata con S. sanguinis e con il gruppo Streptococcus milleri (Streptococcus constellatus, Streptococcus intermedius e Streptococcus anginosus, indicato come SMG). Si raccomanda vivamente di convalidare de novo questi terreni selettivi se si vogliono testare nuovi ceppi.

3. Preparazione dei terreni liquidi batterici e condizioni di crescita

1. Per coltivare abitualmente P. aeruginosa e S. aureus, utilizzare un terreno sterile ricco (ad esempio, brodo di lisogenia (LB) o TSB).
   1. Iniziare la notte raccogliendo una singola colonia precedentemente coltivata su una piastra di agar LB/TSB per 20-24 ore a 37 °C.
   2. Far crescere i fermenti in brodo a 37 °C durante la notte con agitazione a 250 giri/min per 16-18 ore.
2. Per coltivare lo Streptococcus spp., utilizzare il brodo sterile Todd Hewitt integrato con estratto di lievito allo 0,5% (THB-YE).
   1. Iniziare la coltura liquida durante la notte da una singola colonia precedentemente coltivata su una piastra di agar TSB integrata con sangue di pecora defibrinato al 5% (piastra di agar sanguigno) per 24 ore a 37 °C + 5% di CO₂.
   2. Coltivare le colture THB-YE in modo anaerobico o a 37 °C + 5% CO₂ durante la notte senza agitare per 18-22 ore.
3. Per coltivare Prevotella spp., preparare 1 litro di terreno di coltura Prevotella (PGM) aggiungendo quanto segue a una bottiglia pulita:
   1. 30,0 g di cucchiaino. 5,00 g di estratto di lievito. 0,50 g di L-cisteina cloridrato. 10,0 mL di una scorta di emina da 0,5 mg/mL e 100 μL di una scorta di menadione da 10 mg/mL.
   2. Aggiungere 990 mL di diH₂O. Sterilizzare in autoclave a 121 °C per 15 min. Avvolgere la bottiglia in un foglio di alluminio per proteggerla dalla luce.
   3. Coltivare le colonie di Prevotella spp. su una piastra di agar sanguigno incubata anaerobicamente a 37 °C per 48 ore.
   4. Inoculare una singola colonia in PGM e crescere durante la notte senza agitare a 37 °C in modo anaerobico per 24 ore.
      NOTA: Il PGM può essere conservato a temperatura ambiente per un massimo di due settimane. Si consiglia vivamente di eseguire test di sterilità su ciascun terreno di coltura prima dell'uso. Se non si utilizza una camera anaerobica, potrebbe essere necessario iniziare durante la notte il liquido di Prevotella spp. da un appezzamento di colonie.

4. Preparazione dell'esperimento di co-coltura

NOTA: la Figura 1 illustra un flusso di lavoro sperimentale riassunto. L'impostazione dell'esperimento può essere eseguita in condizioni ossiche se il tempo di preparazione richiede meno di 1 ora. Se si prevede che durerà più tempo, si consiglia vivamente di eseguire l'esperimento utilizzando una camera anaerobica (con il 10% di CO₂, il 10% di H₂ e l'80% di N₂ di gas miscelato). I barattoli anaerobici possono essere utilizzati anche per incubare i campioni sperimentali.

1. Preparazione delle monocolture e co-colture
   NOTA: Eseguire tutte le fasi di centrifugazione a 10.000 x g per 2 minuti a temperatura ambiente. Per le co-colture, mescolare i campioni batterici appena prima di inoculare le piastre da 96 pozzetti. Tipicamente, un volume di 1 mL per i ceppi di P. aeruginosa e S. aureus viene raccolto dalle colture notturne. Per Streptococcus spp. e Prevotella spp., i volumi overnight possono variare tra 2-4 mL. Questi volumi possono essere regolati in base al numero di condizioni da testare.
   1. Utilizzando il liquido batterico delle colture notturne, eseguire i seguenti passaggi:
      1. Per i ceppi di P. aeruginosa e S. aureus , lavare due volte utilizzando soluzione fisiologica sterile tamponata con fosfato (PBS).
      2. Per Streptococcus spp. e Prevotella spp., lavare una volta con PBS sterile.
         NOTA: Utilizzare una pipetta per scartare con cura i surnatanti, poiché i pellet possono andare facilmente persi.
      3. Dopo i lavaggi, risospendere ogni pellet in 1 mL di 1x ASMb diluito in acqua.
      4. Effettuare una diluizione 1:10 di ciascun campione in PBS sterile e misurare l'OD₆₀₀.
      5. Regolare tutte le impostazioni cultura su un OD₆₀₀ di 0,2 in ASM.
      6. Utilizzando le sospensioni OD₆₀₀ = 0,2, diluire in ASM i campioni batterici fino a un OD_finale di 0,01 (per ogni microbo) per le monocolture e le co-colture.
      7. Agitare accuratamente per 5 s.
         NOTA: Ad esempio, per preparare un totale di 1 mL di sospensione ASM in monocoltura di P. aeruginosa a OD₆₀₀ = 0,01, aggiungere 50 μL di P. aeruginosa a OD₆₀₀ = 0,2 a un volume di 950 μL di ASM. Per la co-coltura, prelevare 50 μL di sospensioni di P. aeruginosa, S. aureus, Streptococcus spp. e Prevotella spp. con OD₆₀₀ = 0,2 e aggiungere 800 μL di ASM.
      8. Utilizzando una pipetta, aggiungere 100 μl di sospensioni di monocoltura e co-coltura in tre pozzetti separati di una piastra sterile di plastica a fondo piatto da 96 pozzetti.
      9. Incubare la piastra (senza agitare) per 24 ore a 37 °C in condizioni anossiche.
         NOTA: Qui possono essere utilizzate anche altre tensioni di ossigeno (ad es. microxia, normossia). Tuttavia, il modello è stato sviluppato e convalidato con condizioni anossiche. Confermare l'inoculo iniziale diluendo in serie le sospensioni batteriche mono e co-colture e si consiglia vivamente di placcare su PIA, MSA, SSA e PSA. La concentrazione iniziale target per ciascuna specie batterica è di 1 × 10⁷ UFC/mL (P. aeruginosa), 3,5 × 10⁶ UFC/mL (S. aureus), 1,2 × 10⁶ UFC/mL (Streptococcus spp.) e 4,6 × 10⁶ UFC/mL (Prevotella spp.). Anche gli inoculi batterici possono essere modificati, come descritto da Jean-Pierre e colleghi¹⁰.
2. Sostituire il terreno dopo la formazione del biofilm.
   1. Dopo 24 ore di incubazione, rimuovere le cellule non attaccate (planctoniche) mediante aspirazione utilizzando una pipetta multicanale.
   2. Reintegrare i biofilm preformati con 100 μL di ASM fresco o del trattamento desiderato (ad es. antibiotici, metaboliti, ecc.).
   3. Incubare la piastra per altre 24 ore a 37 °C in condizioni anossiche.
      NOTA: Questi passaggi possono essere eseguiti in modo aerobico se eseguiti rapidamente (cioè meno di 1 minuto). In caso contrario, utilizzare una camera anaerobica.

5. Raccolta e impiattamento dei campioni

1. Dopo le ulteriori 24 ore di incubazione, aspirare le cellule non attaccate (planctoniche) con una pipetta multicanale.
   NOTA: La frazione planctonica può essere conservata, diluita in serie e placcata su terreni selettivi o scartata.
2. Lavare delicatamente i biofilm due volte utilizzando 125 μL di PBS sterile ed eliminare i volumi.
3. Aggiungere 50 μl di PBS sterile e staccare i biofilm raschiando delicatamente le cellule dalla piastra utilizzando un replicatore a 96 pin.
4. Trasferire le cellule del biofilm risospese nella fila A di una nuova piastra sterile a 96 pozzetti.
   NOTA: La piastra a 96 pozzetti conterrà PBS sterile nelle file da B a H.
5. Eseguire una diluizione seriale 10x delle frazioni planctonica (se necessario) e del biofilm.
6. Piastra 3-5 μl di ciascun campione di diluizione su PIA, MSA, SSA e PSA.
7. Lasciare asciugare i punti di inoculazione.

6. Incubazione delle piastre selettive e conteggio delle unità formanti colonie (CFU)

1. Per P. aeruginosa e S. aureus, incubare a 37 °C per 18-20 h.
2. Per Streptococcus spp, incubare a 37 °C in condizioni anossiche per 24 ore.
3. Per Prevotella spp, incubare a 37 °C in condizioni anossiche per 48 ore.
4. Dopo l'incubazione, contare le colonie (~10-35 per spot) e calcolare le CFU per mL.
5. Tracciare i dati utilizzando uno strumento di visualizzazione.

Risultati

Come rappresentato nella Figura 2, sono stati riportati diversi fenotipi, tra cui (1) una riduzione del numero di cellule vitali di P. aeruginosa e S. aureus quando cresciute in comunità planctoniche miste rispetto alla monocoltura, (2) un aumento della crescita polimicrobica delle cellule di S. sanguinis e, (3) una crescita di comunità miste di P. melaninogenica come precedentemente riportato da Jean-Pierre e colleghi

Discussione

L'utilità di questo sistema di co-coltura in vitro clinicamente informato risiede nella sua capacità di rilevare funzioni batteriche specifiche del polimicrobico. Cioè, attraverso l'utilizzo di questo modello abbiamo riportato fenotipi microbici che vanno dalla crescita specifica della comunità di Prevotella spp. (Figura 2) ai cambiamenti nella suscettibilità alla FC Abx di prima linea di P. aeruginosa, S. aureus e

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)	Fisher Scientific	NC0387928	Prepare a 250 mg/mL stock in chloroform directly in the bottle. Keep at -20°C. Final concentration 200 μg/mL in 2x ASM base.
3-morpholinopropane-1-sulfonic acid (MOPS)	Sigma	M1254	Final concentration 200 mM in 2X ASM base.
96-pin replicator	Fisher Scientific	05-450-9	Disposable replicators can also be used. Cat #NC1567338.
96-well sterile standard plate with lid	Fisher Scientific	62406-081
Agar	Fisher Scientific	DF0145-17-0
AnaeroPack 2.5 L Rectangular Jar	Fisher Scientific	23-246-385
CaCl2*2H2O	Fisher Scientific	C79-500	Prepare a 1 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Final concentration 3.5 mM in 2x ASM base.
Defribrinated sheep's blood			To prepare growth plates for Streptococcus and Prevotella.
Deoxyribonucleic acid from herring sperm	Sigma	D7290	Final concentration 1.2 mg/mL in 2x ASM base.
FeSO4*7H2O	Fisher Scientific	AA1449830	Prepare a 1 mg/mL stock (3.6 mM) in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Keep wrapped in aluminum foil. Final concentration 0.0072 mM in 2x ASM base.
GasPaks	Fisher Scientific	B260678
Glucose	Fisher Scientific	D16-3	Prepare as a 20% stock (1.1 M) in water and sterilize by autoclave. Final concentration 6 mM in 2x ASM base.
Hemin	Sigma	51280	Dissolve 100 mg of hemin in 2 mL of 1 M NaOH and then bring up volume to 200 mL with water. Store in an amber bottle or a regular bottle wrapped with aluminum foil at 4 °C.
K2SO4	Fisher Scientific	P304-500	Prepare a 0.25 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Final concentration 0.54 mM in 2x ASM base.
Kanamycin			Prepare a 50 mg/mL stock solution in water. Filter sterilize with a 0.22 μm filter and store at 4 °C.
KCl	Fisher Scientific	P217-500	Final concentration 30.0 mM in 2x ASM base.
KNO3	Fisher Scientific	P263-500	Prepare a 1 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Final concentration 0.70 mM in 2x ASM base.
L-cysteine hydrochloride	Fisher Scientific	AAA1038922
L-Lactic acid	Sigma	L1750	Prepare a 1 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. pH adjust to 7.0. Final concentration 18.6 mM in 2x ASM base.
L-Tryptophan	Sigma	T0254	Prepare a 0.1 M stock in 0.2 M NaOH and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Keep refrigerated at 4 °C wrapped in aluminum foil. Final concentration 0.132 mM in 2x ASM base.
Mannitol Salt Agar	Fisher Scientific	B11407	Prepare using manufacturer's recommendations.
Menadione	Sigma	M5625	Prepare a 10 mg/mL stock solution dissolved in 96-100% ethanol. Conserve at 4 °C wrapped in aluminium foil. Vortex before use.
MgCl2*6H2O	Fisher Scientific	AA12288A9	Prepare a 1 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Final concentration 1.21 mM in 2x ASM base.
Mucin from porcine stomach - Type II	Sigma	M2378	Prepare a 10 mg/mL (2x) stock in water; mix thoroughly before autoclaving. Keep at 4 °C.
Na2HPO4	Fisher Scientific	S375-500	Prepare a 0.2 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Final concentration 2.5 mM in 2x ASM base.
N-acetylglucosamine	Sigma	A8625	Prepare a 0.25 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Keep stock refrigerated at 4 °C. Final concentration 0.6 mM in 2x ASM base.
NaCl	Fisher Scientific	S271-500	Final concentration 103.7 mM in 2x ASM base.
NaH2PO4*H2O	Fisher Scientific	S369-500	Prepare a 0.2 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Final concentration 2.6 mM in 2x ASM base.
NaOH	Fisher Scientific	S318-500	Prepare a 5 M stock solution. Use to adjust pH of 2x ASM base stock.
NH4Cl	Fisher Scientific	A661-500	Final concentration 4.6 mM in 2x ASM base.
Oxolinic acid			Prepare a 10 mg/mL stock solution 0.5 M NaOH. Filter sterilize with a 0.22 μm filter and store at 4 °C.
Polymixin B			Prepare a 10 mg/mL stock solution in water. Filter sterilize with a 0.22 μm filter and store at 4 °C.
Pseudomonas Isolation Agar	Fisher Scientific	DF0927-17-1	Prepare using manufacturer's recommendations.
Todd Hewitt Broth	Fisher Scientific	DF0492-17-6	Prepare using manufacturer's recommendations.
Tryptic Soy Broth	Fisher Scientific	DF0370-17-3	Prepare using manufacturer's recommendations.
Vancomycin			Prepare a 50 mg/mL stock solution in water. Filter sterilize with a 0.22 μm filter and store at 4 °C.
Yeast Extract	Fisher Scientific	B11929
Yeast Synthetic Dropout without Tryptophan	Sigma	Y1876	Final concentration 8.0 mg/mL in 2x ASM base.